低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

この技術の全体的な目標は、ドナー細胞を介した筋形成を促進するために、ドナー筋組織の小さなセグメントを宿主の筋肉に移植することです。この方法は、死後に採取された筋肉組織が宿主の筋肉のドナー細胞媒介性筋形成を促進できるかなど、再生筋肉生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、侵襲性が最小限であることです。

この技術の意味は、筋肉埋め込み、運動、免疫療法の組み合わせにより、特定の影響を受けた筋肉の再生能力を若返らせることができる可能性があるため、非致死性筋ジストロフィーの治療にまで及びます。理学療法士および生物医学エンジニアとして、MIME手順の低侵襲性が重要であると考えています。なぜなら、MIMEは筋原性細胞の供給源を提供するとともに、宿主の筋肉の構造と機能を過度に破壊することなく自然な組織の足場を提供するからです。その手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるMiss Morium Begamです。

まず、テキストプロトコルに記載されているように、12〜16週齢のC57ブラック6ドナーマウスを安楽死させます。手術用ハサミを使用して、後肢の前面の皮膚を開きます。TA筋を見つけたら、それを取り除くと、TA筋の後ろにあるEDL筋が可視化されます。

一対の鉗子の先端を筋肉の後ろにスライドさせ、つま先が伸びるかどうかを軽く引っ張って、筋肉がEDLであることを確認します。EDL筋を特定した後、約10センチメートルの長さの4-0シルクのセグメントを使用して、ガイド縫合糸を遠位腱と近位腱に結びます。筋肉の近位腱と遠位腱の縫合糸に2つのダブルノットを作ります。

遠位EDL腱を切断し、筋肉を反射させます。次に、近位腱を切って筋肉を解放します。採取したEDL筋をマウスリンガー溶液で満たされたシャーレに入れます。

テキストプロトコルに従って、8〜10週齢のオスのNSG-GFPホストマウスに麻酔をかけます。ワセリンを目になじませて乾燥を防ぎます。皮膚を準備するには、左後肢の前面に脱毛クリームを塗り、2分間そのままにしておきます。

PBSに浸したワイプを使用して、毛皮と一緒に脱毛クリームを取り除きます。肌をきれいにするには、ポビドンヨード溶液と70%エタノールを3回拭いて交互にこすります。宿主のTA筋に針路を作成するには、筋肉の長軸に沿って、筋肉の中心に手術針を通します。

針を頭尾方向に、TA筋の長さに沿って、筋肉の腹の中心を通るようにしてください。針の挿入後、ドナー組織の一方の端からガイド縫合糸を手術針の内腔を尾頭方向に通過させます。針を宿主筋から尾状頭側方向に引っ込めて、ドナー組織を針路に導きます。

ドナーEDL筋組織を宿主TA筋内に適切に配置し、ドナー筋の尾側端と頭側端にガイド縫合糸を使用します。ドナー組織を埋め込んだ後、ガイド縫合糸を切断し、先端の細かい鉗子で調整を行います。最後に、鉗子で創傷のへこみを閉じ、27ゲージの外科用針の先端で獣医組織接着剤を塗布することにより、針の傷を筋肉組織に密封します。

MIMEの後、50〜60マイクロリットルの1.2%塩化バリウムを、筋肉の長さに沿った3つの部位、筋肉腹の近位、中部、遠位の3分の1で宿主TA筋に注入します。注射後、宿主マウスの脚をエタノールで洗浄し、ワセリンの薄層を塗布して皮膚を保護します。マウスを寝具のない孤独な回復ケージに入れます。

等温ゲル加熱パッドは、マウスが加熱されていない半分に移動できるようにしながら、ホストマウスに熱サポートを提供するために、ケージの半分の下に配置する必要があります。回復が完了したら、マウスを元のケージに戻します。手術用ハサミを使用して、脚の前面の皮膚を開きます。

TA筋の位置を特定したら、その遠位腱を切断し、筋肉を反射させます。近位筋腱を切断してTA筋を解放します。左または治療された筋肉と右または制御TA筋肉の両方を収集します。

採取した筋肉を計量紙と体重計の上に置いて、筋肉を計量します。凍結保護のために、筋肉を鉱物油に短時間浸し、余分な油を拭き取ります。筋肉をスナップフリーズするには、筋肉をアルミホイルの上に置き、液体窒素で満たされたデュアルフラスコにすばやく浸します。

凍結したサンプルを標識された極低温バイアルに移します。ドナー組織を宿主の筋肉内に正確に埋め込むことは、MIMEの成功に不可欠です。3日後、ドナーのEDL筋は宿主のTA筋に埋め込まれたままで、宿主の筋肉に針の跡が残ります。

さらに、ドナーの筋肉の断面は、緑色の蛍光を示していません。一方、宿主の筋肉の断面はそうします。移植された筋肉の断面では、GFP陽性の殻筋線維とGFP陰性ドナー筋線維との間に明確な境界があります。

治療の14日後、すべての筋線維と未治療の筋肉はGFP陽性です。しかし、治療を受けた宿主の筋肉ではそうではありません。これらのGFPネガティブファイバーの多くは、レッドデスミン標識で生存することが示されています。

これは、MIMEがドナー細胞由来の筋形成につながることを示しています。TA筋にはキメラ筋線維が存在します。低から中程度の蛍光で検出され、宿主とドナーの筋原性細胞の融合から生じる可能性があります。

それらが宿主筋の全直径にわたって存在することは、ドナー筋原性細胞が筋肉内で数百ミクロン移動できることを示唆しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、15〜20分で完了します。このビデオを見た後、MIME技術を使用してドナー筋の一部を宿主の筋肉に埋め込む方法、およびドナー細胞を介した筋形成を促進する方法を十分に理解しているはずです。

MIME技術は、ヒトの死体筋が宿主マウスのドナー細胞を介した筋形成を促進できるかどうかを研究する道を開きます。また、神経筋の電気刺激がドナー細胞を介した筋形成を増強できるかどうかを評価するのにも役立ちます。この方法は、宿主動物に生検ヒトの筋肉を埋め込むことによるヒト疾患の動物モデルの生成や、筋原性細胞を含む筋肉組織模倣物が筋形成を促進できるかどうかの試験など、他のシステムにも適用できます。