Name: 細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶ細胞外小胞とエキソソームの分離法を用いて、間葉系乳腺上皮細胞から乳房管腔細胞へ乳腺形成能を伝達するメカニズム。この手法は幹細胞特性の再プログラミング研究に有用です。

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この研究は、国立健康研究所（05A1-CSPP16-014、HJL）および科学技術省（MOST 103-2320-B-400-015-MY3、HJL）からの助成金によって支えられた。

動物を含むすべての研究は、動物管理機関委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。 1.細胞外小胞/エキソソームの単離および検証<ol><li>培養乳房上皮基底細胞、NAMEC 4、500mLのMCDB170、pH7.4 + 500mLの重炭酸ナトリウム（0.2438％）を含むDMEM / F12からなる新鮮な無血清培地; EGF（5ng / mL）。ヒドロコルチゾン（0.5μg/ mL）;インスリン（5μg/ mL）。ウシ下垂体抽出物（BPE;35μg/ mL）;およびGW627368X（1μg/ mL）を15cmディッシュに入れた。 </li><li>血球計数器で細胞を計数した後、0日目に15cmディッシュあたり12mLの培地に1.2x10 6個の細胞を4日間播種する4 。 </li><li>培養4日後、卓上遠心分離機を用いて300 xgで5分間遠心します。上清をコニカルチューブに移す（ 図1 ）。 </li><li>上清を遠心分離する。卓上遠心分離機で2,000 xg、20分間。上清を超遠心分離チューブに移し、死んだ細胞と細胞破片を残す（ 図1 ）。 </li><li>上清を10,000 xgで30分間4℃で遠心分離します。上清を新しい超遠心チューブに移す（ 図1 ）。 </li><li>上清を110,000 xgで60分間4℃で遠心分離する。上清を除去し、EV /エキソソームペレットをPBS（ 図1 ）に再懸濁する。 </li><li>上清を110,000 xgで60分間4℃で遠心分離する。上清を除去する。 EV /エキソソームペレットをPBSに再懸濁する（ 図1 ）。 NAMEC条件培地240〜480mLから単離したペレットを100μLで再懸濁する。 </li><li> BC懸濁液のタンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイで測定する。濃度が約20〜40μg/ 100μLであることを確認してください。 -20℃での保存さらなる分析。 </li><li>先にGardiner らによって記載されているように、ナノ粒子追跡分析（NTA）によってEV /エキソソームの濃度およびサイズを測定する。 11 。 NTA分析のために、EV /エキソソーム（20μg/100μL）をPBSで10,000倍に希釈する。 注：NTA分析の結果は、分析された小胞の数およびサイズを反映する。 </li><li>以前にLin ら 4に記載されているように、透過電子顕微鏡（TEM）を用いてEV /エキソソームを画像化する。 </li></ol> 2.密度勾配を用いたエキソソーム精製<ol><li>ステップ1.7の110,000gペレットをPBS（2mL）中の40％（w / v）イオジキサノールに再懸濁する。 PBS（それぞれ2mL）中の30％、20％、10％、および5％（w / v）のイオジキサノールのアリコートを順番に混合し、超遠心チューブに密度勾配を形成する。 </li><li>混合物を200,000×gで4時間、8時間遠心分離する。 </li><li>各グラジエントフラクションを収集する（10フラクションons; 1mL /画分）をピペットでチューブの上部から取り出します。 </li><li> SDS-PAGE 12およびウェスタンブロットによって、各画分のエキソソームマーカー（ 例えば、 CD81、CD9、CD63およびTsg101）の存在を分析する。各画分の50μL懸濁液を0.1％（w / v）SDSを含む10％ゲルにロードし、タンパク質をゲル電気泳動で画分に分離する。 </li><li>タンパク質をゲルからPVDFメンブレンに移し、4℃で一晩エキソソームマーカー（ 例えば CD81、CD9、CD63、およびTsg101）およびハウスキーピングタンパク質GAPDH（ Table of Materials ）に対する抗体と膜をインキュベートする。 注：結果は、エキソソームを含有する画分を同定する。 </li></ol> 3.細胞外小胞/エキソソーム標識<ol><li>ステップ1.7で得られたEV /エキソソームを20μgのエキソソームタンパク質/100μLで10μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルジアセテートエステル（CFSE）に懸濁する。並列サンプルを準備する後のEV /エキソソーム取り込みアッセイのネガティブコントロールとして、同じ方法で処理されたCFSEおよびPBSのみを含む。混合物を37℃で30分間放置する。 </li><li> 50倍量のPBSにEV /エキソソームを懸濁し、4℃で60分間110,000×gで懸濁液を遠心分離する。上清を除去し、EV /エキソソームペレットをPBSで再懸濁する。ステップ3.2を1回繰り返します。 </li><li> EVs /エキソソームを20μgのエキソソームタンパク質/100μLの濃度でPBS中に懸濁させ、次にEVs /エキソソームを0.22μmの膜を通して濾過し、細胞にEV /エキソソームを添加する。 </li></ol> 4.細胞外小胞/エキソソーム取り込みアッセイ<ol><li>培養培地を作るために、500mLのMCDB170、pH7.4 + 500mLのDMEM / F12を重炭酸ナトリウム（0.2438％）と混合する。 EGF（5ng / mL）。ヒドロコルチゾン（0.5μg/ mL）;インスリン（5μg/ mL）。およびBPE（35μg/ mL） 4 。ヒトの乳房上皮HMLE細胞を6ウェルディッシュ（1×10 6細胞//細胞&gt; /ウェル）をEV /エキソソーム処理の1日前に投与する。ステップ3.3で得られた2μg/ mLのCFSE蛍光標識EV /エキソソームをHMLE細胞の培地に2〜6時間添加する。陰性対照群のHMLE細胞を、ステップ3.1で説明した平行調製物で処理する。 </li><li> 2〜6時間のインキュベーション後、室温で4mLのPBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 0.25％トリプシンで10分間細胞を分離し、0.2％FBSを含むPBS中で細胞を再懸濁する。蛍光細胞分析装置4を使用して、細胞内の蛍光強度からのEV /エキソソーム取り込みを測定する。共焦点顕微鏡法を用いてEV /エキソソームまたはネガティブコントロールで処理した細胞を画像化する。 注：細胞の緑色の蛍光は、EV /エキソソームの取り込みによって引き起こされます。顕微鏡の設定については、 図6の凡例を参照してください。 </li></ol>原発性マウス乳腺上皮細胞の単離<ol><li&gt; 0.1cmのゼラチン溶液12mlを10cmの皿に加えてゼラチン被覆皿を調製する。プレートを37℃のインキュベーターに30分間置く。ゼラチン溶液を除去し、ゼラチンコーティングが乾燥するまで4時間層流フード中で蓋を皿から離しておく。 </li><li>はさみを使用して12週齢の処女雌C57BL / 6マウスから2番、3番、4番、5番の乳腺（ 図2 ）を解剖し、剃刀を用いて小塊（2mm 2 ）に切る。 </li><li> 0.2％コラゲナーゼIV型、0.2％トリプシン、5％FBS、5μg/ mLゲンタマイシンを含有する50mLのDMEM / F12を用いて、乳腺のスラリー（10匹のマウスから）を37℃で60分間、120rpmで攪拌しながらさらに解離させる。 、および1x pen-strep。 </li><li> 350×gで10分間遠心分離することにより、混合物から上皮オルガノイドをペレット状にペレット化する。 </li><li> 0.1mg / mL DNase Iを含む4mLのDMEM / F12に上皮オルガノイドを室温で5分間懸濁する。 6mLのDMEM / F12を最終10mLの容量。 </li><li>懸濁液を室温で10分間400xgで遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li>ペレットを10mLのDMEM / F12に再懸濁する。サスペンションを遠心分離機に乗せるが、速度が400 x gに達するとブレーキが掛かる。上清を捨てる。 注：ブレーキを叩くことによって、上皮オルガノイドは速やかにペレット化されますが、線維芽細胞は単細胞として上清中に残ります。 </li><li>手順5.6と5.7を5〜7回繰り返します。血球計にサスペンションの一滴を加え、遠心分離の各ラウンド後に顕微鏡下でオルガノイド混合物から線維芽細胞のクリアランスをチェックする（ 図3 ）。 </li><li> 1x ITS、5％FBS、50μg/ mLゲンタマイシン、10ng / mL EGFおよび1xペン - ストレプを含有するDMEM / F12で、ステップ5.1で得られたゼラチンコートディッシュ中のオルガノイドを48時間培養する。 </li><li> 48時間後、FBSを含まない新鮮な培養培地で培地を置換することにより、培養中の浮遊細胞を除去する（1×ITS、50μg/ mLゲンタマイシン、10ng / mL EGF、および1×ペン - ストレプトマイシンを含むDMEM / F12）で洗浄した。 </li><li>乳房上皮細胞の単層が、付着した上皮オルガノイドから3日間で移動し、成長することを確認する。 </li></ol>原発性マウス基礎/管腔上乳腺上皮細胞の分離<ol><li> 3日間の培養後、20分間、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素活性を有する天然酵素混合物でマウス初代乳腺細胞を分離する。 PBS中の5％FBSで酵素活性を中和する。 </li><li>懸濁液を室温で10分間450xgで遠心分離し、上清を捨てる。細胞ペレットを5mg / mLディスパーゼに20分間再懸濁する。 PBS中の5％FBSで酵素活性を中和する。 </li><li>懸濁液を室温で10分間450xgで遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li>希釈して10 7細胞/ mLの濃度で0.2％FBSを含む100μLのPBSに細胞を再懸濁した抗CD49fおよび抗EpCAM抗体を氷上で暗所で1時間インキュベートした。 </li><li> PBSで細胞を洗浄し、暗所で30分間氷上でフルオロフォア結合二次抗体で細胞をインキュベートする。 </li><li> 0.2％FBSを含むPBS中で細胞を洗浄し、再懸濁する。 </li><li> EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞を細胞選別機4で選別する。 </li></ol> 7.細胞外小胞/エキソソーム処理<ol><li>ゼラチンでコートした6ウェルディッシュ（2×10 5細胞/ウェル）上に、ステップ6.7からの選別したEpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺細胞を播種し、PBSまたは2μg/ mL NAMEC由来EV /エキソソームで処理するステップ1.7で得られた。 </li><li>長期培養処理におけるEV /エキソソームの生物学的有効性を確実にするために、PBSまたは2μg/ mLのNAMEC由来のEV /エキソソームを含む新鮮な培地で2日ごとに細胞培養培地を交換する。マウスプリマを分割しないでください10日間の処置の間に細胞内の細胞を除去する。 </li></ol>乳腺上皮細胞の脂肪パッド注入<ol><li>イソフルラン2〜3％吸入剤を含む3週齢の雌性C57BL / 6マウスを麻酔する。 </li><li>麻酔したマウスをその背中に置く。中腹部の毛皮をカミソリ/ヘアクリームで取り除き、70％アルコールとポビドンヨードの3回の交互サイクルで手術部位をきれいにする。 </li><li>はさみで腹側胸骨 - 鼠径部に沿って皮膚を通して1.5cmの垂直切開を行い、次に右と左の第4乳房脂肪パッドを交互に露出させる。 </li><li>はさみで腺実質を取り除くことによって各脂肪パッドをきれいにする。リンパ節を脂肪パッドに置き、リンパ節の下の腺実質全体を除去する。 注記：脂肪パッドの3分の2はそのまま残してください。 </li><li>工程7.2から得られた細胞を、天然の酵素混合物（ 表の表を参照 ）でタンパク質分解性aコラーゲン分解酵素活性を10分間測定した。 PBS中の5％FBSで酵素活性を中和する。 </li><li>懸濁液を室温で10分間450xgで遠心分離し、上清を捨てる。血球計数器で細胞を計数し、15μLに所望の細胞用量（10 4 -10 2細胞/パッド）が含まれるような濃度のPBS中で細胞を懸濁させる。 </li><li>乳腺上皮細胞浮遊液15μLを、27G針に取り付けられた100μLガラスシリンジを用いて脂肪パッドに注入する。 </li><li>もう片方の脂肪パッドについては、手順8.4-8.7を繰り返します。 </li><li>創傷クリップで皮膚を閉じます。 </li></ol> 9.乳腺完全マウント<ol><li>細胞注入後8週間でCO 2 +頚部脱臼でマウスを安楽死させる（ステップ8.7）。 </li><li>はさみを使用して、胸骨領域から鼠径領域への皮膚層を垂直に切開し、次に右と左の両方を露出させる。大麻の脂肪パッド。第4乳腺を除去する（ 図2 ）。 </li><li>ガラス顕微鏡スライド上の脂肪パッドを広げ、室温で一晩、Kahle固定液（4％ホルムアルデヒド、30％EtOH、および2％氷酢酸）で脂肪パッドを固定する。 注意：Kahleの固定剤は刺激剤です。ケミカルフードでこの手順を実行します。 </li><li>ファットパッドを250mLの70％EtOHで15分間、次いで250mLのdH 2 Oで5分間洗浄する。ファットパッドをカルミンミョウバン（1gのカルミンおよび2.5gの硫酸アルミニウムカリウムを500mLのdH 2 O中に）で室温で一晩染色する。 </li><li>脂肪パッドを250mLの70％EtOHで15分間、250mLの95％EtOHで15分間、および250mLの100％EtOHで15分間洗浄する。 </li><li>ファットパッドが透明になったら、キシレンの脂肪パッドを数日間清掃し、キシレンインキュベーションを停止します。 注意：キシレンは刺激剤です。ケミカルフードでこの手順を実行します。 </li><li>スライドをマウントするデジタルスライドスキャナを使用して脂肪パッドの画像（2,400dpi）を撮影する。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

エキソソームは、それらを放出した細胞の特徴を有することが多く、放出されたエキソソームの量は、刺激によって誘発され得る4 。細胞の培養培地を回収し、EV /エキソソーム収集のための示差的超遠心分離に供することができる（ 図1 ）。現在のところ、EV /エキソソームを単離する理想的な方法に関する一般的な合意はない。ここで使用される最適な方法は、下流アプリケーション14によって決定されている。超遠心分離は、EV /エキソソームの生物学的活性を保存することができるEV /エキソソームの単離のための比較的速い方法である。しかしながら、超遠心分離によって単離された小胞は、一般に、エンドソーム区画を介して産生されるエキソソームおよび/または細胞膜からの出芽を介して産生される小胞を含むEVの混合物を含む。 小胞のサイズをNTAで分析することにより（ 図4A </strong&gt;）で...

エキソソームは細胞間の膜とサイトゾルタンパク質、脂質、RNAを伝達することで細胞間の伝達を媒介することができます1 。エキソソーム媒介性の伝達は、多くの生理学的および病理学的プロセス（ すなわち、抗原提示、寛容2の発生および腫瘍進行3 ）に関与することが実証されている。エキソソームはしばしば、それらを放出するソース細胞のものと同様の内容を有する。したがって、エキソソームは、供給源細胞から特定の細胞特性を運び、それらを摂取する細胞にこれらの特性を伝達することができる4 。 エキソソームは、50〜150nmの二重層膜ベシクルであり、特異的マーカー（ 例えば、 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix、およびTSG101）を提示する。したがって、エキソソームは、異なる側面のための様々な方法によって特徴付けられなければならない。透過電子顕微鏡法を用いて膜小胞を可視化することができる例えば、エキソソーム4,5 。精製されたエキソソームのサイズおよび数を測定するために、ナノ粒子追跡分析（NTA）および動的光散乱分析（DLS）が使用される。エキソソームの脂質膜含量は、密度勾配によって確認することができる。 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix、およびTSG101,6,7などのエキソソームマーカーは、ウェスタンブロッティングによって測定することができる。 乳房基底細胞は、脂肪パッドに移植されたとき乳腺を生成する能力を有するが、内腔細胞は8,9,10 であり得ない。従って、乳房基底細胞は、乳房再増殖単位とも呼ばれる。乳房基底および管腔細胞のモデルを用いることにより、EVs /エキソソームが異なる細胞集団間で細胞特性を伝達する能力を調べることができる。この作品乳房基底上皮細胞由来のEV /エキソソームを用いて乳腺上皮細胞から乳房内腔上皮細胞への腺形成能を伝達する方法を実証する。ルーメン乳房上皮細胞は、基底細胞から分泌されたEV /エキソソームの摂取後に基底細胞特性を獲得し、次に乳腺4を形成することができる。

<table><tbody><tr><td>MCDBの170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K 超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>ナノ粒子追跡分析 (NTA)</td></tr><tr><td>オプティプレップ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>水中のヨージキサノールの60%(w / v)溶液(滅菌)。</td></tr><tr><td>CD81</td>抗体<td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 >C、一晩&nbsp;</td></tr><tr><td>CD9</td>抗体<td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 &deg;C、一晩&nbsp;</td></tr><tr><td>CD63抗体</td><td></td><td>Abcam Ab59479</td><td>1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 &deg;C、一晩&nbsp;</td></tr><tr><td>TSG101 抗体</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1,000 含有 5% w/v 無脂粉乳、1x TBS、0.1% Tween 20 at 4 >C、一晩&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 >C、一晩&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルジアセテートエステル)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>蛍光細胞分析装置</td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV型&nbsp;</td><td>サーモ</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>サーモ</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>アキュターゼ</td>の混合物 <td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>タンパク質分解酵素活性およびコラーゲン分解酵素活性</td></tr>分散酵素活性分散酵素を含む天然酵素混合物<tr><td>&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7913</td><td>5 mg/mL = 5 U/mL</td></tr><tr><td>抗CD49f抗体</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>抗EpCAM抗体</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>cell sorter</td></tr><tr><td>carmine alum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>ヒト乳腺上皮細胞(HMLE細胞、NAMC)</td><td></td><td></td><td>ロバート・ワインバーグ博士からの贈り物</td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>ザイメセット&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocoritisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE(ウシ下垂体抽出物)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>ケイマン</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>15cmカルチャーディッシュ</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>遠心分離機3415R</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA プロテインアッセイ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td>日<td>立</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン&nbsp;</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>10cm培養皿</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>6ウェル培養皿</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>雌 C57BL/6 マウス</td><td>NLAC (国立動物実験動物センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>isofluorane&nbsp;</td><td>ハロカーボン</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>マクロン</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (エタノール)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アルミニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>キシレン&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m メンブレン</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP 創傷クリップ、9 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP 創傷クリップ Applier</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade;ディープレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>C10046</td><td>原形質膜染色</td></tr></tbody></table>

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

細胞は、エキソソームを介して、タンパク質、脂質、および核酸を含む約100nmの細胞外小胞（EV）と通信することができる。非接着/間葉系乳房上皮細胞（NAMEC）由来の細胞外小胞は、示差的超遠心分離によってNAMEC培地から単離することができる。それらの密度に基づいて、EVは110,000×gでの超遠心分離によって精製することができる。超遠心分離からのEV調製物は、可溶性タンパク質の混入を防ぐために連続密度勾配を用いてさらに分離することができる。次いで精製されたEVを、調製物中の小胞のサイズおよび数を測定するナノ粒子追跡分析を用いてさらに評価することができる。 50〜150nmの範囲の細胞外小胞はエキソソームである。 NAMEC由来のEV /エキソソームは、乳腺上皮細胞によって摂取され得、これは、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によって測定され得る。いくつかの乳腺幹細胞の特性（ 例えば、乳腺形成能）は、NAMEC由来EVs /エキソソームを介して、幹様NAMECから乳房上皮細胞に移され得る。単離された一次EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺細胞は、マウス脂肪パッドに移植された後、乳腺を形成することができず、EpCAM lo / CD49fは、移植後に乳腺を形成する。 EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞によるNAMEC由来EVs /エキソソームの取り込みは、脂肪パッドに移植された後に乳腺を発生させる。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞に乳腺形成能を伝達する。

PGE 2 / EP 4シグナル伝達を遮断することにより、乳房基底様幹細胞4からのEV /エキソソーム放出が誘発されることが示されているので、この研究は、誘発されたEV /エキソソームを乳房上皮基底細胞（NAMEC）培養から単離する方法を提示する。 NAMECは無血清培地で培養されるため、血清由来のEV /エキソソームは存在しない13 。血清含有培地で培養した細胞の場合、培地中の既存のエキソソームは、EV /エキソソーム5の収集のために培地を培養するために培地を使用する前に、110,000×gでの超遠心分離によって予め洗浄しなければならない。図1に示すように、4日間誘導したNAMEC条件培地からのEV /エキソソームを、示差的超遠心分離によって110,000×gペレットから単離することができる。単離された小胞の数およびサイズは110,000×gのペールナノ粒子追跡分析（NTA）を用いて...

このプロトコルは、非接着性/間葉性乳房上皮細胞からの細胞外小胞（EVs）/エキソソームの精製、定量化および特徴づけ方法、ならびにこれらを用いて乳腺上皮細胞に乳腺形成能を転移させる方法を記載する。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、この細胞特性をEV /エキソソームを摂取する細胞に移入することができる。

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

本手順の全体的な目的は、幹細胞から幹細胞性の転移を担う細胞外小胞およびエクソソームを単離すること、そして、これらのナノ粒子の幹細胞性転移能を評価することである。本手法は、幹細胞由来の転移が細胞によって行われるのか、あるいは小胞によって行われるのかという、幹細胞分野における重要な問いに答えることができる。または、エクソソームによって幹細胞の特性を非幹細胞に転移させることができます。この技術の主な利点は、誘導幹細胞が細胞間輸送小胞に由来することです。また、エクソソームを用いて非幹細胞を幹細胞へ直接リプログラミングすることが可能です。手順のデモンストレーションは、博士研究員のLeMonsierと、私の研究室の外科助手であるPei-Ling、Wen-Tin、Shih-Yinが行います。まず、15 cmディッシュ1枚あたり12 mLの培地を用い、1.2 × 10⁶個の非接着性/間葉系乳腺上皮細胞（NAMECs）を播種し、細胞培養インキュベーター内で4日間培養します。4日目に、卓上遠心分離用に培養液を回収します。次に、上清をコニカルチューブに移し、卓上遠心機で2回目の遠心分離を行います。続いて、上清を新しい超遠心管に移し、30分間超遠心分離を行います。遠心終了後、上清を別の新しい超遠心管に移し、再度超遠心分離を行います。上清を除去し、細胞外小胞エキソソームペレットをPBSで再懸濁して3回目の超遠心分離を行います。その後、ペレットを新鮮なPBSで再懸濁し、細胞粒子を最後に一度超遠心分離します。上清を除去し、細胞外小胞エキソソームペレットを100 µLのPBSで再懸濁します。次に、ビシンコニン酸法により、細胞外小胞懸濁液のタンパク質濃度を測定します。濃度は100 µLあたり約20～40 µgであるはずです。細胞外小胞およびエクソソームの濃度とサイズを測定するためには、細胞粒子をPBSを用いてタンパク質濃度が100 mLあたり2 µgになるまで希釈します。そして、ナノ粒子トラッキング分析により粒子を分析します。密度勾配法でエクソソームを精製するには、3回目の超遠心後、ペレットを2 mLの40% iodixanol含有PBSに再懸濁します。そして、細胞懸濁液の上に、30%、20%、10%、5% iodixanolをそれぞれ2 mLずつ順に重ねます。密度勾配超遠心分離法を用いて細胞画分を分離し、遠心分離終了後にピペットで10層の勾配層をそれぞれ回収します。次に、標準的なプロトコルに従い、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットを用いて、各画分におけるエクソソームマーカーの存在を解析します。その際、目的とする適切なエクソソームマーカーに対する抗体を使用してください。乳腺上皮細胞を細胞外小胞およびエクソソームで処理するため、まず、フローソートされたEPCAM高発現・CD49F低発現の管腔乳腺上皮細胞を、1プレートあたり2×10^5個、ゼラチンコートした6ウェルプレートに播種します。次に、各細胞培養系に2 μg/mLのNAMEC由来細胞外小胞およびエクソソームを添加して処理します。10日間にわたり、2日ごとに培養液を新鮮な細胞外小胞およびエクソソームを含むものに交換します。処置期間の終了後、麻酔をかけた3週齢の57 BL6雌マウスを仰向けに配置し、腹部中央の被毛を除去します。手術部位を70%アルコールとポビドンヨードで交互に3回消毒します。その後、腹部胸鼠径領域に沿って、皮膚を1.5 cm垂直に切開します。右側と左側の第4乳腺脂肪パッドを交互に露出させます。各脂肪パッド内のリンパ節を特定し、リンパ節より下方にある腺組織全体を摘出します。次に、プロダイアリティック活性およびコラーゲン分解活性を持つ天然酵素を用いて、細胞外小胞およびエクソソーム処理された乳管乳腺上皮細胞を分離します。10分後、5% FBS含有PBSを用いて酵素活性を中和します。遠心分離により細胞を回収し、上清を捨てます。細胞数をカウントした後、PBSを用いて細胞濃度を15 µLあたり1×10²〜1×10⁴個に希釈します。27ゲージの針を装着した100 µLガラス製マイクロシリンジを使用し、乳腺上皮細胞懸濁液15 µLを各脂肪パッドに注入します。その後、皮膚を創傷クリップで閉じます。注入から8週間後、胸部から鼠径部にかけて皮膚を垂直に切開し、左右両側の第4乳腺脂肪パッドを露出させます。第4乳腺を摘出し、脂肪パッドを個別のガラス顕微鏡スライドの上に広げます。次に、スライドを化学薬品用フードへ移し、コリーズ固定液を用いて室温で一晩固定します。翌朝、サンプルを250 mLの70%エタノールで15分間洗浄します。続いて、蒸留水 250 milliliters で5分間洗浄します。蒸留水による洗浄後、脂肪組織をカルミン・アラム液で室温にて一晩染色します。その後、エタノールを用いて15分ごとの段階的な脱水処理を行います。最後の脱水後、化学薬品用フード内で、脂肪組織が透明になるまでサンプルをキシレンに移します。次に、封入剤を用いてスライドを封入し、デジタルスライドスキャナーを用いて脂肪組織を2,400 dpiで撮像します。単離された小胞および超遠心分離プレートのサイズは、ナノ粒子トラッキング解析による測定で、通常は約100 nanometersです。さらに、NAMEC条件培地の超遠心分離分画を透過電子顕微鏡で解析した結果、大量の膜小胞が存在することが明らかになりました。前述した密度勾配分離の後、20%ヨードキサノール分画においてエクソソームマーカーが検出されました。CFSEラベル化したNAMEC由来の細胞外小胞およびエクソソームを処理したヒト乳管乳頭上皮細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、エクソソーム処理した培養細胞においてCFSEシグナルが10倍高くなっていました。乳腺上皮細胞によるCFSE標識細胞外小胞およびエクソソームの特異的な取り込みが示されています。さらに、陰性対照であるPBS処理乳腺上皮細胞ではCFSEシグナルが認められない一方で、エクソソーム処理細胞では共焦点顕微鏡により、NAMEC由来の細胞外小胞およびエクソソームの取り込みが確認できます。注目すべき点は、NAMEC由来の細胞外小胞およびエクソソームで10日間処理した、フローソート済みのepCAMhi/CD49Flo管腔乳腺上皮細胞を注射したマウスの脂肪体において、乳腺を形成する能力が獲得されたことです。この技術の開発により、幹細胞生物学分野の研究者は、再生医療および直接細胞リプログラミングにおける、幹細胞由来の分化細胞、小胞、およびエクソソームの利用に関する探索への道が開かれました。

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶ細胞外小胞とエキソソームの分離法を用いて、間葉系乳腺上皮細胞から乳房管腔細胞へ乳腺形成能を伝達するメカニズム。この手法は幹細胞特性の再プログラミング研究に有用です。

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

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