Name: 電気ショック療法のラットモデルにおける細胞数の推定のための光学分画器技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ光学分画器技術によるラット海馬の神経新生細胞数の正確な推定法。電気ショック療法後の新規ニューロン形成と生存率を定量化し、神経変性疾患治療戦略への応用可能性を示す。

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巧みな技術援助のためにSusanneSørensenに感謝します。この作品はVelux財団からの助成金によって支えられました。ジャシュカ財団。 AaseとEjnar Danielsens財団;ハートマンブラザーズ財団; Jacob Madsen監督とOlga Madsens妻の妻。ドクター・ソフィス・カール・エミール・フリス（Dissis Friis） 1870年の財団; TorbenとAlice Frimodts財団と神経学研究のための財団。原稿編集はInglewood Biomedical Editingで行った。

すべての動物実験は、デンマーク動物実験監督官の指針に従って実施され、実験動物の地元倫理委員会によって承認された。 1.組織処理注：4℃で一晩0.2Mリン酸緩衝液で希釈した4％パラホルムアルデヒド（PFA）での心筋潅流および後固定後、脳を4℃で3日間リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中30％スクロースに移す。その後、脳を粉末ドライアイス上で凍結させ、切片化まで-80℃で保存する。 <ol><li>メスを使用して脳の中線に沿って左右の半球を分離し、最初の脳でランダムに一方または他方の半球を選択し、その後左右の半球の間で系統的にシフトさせる（ 図1A ）。サンプリングされた半球を標本ディスクにマウントし、長軸をディスクに対して垂直にします実装媒体を使用して。 </li><li>クライオスタット内の予備冷却のために番号が付けられたマルチディッシュ容器を置きます。 </li><li>標本ディスクをクライオスタットにマウントし、海馬全体（Bregma 1.80〜7.04 16 ）を冠状面（ 図1B ）の80μm厚部分に切断する。 <ol><li>すべてのサンプリングされたセクションを冷却された多目的容器に連続して配置して、セクションが切断オーダーに保たれるようにします。 </li><li>切片を凍結保護剤で完全に覆い、その後の使用まで-20℃で容器を保持する。 </li></ol></li></ol> 2.免疫染色注：染色操作中の個々の切片を追跡するために、採取した切片を25ウェル染色ネットに入れる。免疫染色およびその後の細胞計数のために、海馬あたり平均12のセクション（8-16）を与える、5 番目のセクションごとに使用する。 <ol><li>セクションnとセクションn（ 図1C ）との間のランダムスタートでn 番目のセクションごとにサブサンプリングする前に、容器を-20℃から室温（RT）に移す。 </li><li>ペイントブラシを使用して、PBSで満たされたペトリ皿に置かれた25ウェル染色ネットに番号順に切片を移す。 注意：この時点から、軌道シェーカー（セクション2.3〜2.9）に置かれた一致するガラス皿に置かれた染色ネットのセクションを保管してください。 </li><li>一致するガラス皿に染色ネットを移し、蒸留水（dH 2 O）で20分間希釈した3％過酸化水素（H 2 O 2 ）でインキュベートする前に、セクションをPBSで10分間室温で2回洗浄する。 </li><li>この切片を塩酸（HCl）の3つの異なる溶液（0℃で10分間10分間、2分間室温で10分間、2分間37℃で20分間）に移し、0.1M四ホウ酸ナトリウムat RTで20分間。 </li><li> PBS（洗浄緩衝液）で希釈した1％Triton X-100で3×10分間インキュベートした後、切片を10％ウシ胎仔血清（ブロッキング溶液）を含む洗浄緩衝液に室温で1時間移す。 </li><li>切片をブロッキング溶液で1：100に希釈したマウス抗BrdU中、4℃で48時間インキュベートする。 </li><li>切片を洗浄バッファーで3×10分洗浄し、洗浄緩衝液で1:10に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで48時間インキュベートする。 </li><li>切片をPBSに5×10分間移し、次いで0.02％H 2 O 2を含む同様のDAB溶液に室温で10分間移す前にPBSで希釈した0.01％ジアミノベンジジン（DAB）で7分間移す。 </li><li>一連の洗浄（PBS中で2×10分および塩化ナトリウムを添加しないリン酸緩衝液中で2×10分）を行い、顕微鏡スライド上に番号順に切片をマウントする。 </li><li>切片を約30分間乾燥させてから、クレシルで対比染色するバイオレット。 </li><li>顕微鏡スライドをスライドラックに置きます。 </li><li> dH 2 Oを含むスライド染色皿で10分間、切片を再水和させ、次いでスライドをdH 2 O中の0.02％クレシルバイオレットに15分間移す。 </li><li>セクションをエタノールで3回脱水する前にステップ2.12を繰り返す（96％5分間および99％2×2分間）。 </li><li>切片をキシレン中に2×15分置き、迅速な乾燥媒体を用いてスライドを覆い、取り付けます。 </li><li>最後に、カバースリップしたスライドを顕微鏡に使用する前に約24時間放置する。 </li></ol>光学分画器を用いたBrdU標識ニューロンの総数の推定注：いくつかの動物を含むパイロット研究を実施して、分析されるセクションの数およびサンプリングされたセクション内の光学的ディセクターの数など、最適なサンプリングパラメータを決定する。このパイロットはまた、調査者によって決定された推定値の満足できる精度を得るために予備CV（標準偏差/平均）とCEを調整する可能性（3.9.3項参照）（詳細は以下を参照）。同様に、以下の点に対処するためにz分布分析を実施する：組織の収縮、断面全体にわたる染色の質および細胞のz軸14の分布14 。 <ol><li>セクションの組織の厚さを確認して、光学分画器の使用に適していることを確認します。 例えば 、ガードゾーンを含む選択されたディセクターの高さに十分な厚さです（下記参照）。注：組織の厚さは、関心領域内のいくつかの場所での測定値です。 <ol><li>スライドを顕微鏡の電動ステージに置き、好ましい立体ソフトウェアをオンにします。 </li><li>低倍率の対物レンズ（2Xまたは4X）を使用して関心領域を描き、100X石油に変更する（ 図2A参照）。 </li><li>カウントフレームの特定のポイント（コーナーまたはその付近など）を使用して、セクションの一部のフィーチャがフォーカスされるまで、フォーカルプレーンに沿って移動してセクションの上部を探します。このz位置を0として登録します（ 図2B参照）。 </li><li>カウントフレームの同じ特定の点がフォーカスされている組織の最後のzレベルに来るまで組織を通って焦点面を下に動かし、この位置をマークします。局所組織の厚さは0からこの終点まで定義され、z軸で読み取ることができます。組織の厚さを登録する（ 図2B参照）。 </li></ol></li><li>セクションの完全な厚さで細胞の染みや分布の完全浸透を記録する。 注：BrdU標識ニューロンの分布は、必要なガードゾーンを決定するためのガイドとして使用されます。細胞の均一な分布は重要であるが、セクションの上部と下部の近くにあるより少ない細胞を観察することは許容され、キャップの喪失の影響を示している（詳細はDorph-Petersen et al。、2009を参照）。 <ol><li> BrdU標識ニューロンをサンプルし、各計数フレームの選択されたコーナーで測定された局所切片の厚さと共にz位置を登録する。 </li><li> BrdU陽性ニューロンの数をそれらのz位置の関数としてプロットする。 </li></ol></li><li>ディセクターゾーンとガードゾーンの高さを、平均断面厚さと細胞の分布に基づいて固定する（3.1および3.2参照）。 注：ディテクタの高さは、表面に近いアーチファクトを避けるために、セクションの厚さよりも小さくする必要があります。このリスクは、セクションの上部と下部にガードゾーンを含めることによって回避されます。 </li><li>ディテクタ間のステップ長を決定します。 <ol><li>分析するすべてのセクションの関心領域を描き、その領域を登録します。 </li><li>これらの領域を合計し、次にbyはこの領域内に配置されるディセクタの数である。 注記：以前の経験に基づいて、適切な出発点は75個のプローブを必要とします。これは、面積と対応するサンプリング位置の近似値を提供する（A ステップ ）（詳細はWest、2012を参照）。 </li><li> A ステップの平方根を取ると、xyステップサイズが得られます。 </li></ol></li><li>カウントフレームのサイズを決定します。 <ol><li>カウントフレームのサイズを任意の単位に設定し、セクション3.3と3.4で得られたパラメータを使用して、BrdU陽性ニューロンのパイロットサンプリングを実行します。 注：サイズは試行錯誤によって経験的に決定されなければならないが、ディセクターごとに2〜3セルのサンプリングを可能にするように調整することが推奨される8 。 </li></ol></li><li>パイロット研究のこの最終ステップに続いて、細胞サンプリングを開始する。 注：得られたサンプリングパラメータは、約150〜200個のセルi各動物は効率的な立体的なデザインを得るのに十分である8 。 </li><li> 100倍の油浸対物レンズおよび最終倍率2000〜3000倍を用いてBrdU陽性ニューロンを計数する。各光学ディテクターにおいて、興味のある特徴によって明確に認識されているBrdU標識されたニューロンを同定する（本研究では、BrdU標識ニューロンの前縁が最初に焦点を合わせる基準である） （ 図2B ）に触れてください。ディテクタの高さ内の目的の特徴によって明確に認識された場合、排除線に触れるBrdU陽性ニューロンを数えないでください。立体的な定量化の全体を通して、これらの計数規則を慎重に守ることは非常に重要です。 注：BrdUは全ての分裂細胞に取り込まれるため、形態学はニューロンと他のタイプの細胞とを区別するために使用される。ノイロン特性は、中性の細胞質および暗色の核小体を有する明確な核である。 BrdU陽性細胞は、グリア細胞と比較して比較的大きなサイズに基づいて新たに形成されたニューロンとして認識される。短期間の増殖（例えば24時間未満）の研究では、未成熟ニューロンマーカーを用いた二重染色が前提条件となり得ることに言及すべきである17 。 </li><li>計数した細胞の総数（ΣQ - ）と逆数のサンプリング分数を掛け合わせることにより、各脳におけるBrdU陽性ニューロンの総数を推定する： <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq1.jpg" /> ために<img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq2.jpg" /> どこで<img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq3.jpg" /> Q-は数加重平均断面厚さ、 hはディセクタの高さ、 asfは面積サンプリング分率、 ssfはセクションst iはi 番目の計数フレームにおける断面厚さであり、セルカウントは<img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq4.jpg" />ディセクター14,18内に配置される。 </li><li>系統的一様ランダムサンプリング（SURS）におけるBrdU陽性ニューロンのサンプリング分散である誤差係数（CE） 8を計算する。 <ol><li>まず、BrdU陽性ニューロンの総数に等しいノイズを計算する： <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq5.jpg" /></li><li>次に、SURSの分散を計算します。 注：私たちは、海馬の面積と細胞数をセクションごとに滑らかに変化させると判断し、その結果「平滑度クラス」m = 1（1/240）8,19 <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq6.jpg" /> どこで <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq7.jpg" /> <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq8.jpg" /> <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq9.jpg" /> P iは、i 番目のセクション内のオブジェクトについて計数されたポイントの数であり、nは、セクション4,20の数である。 </li><li>最後に、見積もりの​​CEを計算します。 注：OCV 2 = ICV 2 + CE 2 （OCVは観測されたCVであり、ICVは固有のCV 4である）のように、CE値が観察されたCVの半分よりも小さい場合、一般に最適精度が一般的に達成される。 <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55737/55737eq10.jpg" /></li></ol></li></ol><img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig1.jpg" /> F図1：本研究で使用した分画器の原理による組織処理を示す概略図。 実験に続いて、半球は系統的にランダムに選択された左右半球が分離されている（A）。海馬全体に広がる完全な脳を80μm厚の冠状切片（B）に切断し、最後の免疫染色および立体的定量（C）のために5 番目の切片をサブサンプリングする。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig2.jpg" /> 図2：光学ディテクタを用いた立体サンプリングの手順を示す図。 （A）組織学的処理後、h海馬GCL / SGZは描写されており、光学ディテクターはその領域にわたって均一かつランダムに適用された。 （B）光学障害物（左）において、BrdU陽性ニューロンは、その特徴がディセクターの高さ内ではっきりと認識され、計数枠の内側または包含線に接触している場合にのみ計数された（右）。排除線に触れるニューロンは数えられなかった。スケールバー=10μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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</ol>

著者には競合する金銭的利益はない。

神経新生を誘導するための方法論としてECSを使用すると、我々は、海馬における新しいBrdU陽性ニューロンの形成において260％の即時増加を見出す。この急激に生成されたニューロンのプールでは、1日目から3ヶ月目までに40％の減少が見られ、新たに形成されたニューロンの約50％が治療後少なくとも12ヶ月生存した10,11 。 BrdUで標識されたニューロンの計数は厳密なサンプリングスキームに従った。海馬全体を80μm厚の切片に切断した後、セクション1とセクション5との間のランダムサンプリングを開始して5 番目のセクションごとにサブサンプリングした。これらのセクションを系統的なランダムな方法で選択することは、徹底的な集計をすることなく、最終結果の分散を減らす優れた方法です1 。このサンプリングスキームは、BrdU陽性ニューロンを平均12（8-16）の海馬で計数することを可能にした各ラットの脳の全切片であり、最終的な精度は9〜11％である。 分画器法を使用する場合、組織収縮および変形は組織学的処理中に頻繁に起こるため、計数を行うセクションの高さの部分を知ることが不可欠である14 。実際、本研究では厚さの実質的な収縮が見られた。さらに、Dorph-Petersenらに提示されているように、示差的な組織収縮が起こる可能性があることに留意すべきである。しかしながら、分析のために完全な構造が利用可能である限り、これらの制限は、粒子、 すなわち BrdU陽性ニューロンの総数の偏りをもたらさない。組織収縮が特に問題となる研究では、結果が変形組織で得られると常に述べるべきである。この研究では、10μmのディセクター高さでカウントした。本研究の断面は、最終平均厚さ26μm、5μm上部にガードゾーン、下部に11μm（平均）のガードゾーンがあります。これらのパラメータは、ガードゾーンがサンプリングされた粒子のおおよその直径でなければならないので、許容可能である。 GCL / SGZの描写に続いて、ディセクタは、描写された領域内に均一にランダムに配置された。検査官が決定した精度で推定値を効率的に得るために、標本化および計数を最適化する固定されたステップ長さで配置されるべきである。最適な精度は、典型的には、関心のある各構造において150~200個の細胞を計数することによって達成される。今回の研究では、各ラット海馬に平均133のBrdU陽性ニューロン（範囲33〜372）を計数した。いくつかの対照動物では細胞数が低いため、BrdU陽性ニューロンの数は適切な精度を得るために必要とされる一般的に許容される細胞数を下回り、そのために比較的高いCE値をもたらした。 HCV値の半分以下のCE値を得たので（代表的な結果の項を参照）、追加のサンプリングとカウントは必要ありませんでした。 CV値が高いことは、観察された変動に対する最大の寄与が生物学的変動に起因することを示している。実際、本研究で計数したBrdU陽性ニューロンの平均数は必要以上に多くなったと主張するかもしれない。例えば、ある群のラットにおいて、9％のCE値を達成し、43％のCV値を観察した。この特定のケースでは、約20％の精度を目指すことができました。要約すると、本研究におけるBrdU陽性ニューロンの総数の精度は、真の数の粒子に対する実際の治療効果を捕捉するのに十分である。ある種の動物群ではかなり大きな生物学的変異があるため、労力を費やすことなく、許容できる精度で同じ推定値を得ることができました。グループ内の高い生物学的差異は、動物の数を増やすことによって補償される。 正確な細胞数を得るためのゴールドスタンダードには、関心のあるすべての対象物の網羅的なカウントが必要であると主張するかもしれない。しかし、脳の大部分の研究では、これは膨大な数の細胞に起因する可能性はない。徹底的な細胞計数よりはるかに効率的であるが、任意の分画器は、正確な細胞数が必須ではない場合に好ましい細胞数の単純なスクリーニングと比較して、比較的時間がかかる。 20-30％を超える違いがスクリーニング手順によって純粋に検出されるのは私たちの経験です。 正しく実行された場合、設計ベースの立体視を使用したサンプリングは、効率的な方法で偏っていない正確な推定を提供する1 。ステレオロジーのバイアスのない特性は、複製されたときに、真の母集団平均を近似し、その再現性を高める推定値を生成する。推定21 。最初に、セクション4の統計的に有効なサブセットの推定を可能にする目的の構造全体（この研究では海馬GCL / SGZ）の代表的なサンプルを取得しなければならない。適切な数のセクションとカウントプローブを得るために、SURSを適用します.SURSはランダムサンプリングに比べて分散を減少させます8 。さらに、SURSは、構造内の対象粒子が構造内のサイズ、形状、向きおよび分布とは無関係に同じ確率でサンプリングされることを保証します。そのような立体視は、プロジェクトの中心的な側面である、正確で偏りのない見積もりを得るために強く推奨される。

3次元（3-D）構造の細胞の定量化には、偏りのない原理に基づく推定値を得る必要があるかもしれない。今日でも、研究はしばしば二次元（2D）の方法を用いて三次元構造のデータを報告する。しかしながら、これらの方法は、細胞の形状および分布の点で構造の異種性を考慮しておらず、結果として、それらは関心のある3D構造について仮定を行い、その結果は完全な構造を指すものではない。これらの制限は、方法の感度と精度を低下させるだけでなく、エラーのリスクを増加させる1 。 所与の組織または構造中の細胞の数に関する定量的情報を得るために一般的に重要な、設計に基づく立体構造の適用によって、細胞カウントにおける偏りを回避することができる。 ステレオロジーは以前は非常に時間がかかる方法でしたが、手順の進歩、ソフトそれははるかに効率的かつ広く適用可能になっています。ステレオロジーは、統計的サンプリング原理と確率的幾何学理論を伴い、2-Dセクション2でサンプリングすることにより、3次元構造内の物体の体積、表面積、長さ、および数の推定のための効率的なツールを提供する。したがって、ステレオロジーは、網羅的な分析なしに、真の数の平均推定を与える組織切片の構造変化に関する不偏の定量的データを得ることを可能にする1 。ステレオロジーは、サンプリングされた情報からの幾何学的パラメータの統計的推測として定義される。これは、偏りのないサンプリング、すなわちセクションの系統的なランダムサンプリング、およびすべてのオブジェクトが等しい確率でカウントされることを保証する計数規則によって達成することができる3 。立体的結果は、誤差係数（CE）によって示されるように様々な程度の精度を有することができるが、これは、必要に応じてサンプリング量を調整することにより、固有の生物学的分散（変動係数（CV））に適合させることができます4,5 。これまでのいくつかの立体学的研究では、げっ歯類の海馬可塑性に及ぼす電気痙攣刺激（ECS）の短期作用を調べた6,7 。これらの研究からのデータは、反復ECS後のニューロンの総数の増加ならびにシナプスの上昇の上昇を示す。しかし、これらの研究は、細胞増殖に特異的なマーカーを使用しないため、神経発生を直接的に推定しない。 ここでは、サブグラニュラーゾーン（SGZ）を含むラット海馬顆粒細胞層（GCL）における新たに形成されたニューロンの総数を定量化するための立体的方法、光学分画器技術8,9彼らの長期的なものとして謝罪10,11 。我々は、ラットに、神経新生の最も強力な刺激因子の1つである、ECSの臨床関連スケジュール（週3回、3週間）を施した12 。対照動物は、電流を流さずに同じ手順を用いて処置した。 21日間の実験の各々において、全てのラットに、細胞分裂13の間にチミジンの代わりにDNAに取り込まれる5-ブロモ-2&#39;-デオキシウリジン（BrdU）を腹腔内注射した。実験後、ラットを4つの異なる期間（24時間、3ヶ月、6ヶ月および12ヶ月）維持した。分画器の原理を使用して、セクションの均一な無作為抽出による海馬の既知の画分を得、サンプルおよび免疫染色された厚い組織切片に適用された光学的ディシジョン（3-Dプローブ）を行った。凍結切片は、通常、プロセス中にz軸で崩壊するこの特定の場合には、数加重平均断面厚さに基づく光学ディテクタを使用する必要があります14 。光学ディテクターの焦点面がその区間を通って既知の距離だけ下方に移動すると、BrdU陽性ニューロンは、その特徴がはっきりと認識されたときに数えられた。立体学の分野では、計数すべき粒子の総数についていくつかの議論がある。適切な精度、 すなわち 7〜8％の係数を得るために、典型的には150〜200個のニューロンが関心構造内で数えられる。 BrdU陽性神経細胞数は、カメラを備えた標準的な顕微鏡および2倍、4倍および10倍ならびに100倍の油浸対物レンズ（開口数= 1.40）および電動ステージ。 z方向の動きは、デジタルマイクロカッターで測定した。最終倍率3000Xだった。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19-160</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td>1 Lの次の材料が含まれています: 0.2 g クレシルバイオレット、2.0 g 酢酸ナトリウム、3 H2O、3 ml 氷酢酸、1000 ml 蒸留水&nbsp;</td></tr><tr><td>凍結保護剤</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>861334</td><td>以下の材料が含まれています: ショ糖; ポリビニルピロリドン PVP 40; リン酸ナトリウム緩衝液 (0.2 M);&nbsp;エチレングリコール;脱塩水。</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>817205</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine &ndash;DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Envision-HRP</td><td>DAKO</td><td>K4001</td><td>ペルオキシダーゼ標識ポリマー ヤギ抗マウス免疫グロブリンに結合</td></tr><tr><td>エタノール - 70 %</td><td>プラムA/S</td><td>201098</td><td></td></tr><tr><td>エタノール - 96 %</td><td>プラムA/S</td><td>201104</td><td></td></tr><tr><td>エタノール - 99.9 %</td><td>プラムA/S</td><td>201111</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>In Vitro</td><td>BI-04-003-1A</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 30%</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>896456</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>J. T. Baker</td><td>6081</td><td></td></tr><tr><td>封入媒体</td><td>さくら</td><td>4583</td><td>Tissue Tek</td></tr><tr><td>Mouse-anti-BrdU</td><td>Becton-Dickinson</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>853436</td><td>pH = 7.4</td></tr><tr><td>PFA</td><td>VWR</td><td>28,794,295</td><td>pH = 7.4</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液&nbsp;</td><td>Capital Region Pharmacy, DK</td><td>866533</td><td>0.1 mol/l, pH 7.4</td></tr><tr><td>速乾性封入剤</td><td>Histolab Products AB</td><td>801</td><td>Pertex</td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム</td><td>Merck A/S</td><td>1,063,080,500</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Merck A/S</td><td>1,076,515,000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck A/S</td><td>1,086,031,000</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR</td><td>28,973,363</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>strong会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>strongコメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverは</td><td>Menzel-Gl&aumlをスリップします。ser</td><td>24x50 mm #0</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>&nbsp;CM1860</td><td></td></tr><tr><td>デジタルマイクロケーター</td><td>ハイデンハイン</td><td>VRZ 401</td><td></td></tr><tr><td>ガラス皿</td><td>Brain Resaerch Laboratories</td><td>1256</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス 80i</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>オリンパス</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>SuperFrost+</td></tr><tr><td>電動ステージ</td><td>前</td><td>H101A</td><td></td></tr><tr><td>マルチディッシュコンテナ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6315-1CS</td><td>&nbsp;Nuclon 12-wells</td></tr><tr><td>New-Castソフトウェア</td><td>Visiopharm</td><td>ver. 4.5.6.440</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 2x</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan UW 2X</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 4x</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 4X</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 10x</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 100x 油浸</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda DM 100X オイル</td><td>開口数 1.40</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>Gemini BV</td><td>CM-9</td><td>Sarstedt</td></tr><tr><td>スライドラック</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>スライド染色皿</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>試料ディスク</td><td>ライカ</td><td>14037008637</td><td></td></tr><tr><td>染色ネット</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>2512</td><td>25ウェル</td></tr></tbody></table>

電気ショック療法のラットモデルにおける細胞数の推定のための光学分画器技術

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

立体学的方法は、細胞または構造のサイズ、形状、配向および分布について仮定することなく、定量的パラメータを記述するように設計されている。これらの方法は、体積細胞集団が高すぎて手作業でカウントすることができない哺乳動物の脳の定量分析に革命的であり、三次元量の推定値を二次元セクション。すべての立体的方法は原則として不偏である。しかし、彼らは関心のある構造と組織の特徴についての適切な知識に頼っています。ステレオロジーは、精度に関して最も効率的なレベルにサンプリングを調整し、関心のある構造全体について信頼性の高い定量的情報を提供するシステマティック均一ランダム・サンプリング（SURS）に基づいています。ここでは、光学分画器をBrdU免疫組織化学と組み合わせて提示する神経興奮の最も強力な刺激因子の1つである電気痙攣刺激後のラット海馬の顆粒細胞層（小顆粒領域を含む）における新たに形成されたニューロンの産生および生存を推定する。光学分画器技術は、全構造からサンプリングされた厚い切片からの細胞の総数の推定値を提供するように設計される。厚い切片は、完全な3D範囲で細胞を観察する機会を提供し、形態学的基準に基づいて細胞分類を容易かつ堅牢にすることを可能にする。正確に実施されると、光学分画器の感度および効率は、固定された所定の精度で正確な推定値を提供する。

サンプリングパラメータパイロット研究（ 図3 ）におけるz-分布を分析することにより、我々は、ディセクターの高さにおけるBrdU陽性ニューロンの均一な分布を見出した。切片の収縮を測定した。最初の80μmで切った部分の最終平均厚さは26.4μm（19.0〜32.0μm）であった。 BrdU標識ニューロンの組織の厚さおよび分布に基づいて、ディセクターの高さを10μmに設定し、セクションの上部および下部のガードゾーンをそれぞれ5μmおよび4-17μmに設定した。セルの密度に応じて、計数フレームの面積は1414または5210μm2であった。ステップの長さはx方向とy方向の両方で220μmであり、細胞計数は動物当たり平均12（範囲8〜16）の切片で実施した。これらのサンプリングパラメータは、平均133（範囲33〜372）のBrdU- 陽性細胞は、各脳半球の173（107-204）個の障害に計数された。 一例として、我々は、ECS処置ラットにおけるBrdU陽性ニューロン推定について以下のCVおよびCE値を得た：24時間：CV = 0.59、CE = 0.11; 3ヶ月：CV = 0.34、CE = 0.12; 6ヶ月：CV = 0.43、CE = 0.09; 12ヶ月：CV = 0.22、CE = 0.09。 我々は、BrdU染色法と組み合わせて光学分画器を用いて、ECS後のラット海馬における新たに形成されたニューロンの総数およびそれらの長期生存を定量した10,11 。最終結果は、対照動物の4つの群における基礎神経発生を示したが、生存時間の関数として有意差はなかった（ 図3 ）。さらに、ECSは24日目にBrdU陽性ニューロンの総数の有意な増加を誘導した対照動物と比較して、実験後、25時間後（259％、p &lt;0.0001）、3（229％、p &lt;0.001）、6（152％、p &lt;0.05）および12ヶ月後（162％、p &lt;0.05） <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55737/55737fig3.jpg" /> 図3：ラット海馬のGCL / SGZにおけるBrdU陽性ニューロンの総数の定量的データ10,11 。 横棒は平均値を表す。略語：GCL、顆粒細胞層; SGZ、細粒状ゾーン; h、時間; m、月。 **** p &lt;0.0001、*** p &lt;0.001および* p &lt;0.05対コントロール（n =群あたり11-12）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55737/55737fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、電気刺激刺激後のラット海馬における新しいニューロンの形成およびその生存を定量化するために使用される立体的方法、光学分画器を提示する。正確に実施されると、立体方法の感度と効率は、固定された所定の精度で正確な推定を保証する。

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

光学フラクショネーターを用いた本ステレオロジー研究の全体的な目的は、不偏的な原理に基づいた手法を用いて、特定の脳領域における細胞総数などの定量的な情報を得ることです。この手法は、関心のある完全な構造における細胞総数の推定など、定量分析分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点の一つは、固定され、あらかじめ決定された精度で正確な推定値を提供できることです。本手順の実演を行うのは、本論文の共著者であるEsther Kjaer Needhamです。まず、固定・凍結済みのラット脳を用意します。メスを用いて、脳の正中線に沿って右半球と左半球を分離し、1つ目の脳ではどちらか一方の半球をランダムに選択します。その後、右半球と左半球の間を系統的に移動します。次に、封入剤を用いて、選択した半球の長軸がディスクに対して垂直になるように、標本ディスクに固定します。半球をディスクに固定したら、半球の周囲にチューブを配置し、Tissue-Tekを満たして半球全体を完全に覆います。次に、番号を付けたマルチディッシュコンテナをクライオスタットに入れ、予冷します。その後、試料ディスクをクライオスタットに装着し、海馬全体を冠状面で、任意の位置から80 µm厚で切断します。切断しながら、切片の順序を維持するため、採取したすべての切片を順次、冷却したマルチディッシュコンテナに配置します。海馬全体を切片化した後、切片全体を凍結保護剤で覆い、次に使用するまで容器を-20°Cで保存します。免疫染色を開始する際は、切片を室温に戻します。その後、絵筆を用いて、海馬切片の連続切片から5枚ごとに1枚を、PBSを満たしたペトリ皿内の25ウェル染色ネットに移します。染色のために、海馬あたり8～12枚の切片を用意します。切片が入った染色ネットをPBSが入った対応するガラス皿に移し、PBSで10分間、2回洗浄します。その後、3%過酸化水素で20分間インキュベートします。洗浄後、切片を3種類の塩酸溶液に移動させます。次に、室温で20分間、0.1 sodium tetraborate中で中和します。洗浄バッファーでの10分間のインキュベーションと交換を3回繰り返した後、切片をブロッキング溶液に移し、室温で1時間置きます。その後、ブロッキング溶液で1:100に希釈したマウス抗BrdU抗体を用いて、切片を4°Cで48時間インキュベートします。一次抗体インキュベーション後、洗浄バッファーで10分間ずつ3回洗浄します。次に、洗浄バッファーで1:10に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）を用いて48時間インキュベートします。48時間後、切片をPBSに移して10分間置き、これを計5回繰り返して洗浄します。洗浄後、切片をDAB溶液に移して7分間反応させます。その後、0.02% hydrogen peroxideを含むDAB溶液に移して10分間反応させます。一連の洗浄後、切片を番号順に顕微鏡スライドに封入します。約30分間乾燥させてください。その後、サンプルをスライドラックに入れ、風乾させます。次に、蒸留水を入れたスライド染色容器内で、サンプルを10分間再水和させます。その後、スライドを0.02%クレシルバイオレット溶液および蒸留水に15分間浸します。クレシルバイオレット染色の繰り返し後、エタノール系列を用いて切片を再水和させます。その後、キシレンで2回、それぞれ15分間、切片を透徹します。最後に、速乾性封入剤を加え、カバーガラスを被せます。24時間後、スライドを顕微鏡観察に使用できます。まず、スライドを顕微鏡の電動ステージに設置し、ステレオロジーソフトウェアを起動して、組織の厚さを確認します。低倍率対物レンズを用いて関心領域を画定した後、100倍油浸対物レンズに変更します。次に、カウントフレーム内の特定の点（例えば、コーナーに隣接する領域など）を選択し、切片の特徴的な構造が焦点に合うまで焦点面を移動させ、切片の最上部を特定します。Z位置をゼロとして登録します。次に、組織の最後のZレベルに焦点が合うまで、焦点面を組織に向かって下げ、この位置をマークします。局所的な組織の厚さは、ゼロからこの終点までと定義され、Z軸で読み取ることができます。組織の厚さを記録します。関心領域内の数箇所で組織の厚さを測定します。ダイセクターとガードゾーンの高さ、計数枠のサイズ、ステップ長、および最終倍率は、パイロット研究において決定します。次に、通常は60倍または100倍のオイル浸漬対物レンズと高開口数（NA）を用い、最終倍率2000〜3000倍でBrdU陽性ニューロンのカウントを開始します。各カウントフレーム内のBrdU陽性ニューロンを特定しますが、赤い除外線に接しているものはカウントしないでください。緑色の包含線に接しているBrdU陽性ニューロン、およびカウントフレームの境界内に収まっているものをカウントします。関心のある特徴がディセクターの高さ内で明確に認識できる場合にのみ、BrdU陽性ニューロンをカウントしてください。ここに示されている半分しか見えていないニューロンはカウントされません。この画像は、ラット海馬の海馬顆粒細胞層および下顆粒帯におけるBrdU陽性ニューロンの総数を示しています。水平バーは平均値を表しています。電気痙攣刺激後、処置を行わなかった対照群と比較して、新たなBrdU陽性ニューロンの形成が即座に260%増加します。これらの新しく生成されたニューロン群では、1日目から3か月目までに40%の減少が見られ、処置後12か月まで生存している新形成ニューロンは約50%です。このビデオを視聴することで、ステレオロジー的手法を用いて脳領域内の総細胞数を推定する方法について、十分な理解を得ることができます。

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