電気ショック療法のラットモデルにおける細胞数の推定のための光学分画器技術
July 9th, 2017
ここでは、電気刺激刺激後のラット海馬における新しいニューロンの形成およびその生存を定量化するために使用される立体的方法、光学分画器を提示する。正確に実施されると、立体方法の感度と効率は、固定された所定の精度で正確な推定を保証する。
光学フラクショネーターを使用したこの立体学的研究の全体的な目標は、偏りのない原理に基づく方法を使用して、特定の脳領域の細胞の総数などの定量的情報を取得することです。この方法は、対象の完全な構造における細胞の総数の推定など、定量分析の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点の 1 つは、固定された事前に決定された精度で正確な推定値を提供することです。
この手順を実証しているのが、記事の共著者であるEsther Kjaer Needhamです。固定され凍結されたラットの脳から始めます。メスを使用して、脳の正中線に沿って右半球と左半球を分離し、最初の脳でどちらか一方の半球をランダムに選択します。
その後、右半球と左半球の間を系統的に移動します。次に、封入剤を使用して、選択した半球をディスクに垂直な長軸を持つ試料ディスクにマウントします。半球をディスクに取り付けたら、半球の周りにチューブを置き、Tissue-Tekで満たして半球を完全に覆います。
次に、番号が付けられたマルチディッシュコンテナをクライオスタットに入れて予冷します。次に、試料ディスクをクライオスタットに取り付け、海馬全体を冠状面の80ミクロンの厚さのセクションにランダムに切断します。切断中は、すべてのampリングされたセクションを連続して冷たいマルチディッシュコンテナに入れて、セクションが切断順序に保たれるようにします。
海馬全体を切片にしたら、切片を凍結保護剤で完全に覆い、容器をさらに使用するまで摂氏マイナス20度に保ちます。免疫染色を開始する準備ができたら、切片を室温に戻します。次に、ペイントブラシを使用して、一連の海馬切片から5つおきに、PBSで満たされたペトリ皿に配置された25ウェル染色ネットに移します。
染色のためには、海馬ごとに8〜12のセクションが必要です。切片を含む染色ネットをPBSを含む対応するガラス皿に移し、切片をPBSで10分間2回洗浄します。その後、3%過酸化水素で20分間インキュベートします。
洗浄後、切片を3つの塩酸溶液に移します。次に、0.1四ホウ酸ナトリウムで室温で20分間中和します。10分間のインキュベーションを3回行い、洗浄バッファーを交換した後、切片をブロッキング溶液に室温で1時間移します。
次に、1〜100に希釈したマウス抗BrdUで切片をブロッキング溶液中で48時間、摂氏4度でインキュベートします。一次抗体インキュベーション後、洗浄バッファー中で各10分間、3回洗浄してください。その後、洗浄バッファーで1〜10に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼで48時間インキュベートします。
48時間後、切片をPBSに10分間移し、合計5回の洗浄を繰り返します。洗浄後、切片をDAB溶液に7分間移します。次に、0.02%の過酸化水素を含むDAB溶液に10分間移します。
一連の洗浄の後、切片を番号順に顕微鏡スライドに取り付けます。約30分間乾燥させます。次に、サンプルをスライドラックに入れて風乾します。
次に、蒸留水を入れたスライド染色皿でサンプルを10分間再水和します。次に、スライドを0.02%クレシルバイオレットと蒸留水に15分間移します。クレシルバイオレット染色を繰り返した後、エタノールシリーズで切片を再水和します。
次に、キシレンの切片を毎回15分間2回取り除きます。最後に、速乾性封入剤を追加し、スライドをスリップします。24時間後、スライドは顕微鏡検査に使用できます。
まず、スライドを顕微鏡の電動ステージに置き、次に立体学ソフトウェアを開いて、組織の厚さを確認します。低倍率の対物レンズを使用して対象領域を描写してから、100倍の油浸対物レンズに変更します。次に、カウントフレーム内の特定のポイント(コーナーに隣接する領域など)を選択し、セクションの一部の特徴に焦点が合うまで焦点面に沿って移動してセクションの上部を見つけます。
Z位置をゼロとして登録します。次に、組織の最後のZレベルに焦点が合うまで、焦点面を組織を通して下に移動し、この位置に印を付けます。局所組織の厚さは 0 からこのエンドポイントまで定義され、Z 軸で読み取ることができます。
ティッシュの厚さを登録します。組織の厚さは、関心領域内のいくつかの場所で測定されます。ディセクタとガードゾーンの高さ、計数フレームのサイズ、ステップの長さ、および最終的な倍率は、パイロットスタディで決定されます。
これで、通常は60倍または100倍のオイル対物レンズと高い開口数を使用して、最終倍率2000〜3000倍でBrd-U陽性ニューロンの数え始めることができます。各カウントフレームでBrdU陽性ニューロンを特定しますが、赤い除外線に触れるニューロンはカウントしません。緑色の包含線に接触するBrdU陽性ニューロンと、カウントフレームの境界内にあるニューロンをカウントします。
Brd-U陽性ニューロンをカウントするのは、対象の特徴がディセクタの高さ内で明確に認識されているときのみです。ここに示されている半可視ニューロンはカウントされません。この画像は、ラット海馬の海馬顆粒細胞層と顆粒下ゾーンにおけるBrdU陽性ニューロンの総数を示しています。
水平バーは平均値を表します。電気けいれん刺激後、治療を受けた対照群と比較して、新しいBrdU陽性ニューロンの形成がすぐに260%増加します。この新しく生成されたニューロンのプールでは、初日から3か月までに40%の減少があり、新しく形成されたニューロンの約50%が治療後12か月生存します。
このビデオを見れば、立体法を使用して脳領域の細胞の総数を推定する方法をよく理解できるはずです。
概要
この研究は、電気けいれん刺激後のラットの海馬における新しいニューロンの形成と生存を定量化するためのステレオロジー的手法、光学的フラクションエーターを提示します。この手法は、事前に定められた精度で正確な推定を保証します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- ステレオロジー
- 神経新生
背景
- 光学的フラクションエーターは、細胞数を数えるために使用されるステレオロジー技術です。
- これは、特定の脳領域における細胞集団の偏りのない推定を提供します。
- 神経新生の理解は、脳の可塑性と回復に関する洞察に不可欠です。
- 電気けいれん刺激は、海馬における神経新生に影響を与えることが知られています。
研究の目的
- ラットの海馬で形成された新しいニューロンの総数を定量化すること。
- これらのニューロンの時間の経過に伴う生存率を評価すること。
- 光学的フラクションエーター法の有効性を示すこと。
使用した方法
- クライオスタットを用いたラット脳組織の準備。
- 新しく形成されたニューロンを識別するためのBrdUに対する免疫染色。
- 顕微鏡を用いたBrdU陽性ニューロンのステレオロジー的数え上げ。
- 処置後のニューロン生存率の統計分析。
主要な結果
- 電気けいれん刺激により、新しいニューロンの形成が260%増加しました。
- 新しく形成されたニューロンの40%の消失が最初の3ヶ月間で観察されました。
- 処置後12ヶ月で新しく形成されたニューロンのほぼ50%が生存しました。
- 光学的フラクションエーターは、細胞集団の精密な推定を提供しました。
結論
- 光学的フラクションエーターは、神経新生を定量化するための効果的な方法です。
- 電気けいれん刺激は、新しいニューロンの形成を著しく促進します。
- ニューロンの生存の理解は、神経変性疾患における治療戦略にとって重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative cell population estimation is critical for validating neurogenesis targets and de-risking mechanistic hypotheses in CNS drug discovery. The optical fractionator technique enables unbiased, reproducible measurement of neuron production and survival, supporting predictive confidence in early-stage neurobiology programs. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical assessment in neuropsychiatric and neurodegenerative research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous quantification of neurogenesis for target validation in CNS models.
- Supports mechanistic de-risking by providing unbiased cell number estimates.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neurogenic pathways post-intervention.
- Improves predictive confidence for advancing neuroplasticity targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, quantitative readouts for neuron formation and survival.
- Standardizes cell counting workflows for reproducibility across studies.
- Prepares robust biological systems for downstream compound screening.
- Enables scalable assessment of neurogenic effects in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns quantitative outputs with disease-relevant neurogenesis endpoints.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of neurogenic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on neuron survival metrics.
- Provides translationally relevant data for biomarker and efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The optical fractionator method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by delivering unbiased, quantitative neuron counts that inform target validation, screening, and translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neurogenesis post-intervention.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell counts for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs and precision thresholds for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models with disease-relevant neurogenesis data.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable workflow for unbiased cell quantification across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurogenesis studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell counting workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurogenic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereology and neuroanatomical tissue handling.
- Needs access to advanced microscopy and stereology software infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sampling and counting protocols.
- Must be adapted for different brain regions or disease models as needed.
- Precision and accuracy depend on rigorous adherence to unbiased sampling principles.
