ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

ネイティブ電気泳動とゲル内アッセイ、イムノブロッティング、およびネイティブ電気溶出との組み合わせの全体的な目標は、ミトコンドリアスーパーコンプレックスの集合を保存し、分析することです。この方法は、ミトコンドリア電子伝達鎖のタンパク質複合体が、生体エネルギーのニーズや生理学的および病理学的条件など、多くの要因に応じてどのように超複合体に集合するかを明らかにするのに役立ちます。この手法の主な利点は、適切に行われれば、ミトコンドリアスーパーコンプレックスの生理学的完全性と機能が長期にわたる単離プロセス全体を通じて維持されることです。

この方法は、超複合体集合のダイナミクスの研究や、原形質膜や他の細胞内膜のタンパク質複合体の分析にも適用できます。インゲルアッセイの準備をする際には、天然電気泳動に使用されるすべての部分が界面活性剤によって汚染されていないことが絶対に重要です。なぜなら、界面活性剤はミトコンドリアのスーパーコンプレックスの崩壊に寄与するからです。透明なネイティブゲルから1つ以上のレーンを切り取り、これらをラベル付き容器に移します。

complex-1アッセイを実行するには、10ミリリットルのアッセイバッファーを25ミリグラムのニトロブルーテトラゾリウムと100マイクロリットル/ミリリットルのNADHと組み合わせます。これを、切除された透明なネイティブゲルレーンまたは関心のある領域に追加します。ロッカーで少なくとも3分間穏やかに攪拌した後の青いバンドの発達を追跡します。

その後、ゲルを10〜20ミリリットルの酢酸溶液で固定するか、5ミリモルのトリスpH7.4で洗浄して反応を停止します。文書化のために写真を撮ります。complex-5アッセイを行うには、青色のネイティブゲルまたは透明なネイティブゲルからゲル、レーン、または対象領域を取得します。

10〜20ミリリットルのアッセイバッファー、または室温でオリゴマイシン1ミリリットルあたりプラスマイナス5マイクログラムで穏やかに攪拌しながらサンプルを2時間インキュベートします。インキュベーション後、バッファーを14ミリリットルの新鮮なアッセイバッファーと交換します。次に、1モルの硫酸マグネシウム190マイクロリットル、硝酸鉛27.28ミリグラム、ATP60ミリグラム、およびオリゴマイシン75マイクロリットルを順番に加えます。

穏やかに撹拌しながらインキュベートし、オリゴマイシン処理ゲル上のバンドが非複合体5依存性バンドを与えるため、白い沈殿物を観察します。酸性溶液が鉛沈殿物を溶解するため、ゲルをメタノールベースの固定液で固定します。結果を写真に撮り、テキストプロトコールに記載されているように、タンパク質導入と免疫ブロッティングを行います。

電気溶出の日は、使用する各ガラス管の底にフリットを入れます。必要に応じて、ガラス管を溶出バッファーに入れ、フリットをチューブの内側から底に押し込みます。フリット付きのガラス管をエレクトロエリーターのモジュールに押し込みます。

グロメットを溶出バッファーで濡らし、ガラス管を所定の位置にスライドさせます。ガラス管の上部がグロメットと均一であることを確認してください。空のグロメットをストッパーで閉じます。

次に、シリコンアダプターの底に湿ったメンブレンキャップを置き、アダプターに溶出バッファーを充填します。バッファーとアダプターをゆっくりと上下にピペットで動かし、透析膜の周りの気泡を取り除きます。バッファー入りアダプターをガラス管の底までスライドさせます。

次に、ガラス管内のフリットに現れるすべての気泡を取り除きます。各ガラス管に溶出バッファーを充填します。BN-PAGEの切除されたバンドをガラス管に入れます。

大きなピースを小さなピースにカットします。ガラス管内の充填高さが約1センチメートルであることを確認してください。次に、モジュール全体をタンクに入れます。

約600ミリリットルの低温溶出緩衝液をタンクに加えます。シリコンアダプターキャップがバッファーに浸されていることを確認してください。タンクの底に攪拌子を置き、低温室で350ボルトで4時間タンパク質を溶出させます。

溶出が完了したら、Electro-Eluterモジュールをバッファータンクから取り出し、シンクまたはボウルに入れます。ストッパーを使用した場合は、ストッパーを取り外して上部バッファーチャンバーを排水します。各ガラス管からバッファーを取り外して廃棄します。

シリコンアダプターが所定の位置に留まっていること、およびフリットの下の液体が邪魔されたり振られたりしていないことを確認してください。次に、シリコンアダプターをメンブレンキャップと一緒にガラス管の底から慎重に取り外します。シリコンキャップの内容物をマイクロチューブにピペットで移します。

さらに200マイクロリットルの溶出バッファーで、シリコンキャップをすすぎ、マイクロチューブに加えます。すべてのガラス管についてこのプロセスを繰り返します。再利用可能なメンブレンキャップは、0.5ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルのアジ化ナトリウムを含む溶出バッファーに入れて保存し、冷蔵します。

ここでは、心臓ミトコンドリア由来のスーパーコンプレックスをインゲルアッセイで可視化します。透明なネイティブゲルのレーンは、複合体-1および複合体-5のゲル内アッセイに使用されます。シグナルの特異性は、ATPシンターゼのオリゴマイシンなどの阻害剤を使用して評価できます。

インゲルアッセイは、complex-1またはcomplex-5の活性を持つタンパク質複合体のサイズに関する情報を提供しますが、その組成に関する情報は提供しません。青色のネイティブゲルは、電気溶出のために切除できるタンパク質複合体のバンドを示しています。電気溶出後、溶出液は、ゲル内アッセイ、天然または変性電気泳動による溶出タンパク質の銀染色、ウェスタンブロッティングなどのさらなる分析に使用されます。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3日以内に行うことができます。この3日間には、ミトコンドリアの単離、一晩のブルーネイティブマキシ電気泳動、およびイムノブロッティングが含まれます。このビデオを見れば、ネイティブ電気泳動、ゲル内アッセイ、および電気溶出を使用してミトコンドリアスーパーコンプレックスを単離および同定する方法を十分に理解できるはずです。

この手順を試みる際には、ミトコンドリアのスーパーコンプレックスは壊れやすいことを覚えておくことが重要です。サンプルの凍結融解は最小限に抑える必要があります。ネイティブ電気泳動と電気溶出は、氷上または冷蔵室で行う必要があります。

これらの手法の意味するところは、各スーパーコンプレックスの物理的組成を定義することだけにとどまりません。スーパーコンプレックスは本来の形態で捕捉されるため、機能アッセイを行うことができます。この技術は、開発後、ミトコンドリア生物学の研究者が、ミトコンドリアの電子輸送活性の理解とミトコンドリア病患者への影響を再評価する道を開きました。

この手順に続いて、HPLC、質量分析法、電子顕微鏡法、パッチクランプなどの他の方法を実行して、単離されたタンパク質複合体の分子組成、構造、電気生理学的特性などの追加の質問に答えることができます。