血管視覚化のためのDiI灌流 Ambystoma mexicanum

この手順の全体的な目標は、ウーパールーパーの血管系を視覚化することです。この方法は、ウーパールーパーの再生組織の血行再建術の複雑さに関する再生医療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この血管可視化技術の主な利点は、動物のすべての血管を標準的な蛍光顕微鏡で簡単に画像化できることです。

この方法は、ウーパールーパーの四肢の再生に関する洞察を提供しますが、尾、心臓、目、えら、その他の臓器などの他の組織にも適用できます。ウーパールーパーの胸を開く前に、まずつま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認します。次に、外科用鉗子を使用して、胸の中心軸に沿って、肩のラインのすぐ下にある皮膚をつまみます。

メスを使用して、皮膚が引き上げられている場所に切開を行い、胸の上の正方形の皮膚のパッチを取り除き、2つの軟骨プレートを明らかにします。次に、胸腔の上に窓を開き、主要な血管を切らずに結合組織を慎重に引き裂きます。鉗子を使用して各軟骨プレートを個別に持ち上げ、手術用ハサミで各プレートを切除します。

露出した心膜を鉗子で慎重につまみます。組織を引き上げ、手術用ハサミで穿刺し、心臓を傷つけずに心膜を取り除くのに十分な深さまで。次に、心膜をそっと取り外して心臓と大動脈を露出させ、心臓から分岐した大動脈の約5ミリメートルで心臓をはっきりと見ます。

ウーパールーパーを灌流するには、発泡スチロールフレームの隣にバタフライ針を装填したクランプスタンドを置き、クランプのアームを針の挿入のために簡単に操作できるようにします。蠕動ポンプをオンにして、ポンプチューブを通じて0.7x PBSを洗い流し、針先を吻側に向けます。鉗子を大動脈弓の下にスライドさせ、わずかに引き上げます。

次に、針が大動脈の長さに沿って動物の頭に向かって走るように、針クランプの組み合わせを操作し、針を大動脈に約5ミリメートル挿入し、鉗子を大動脈の後ろに保持して支持します。挿入の成功は、心臓心房の目に見える拡大によって確認できます。1つの心房をすばやく裂傷し、血液が排出されるのを待ちます。

次に、ウーパールーパーに約20〜30ミリリットルのPBSを灌流します。灌流が成功すると、動物の色は淡いピンクから白に変わります。すべてのPBSが灌流されたら、蠕動ポンプを一時停止し、チューブの自由端を15ミリリットルのDil溶液チューブに移動します。

チューブに気泡が発生しないように注意しながら、ポンプを再起動し、作業中のディルストック全体で動物を灌流します。灌流が成功すると、ウーパールーパーは鰓で最も目立つ明るいピンク色に変わります。すべてのディルが灌流されたら、ポンプを一時停止し、チューブの自由端を4%パラホルムアルデヒド溶液に入れます。

次に、ポンプを再起動し、少なくとも10ミリリットルの固定剤を灌流します。パラホルムアルデヒドを全て投与したら、ポンプを停止し、針を抜いてください。ウーパールーパーをプラスチック皿に移し、皿を蛍光顕微鏡ステージに置きます。

次に、ライトをオフにして、赤オレンジ色の光を発するDilの励起を許可するフィルターを選択します。灌流が成功すると、Dil染色は、尾、手足、えら、目を含むすべてのウーパールーパー組織に赤い入場信号として見えます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば1時間で完了することができます。

この手順を試みるときは、胸腔を開くときに主要な血管や心臓を裂かないように注意すること、および大動脈に沿って針を挿入して貫通穿刺を防ぐことを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、骨格の準備などの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、生物医学分野の研究者がさまざまな種の血管系を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、カルボシアニン染料Dil.針やパラホルムアルデヒドでの作業は非常に危険であり、適切な個人用保護具を着用するなどの予防策を講じる必要があることを忘れないでください。