Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

この技術の全体的な目標は、シアル酸の発現が変更された細胞または細胞由来の製品を生成することです。したがって、細胞はN-アシル修飾マンノサミンで処理され、N-アシル修飾マンノサミンは対応するシアル酸に代謝され、続いて細胞表面に発現します。この方法は、受容体-リガンド相互作用に対する複合糖質への影響など、糖鎖生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、適用が簡単で、純粋に細胞毒性があることです。代謝糖質工学を実証するために、市販のN-アセチルマンノサミンを使用します。さらに、N-プロピオニルとN-ブタノイルマンノサミンの合成と使用を実演します。

ポリシアル酸の発現に対する代謝糖質工学の生物学的影響が示されています。まず、431.2ミリグラムの塩酸マンノサミンを、攪拌棒が入った15ミリリットルのガラス瓶に3ミリモルナトリウムメトキシド溶液の10ミリリットルに溶かします。氷の上で混合物を摂氏0度に冷却します。

攪拌しながら、210マイクロメートルの塩化プロピオニルを溶液にゆっくりと滴下します。次に、攪拌混合物を摂氏0度で4時間インキュベートします。これに続いて、溶液を50ミリリットルのプラスチックチューブに移し、細い針でチューブのキャップに4〜8個の穴を突き刺します。

液体窒素を使用して溶液を急速凍結します。次に、サンプルが完全に乾くまで凍結乾燥します。凍結乾燥後、乾燥製品を酢酸エチル、メタノール、水に溶解します。

ピペットを使用して、事前に調製したシリカゲルカラムに溶液をロードします。500ミリリットルの溶媒を溶出した後、4ミリリットルの画分を回収します。溶出した画分を15ミリリットルのプラスチックチューブに移し、細い針でチューブのキャップに3〜6個の穴を開けます。

溶液を液体窒素で凍結した後、サンプルが完全に乾くまで凍結乾燥します。Kelly神経芽腫細胞をRPMI培地で摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。マンノサミンを適用する前に、Kelly 神経芽細胞腫細胞をトリプシンおよび EDTA と 10 分間インキュベートして分離します。

RPMI培地でトリプシンを中和した後、ノイバウアーチャンバーを使用して細胞をカウントします。シアル酸単糖を測定するには、細胞を500マイクロリットルの培地に48ウェルの組織培養プレートに入れます。ポリシアル酸の分析では、直径6cmの細胞培養皿に細胞を3ミリリットルの培地にセットします。

RPMIに溶解したそれぞれのマンノサミン誘導体を、最終濃度5ミリモルで新たに播種した細胞に加え、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、N-アシル修飾マンノサミンを含む培地を24時間ごとに交換します。処理後、培地をデカントし、細胞をPBSで洗浄します。細胞をトリプシンおよびEDTAと10分間インキュベートして、細胞を剥離します。

分離した細胞に同量の細胞培養培地を添加することにより、トリプシンを中和します。これに続いて、分離した細胞を15ミリリットルのプラスチックチューブに移します。サンプルを500倍Gで3分間遠心分離し、上清を捨てた後、細胞を5ミリリットルのPBSで3回洗浄します。

遠心分離後、回収した細胞ペレットを500マイクロリットルの氷冷HPLC溶解バッファーに再懸濁します。超音波プロセッサ針でサンプルを中高振幅で30秒間3回超音波処理し、サイクル間で少なくとも1分間氷上でサンプルを冷却します。溶解した細胞サンプルを遠心分離した後、1.5ミリリットルのプラスチックチューブ内の膜画分から上清を分離します。

酸加水分解の場合は、分離した膜画分に1モルTFA溶液150マイクロリットルを加えます。サンプルを摂氏80度で4時間インキュベートし、200〜600RPMで振とうします。次に、サンプルを3キロダルトンの排除膜を備えた0.5ミリリットルのフィルターチューブに輸送します。

上相の容積が20マイクロリットル未満になるまで、Gおよび摂氏21度で約30分間サンプルを遠心分離します。これに続いて、インサートを廃棄し、細い針で限外濾過液を含むチューブのキャップに2〜4個の穴を開けます。サンプルを液体窒素で凍結した後、一晩凍結乾燥します。

乾燥したサンプルを10マイクロリットルの120ミリモルTFA溶液に再懸濁し、50マイクロリットルのDMB溶液を追加します。サンプルを暗い1.5ミリリットルのチューブに移して、紫外線から保護します。細胞膜サンプルと標準試料を56°Cで1.5時間インキュベートします。

インキュベーション後、4マイクロリットルの400ミリモル水酸化ナトリウム溶液を各サンプルに加えて、標識反応を停止します。HPLC分析では、カラムの温度を摂氏40度に設定し、蛍光検出器を励起用に373ナノメートル、省略用に448ナノメートルにそれぞれ構成します。10マイクロリットルのサンプル容量を注入し、メタノール、アセトニトリル、および水を溶離剤として、毎分0.5ミリリットルの流量でプローブを15分間分離します。

質量分析では、収集した各HPLCサンプルの20マイクロリットルをLC質量選択検出器システムに注入します。LC 質量選択性検出器システムの評価ソフトウェアで、トータルイオンクロマトグラムで目的のピークを選択します。分離されたピークの質量スペクトルを表示し、300 から 700 の間の正の質量電荷比を表示します。

1ミリリットルのウェスタンブロット溶解バッファーを、以前に調製した糖鎖改変細胞のペレットに加え、ボルテックスします。サンプルを氷上で30分間インキュベートし、5分ごとにボルテックスします。これに続いて、サンプルを20, 000倍のGおよび摂氏4度で1.5時間遠心分離します。

次に、溶解した細胞からタンパク質を含む上清を1.5ミリリットルのチューブに集めます。各タンパク質画分の90マイクロリットルに10マイクロリットルのLaemmliサンプルバッファーを添加して、SDSページ用のサンプルを調製します。サンプルを5分間煮沸します。

サンプルを8%SDS-アクリルアミドゲルにロードした後、ゲルを25ミリアンペアで室温で2時間分析します。終了したら、ガラスカバーをゲルから慎重に取り外し、ローディングポケットを含むゲルの上部を切り取ります。次に、ウェスタンブロットバッファーにあらかじめ浸しておいた0.2μニトロセルロースメンブレンにゲルを敷きます。

システムの推奨に従ってタンパク質をニトロセルロースに移します。ブロッティングシステムからニトロセルロースメンブレンを除去した後、ブロットをPonceau redで染色してタンパク質を可視化し、転写の品質を制御します。次に、ニトロセルロースメンブレンをプラスチックチャンバーに移し、10ミリリットルのブロッキング溶液を追加します。

ニトロセルロースメンブレンをインキュベートした後、ブロッキング溶液をデカントし、モノクローナル抗ポリシアル酸735抗体をPBSに添加します。インキュベーション後、メンブレンをPBSで少なくとも3回、5分間洗浄します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したポリクローナル抗マウスIgG二次抗体をニトロセルロースメンブレンに添加します。

メンブレンをインキュベートして洗浄した後、適切なイメージャーのプレートに移します。次に、製造元の指示に従って信号を検出します。N-グリコリルノイラミン酸を標識したDMBは、7〜9分で溶出します。

また、DMB標識N-アセチルノイラミン酸は10〜12分で溶出します。クロマトグラムで観察されたいくつかの小さなピークは、未反応の DMB および反応中間体を表しています。細胞ライセートのHPLCクロマトグラムは、細胞ライセート中に存在する他のαケト酸との反応による内部不純物やDMB副産物を表すいくつかの未定義のピークを示しています。

N-アセチルマンノサミンによる治療は、しばしば細胞表面のN-グリコリルノイラミン酸の枯渇につながります。N-プロピオニルノイラミン酸またはN-ブタノイルノイラミン酸で処理した溶解細胞のクロマトグラムでは、対応する非天然シアル酸の出現を示すピークが観察されます。DMBとシアル酸種との反応により、この色素で標識されていないシアル酸種と比較して、分子量が116.2ダルトン増加します。

増強されたイオン種に加えて、ナトリウム付加体も観察されます。DMB-Neu5Gc は、未反応または部分的に反応した DMB 分子種の直後に溶出するため、DMB-Neu5Gc の質量スペクトルに未定義のピークが出現します。N-プロピオニルマンノサミンまたはN-ブタノイルマンノサミンによるケリー神経芽腫細胞の治療は、細胞表面でのポリシア酸の発現を低下させる。

一方、N-アセチルマンノサミンによる治療は、ポリシア酸の発現を増加させます。この技術を適用することで、完全なシアル化をした細胞を数日以内に作製することができます。このような糖鎖改変細胞は、さらなる実験に使用することができます。

例えば、受容体-リガンド相互作用を研究するため、またはここに示すように、ポリシア酸の発現を阻害するためです。ここで紹介する代謝工学の手順は、シアル酸実験に最適化されています。しかし、動物実験でも同様の手順を用いることができます。

私たちが提示したプロトコルとこのビデオ制作が、著者が代謝糖質工学を研究室に持ち込み、生物学的システムにおけるシアル酸およびシアル酸受容体の機能と生物学的役割を分析するのに役立つことを願っています。有機化学者は、より複雑な構造を持つN-アシル修飾マンノサミンを合成し、私たちのプロトコルで提案されているようにこれらを使用することができます。当社のプロトコルに従って、すべてのサンプルは蛍光標識後すぐに分析する必要があります。

したがって、HPLCとACMSアナライザーの間に遅延はありません。