Name: Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶN-アシル修飾マンノサミンを用いた代謝糖鎖工学による細胞表面シアル酸修飾法。この簡便で非細胞毒性の手法は、糖鎖相互作用と受容体-リガンド動態の研究に有用です。

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原稿の校正と有意義な議論の l. d. グエンに感謝しますさらに、j. Dernedde、h. g. グエンは、ビデオ撮影を準備して私たちを助けるを感謝いたします。ビデオのほとんどのシーンは、r ・ タウバーの所で撮影されました。また、マックス ・ プランク コロイドおよびインターフェイスとの質量分析法の施設への無料アクセスをくださったことを感謝いたします。RH は、DFG (ProMoAge) によって支えられました。

1. バッファーおよび試薬の調製
<ol><li>
3 mM ナトリウムメトキシド溶液の調製
	<ol>
<li>攪拌棒 100 mL 瓶 50 mL のメタノール (3 mM) で 8.1 mg ナトリウムメトキシドを溶かしてください。数週間室温 (RT) で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
トリス塩酸バッファーの準備
	<ol>
<li>攪拌棒と 8.766 g 塩化ナトリウム, 157 mg トリス-HCl, 146 mg 100 mL ガラス瓶の中の EDTA を組み合わせるし、80 mL の水に溶かします。</li>
		<li>PH メーターで pH を観察しながら攪拌溶液中に水酸化ナトリウム (水 1 M) または HCl (水の場合は 20%) を追加し、8.0 pH を調整します。</li>
		<li>100 mL の最終的なボリュームを達成するために必要な水の量を追加します。0.22 μ m の滅菌フィルター システムを使用して、ソリューションをフィルター処理します。 注: 150 mM の NaCl、トリス-HCl、10 mM と 5 mM EDTA (pH 8.0) 100 mL トリス塩酸バッファーが含まれます。ソリューションは、数週間の 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アプロチニン溶液の調製
	<ol>
<li>水 (1.54 mM) 1 mL 中 10 mg アプロチニンを溶解します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ (各 100 μ L) x 10 にアプロチニン ソリューション。数週間-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leupeptin 溶液の調製
	<ol>
<li>水 2 mL (10 mM) で 10 mg leupeptin を溶解します。因数 leupeptin ソリューション 1.5 mL プラスチック チューブ × 10。数週間-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
特異 (PMSF) フッ化物溶液の調製
	<ol>
<li>34.8 mg PMSF 2 mL エタノール (100 mM) を解散します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ × 10 で PMSF ソリューション。数週間-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1, 2-ジアミノ-4, 5-methyldioxybenzol-塩酸 (DMB) 溶液の調製
	<ol>
<li>15.62 mg DMB、352 μ L β-メルカプトエタノール、および 48 μ L ナトリウム重亜硫酸塩溶液 (39%)、結合し、9.6 mL 水 (DMB 6.9 mM、500 mM β-メルカプトエタノール、0.19% ナトリウム重亜硫酸塩) を追加します。因数 1.5 mL プラスチック チューブ (各 250 μ L) x 40 で DMB ソリューション。数週間の-20 ° C で光から保護されたストア。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M トリフルオロ酢酸 (TFA) 酸溶液の調製
	<ol>
<li>100% の 770.3 μ L を追加 9.23 mL 水 15 mL プラスチック チューブ (1 M) に TFA。数週間の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
120 mM TFA 溶液の調製
	<ol>
<li>9.91 mL 水 (120 mM) 15 mL プラスチック チューブに 92.4 μ TFA (100%) を追加します。数週間の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
400 mM 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の調製
	<ol>
<li>160 mg 15 mL プラスチック チューブに 10 mL 水 (400 mM) で水酸化ナトリウムを溶解します。数週間の 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部のしみの換散バッファーの準備
	<ol>
<li>5.84 g, 塩化ナトリウム 0.1 g のトリス (ヒドロキシメチル) を溶解-aminomethan (Tris)、0.1 g CaCl2、0.95 g MgCl2、および 100 mL で 1 g トリトン X100 水し、7.8 に pH を合わせなさい。4 ° C でのストア換散バッファーを使用する前に各プロテアーゼ ・ インヒビター (アプロチニン、leupeptin、PMSF) の 100 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) バッファーの準備
	<ol>
<li>0.3 g のトリス、1.5 g のグリシン、0.1 g 水 100 mL に SDS を溶かし、7.3 に pH を調整します。室温ストア</li>
	</ol>
</li>
	<li>
西部のしみのバッファーの準備
	<ol>
<li>0.3 g のトリス、1.1 g グリシン 90 mL の水で溶解し、10 mL のエタノールを追加します。室温ストア</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ソリューションをブロックの準備
	<ol>
<li>25 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の無脂肪牛乳パワーの 1 g を溶解します。常に新鮮な準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ManNProp と関連Nの合成-アシル-Mannosamines を変更
<ol><li>431.2 mg マンノサミン塩酸 10 mL 3 mM ナトリウムメトキシド溶液攪拌棒の 50 mL のガラス瓶の中で溶解します。</li>
	<li>0 ° C の氷の混合物を冷却します。攪拌溶液中に徐々 に滴下 210 μ L プロピオニル塩化 (2.4 mmol)、または ManNProp または ManNBut、それぞれ合成する 248 μ L butanoyl 塩化 (2.4 mmol) を追加します。4 h の 0 の ° C で攪拌混合を孵化させなさい。</li>
	<li>50 mL プラスチック チューブにソリューションを転送します。細い針とプラスチック製のチューブのふたに 4-8 穴を突きます。液体窒素を使用して、ソリューションを急速に凍結し、その後 (凍結乾燥) を凍結乾燥 48 時間またはそれが完全に乾燥しているまで。</li>
	<li>ミックス 350 g シリカゲル 60 750 mL エチル酢酸/メタノール/水 (15:2:1) (これは懸濁液)。シリカゲル 60 サスペンションからす柱 (直径 35 mm、長さ 70 cm) を記入し、使用する前に準備ができて、追加の 100 mL のエチル酢酸/メタノール/水 (15:2:1) を洗い流します。</li>
	<li>ステップ 2.3 から乾燥製品を溶解 (5 g の乾燥品) 10 mL のエチル ・酢酸/メタノール/水 (15:2:1) と負荷、シリカにピペットを使用してゲルの列。(ManNProp) のため、500 mL の後に 4 mL の一部分を収集します。注: ManNBut は、700 mL の後でおよそ列から溶出されます。</li>
	<li>15 mL プラスチック チューブに溶出画分を転送します。細い針とプラスチック製のチューブのふたに 3-6 穴を突きます。急速凍結する液体窒素を使用して、ソリューションおよびその後、それが完全に乾燥するまでそれを凍結乾燥します。 注意: 凍結乾燥製品が数ヶ月室温保存できます。</li>
	<li>質量分析法 (セクション 9 を参照) による製品の純度を確認してください。 注: また、純度も確認できます1H 核磁気共鳴 (NMR)。</li>
</ol>3. 細胞培養
<ol><li>ケリー神経芽細胞腫細胞 10% 牛胎児血清、100 U ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg、2 mM L-グルタミン含む 5 mM ManNAc、ManNProp、5 mM または 5 mM ManNBut、37 ° C、5% CO2培ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI)。 注: ManNAc やその類縁体のない培地で培養された細胞は、コントロールとして使用されます。</li>
	<li>
Mannosamines のアプリケーションの前にそれらをトリプシン/EDTA (0.25%、0.02%、PBS) で 10 分間インキュベートしケリー神経芽細胞腫細胞をデタッチしてノイバウアー商工会議所またはセルのカウンターを使用してカウントします。プレート/皿のサイズに基づいて定義された数字で細胞を播きます。
	<ol>
<li>シアル酸糖を測定するには、48 ウェル培養プレートに 500 μ L 中 1 x 10 の5セルをシードします。ポリシアル酸の分析、6 cm 径細胞培養ディッシュ上に 3 mL の培地で 1 x 10 の6セルをシードします。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。メディアのすべての 24 h を交換してください。 メモ: MGE の効果は治療の合計時間を増加します。高い代謝効率の 5-7 日のセルを扱います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
治療後、培地をデカントします。PBS でプレート/皿を洗います。それらをトリプシン/EDTA (0.25%、0.02%、PBS) で 10 分間インキュベートし、細胞をデタッチします。剥離細胞を細胞培養液の同じボリュームの追加によってトリプシンを中和します。15 mL プラスチック チューブに剥離細胞を転送します。500 x g で 3 分のサンプルを遠心し、上澄みを廃棄します。
	<ol>
<li>5 mL の PBS と遠心載荷セル (ステップ 3.3 を参照) を追加します。さらに 2 回洗濯の手順を繰り返します。 注: 清せず洗浄細胞ペレットは-20 ° C で数日間保存できます。ポリシアル酸の発現を解明する場合は 10 に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 高速液体クロマトグラフィー分析のためのセル換散
<ol><li>
高速液体クロマトグラフィーの換散バッファーの準備
	<ol>
<li>5 mL トリス塩酸バッファー、5 μ L アプロチニン ソリューション、20 μ L leupeptin ソリューション、および 50 μ L PMSF ソリューションを組み合わせます。 注: 5 mL の HPLC の換散バッファーは 150 mM の NaCl、10 mM 5 mM EDTA、トリス-HCl 1.54 μ M アプロチニン、40 μ M、Leupeptin、1 mm PMSF (pH 8.0)。セル換散の前に新鮮なこのバッファーを準備する必要があります常に。</li>
	</ol>
</li>
	<li>再 500 μ L 冷たい HPLC 換散バッファーに収集した細胞ペレット (ステップ 3.3) 各を中断し、超-超音波サンプル超音波プロセッサ針で 3 倍の 30 の期間中-高振幅で s。サイクルの間に、少なくとも 1 分の氷のサンプルを冷却します。</li>
</ol>5. 膜分画の分離
<ol><li>遠心分離機の分離細胞サンプル 20,000 × g と 4 ° C で 2 時間1.5 mL プラスチック チューブでのゾル性細胞質蛋白質を表す上清 (約 480 μ L) で区切ります。これらの画分は、例えばブラッドフォードまたはビシンコニン酸 (BCA) 試金を使用してのタンパク質濃度を決定します。 注: 細胞質画分のタンパク質濃度 (約 1 mg/mL) は、尊敬されるシアル酸種の測定量を後関連することができます。ペレットは、6.1 のステップで使用される膜画分を表します。</li>
</ol>6. 酸性加水分解
注: オリゴ ・細胞膜多糖類は単糖類に加水分解します。さらに、可能な限りO-同様な糖に変更が加水分解します。膜画分におけるシアル酸の圧倒的多数は複合糖質に組み込まれている自然とOを負担する可能性があるかもしれないので、これは定量的な HPLC 分析に必要な-アセチルまたはO- lactolyl 変更。
<ol><li>150 μ L 1 M 追加分離膜の一部分 (セクション 5 からペレット) に TFA 溶液。200-600 rpm で振とうしながら 80 ° C で 4 時間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>20,000 x g および上部の段階の容積はより小さい 20 μ L まで 3 kDa 除外膜 0.5 mL フィルター チューブを使用して 21 ° C で約 30 分のサンプルを遠心します。 注: この手順は、高い分子破片を処分することが重要です。</li>
	<li>小さい分子、2 mL プラスチック チューブにシアル酸種を含むを含む下の相を転送します。細い針とプラスチック製のチューブのキャップに 2-4 穴を突きます。急速凍結する液体窒素を使用してサンプルとそれらを一晩凍乾します。 注: 長期保管のための RT。 置換の穴なしキャップで数日間乾燥のサンプルを格納できます。</li>
</ol>7. 蛍光ラベリング
<ol><li>10 μ L 120 mM TFA 溶液の再乾燥のサンプルを中断し、50 μ L DMB ソリューションを追加します。紫外線からそれらを保護するために暗い 1.5 mL チューブにサンプルを転送します。</li>
	<li>基準、1 μ L を解散 Neu5Ac (60 ng/mL、水で) または 1 μ L Neu5Gc (60 ng/mL、水) 暗い 1.5 mL チューブに 10 μ L 120 mM TFA 溶液中。50 μ L の DMB のソリューションを追加します。</li>
	<li>細胞膜のサンプルをインキュベートし、56 ° C で 1.5 h の基準は、光から保護します。インキュベーション後、標識反応を停止するには、各サンプルに 4 μ L 400 mM NaOH 溶液を追加します。</li>
</ol>8. HPLC 分析
注: ラベル サンプル RP C18 カラムと HPLC 装置の分析 (110 Å、3 μ m の粒子径、4.6 × 150 mm)、蛍光検出器とほんの一部のコレクター。使用される溶媒はメタノール、アセトニ トリル、水です。高速液体クロマトグラフィー システム内部脱がない場合、測定する前にすべての溶剤ガスを抜き確認します。
<ol><li>列の温度を 40 ° C に設定し、373 の蛍光検出器を構成する励起と 448 nm nm 発光、それぞれ。10 μ L の試料の注入、メタノール/アセトニ トリル/水 (6:8:86) 溶離液で 0.5 mL/分の流量で 50 分のプローブを区切ります。質量分析のための関心のピークを収集します。 注: Neu5Gc は 6-8 分、9-12 分、17-23 分後 Neu5Prop、38-44 分後 Neu5But 後 Neu5Ac 後溶出する予定です。分別されたサンプルは、光から保護 4 ° C でいくつかの時間保存できます。</li>
	<li>各サンプルを測定した後にメタノール/アセトニ トリル/水 (6:25:69) 1.0 mL/min の流量 (≈ 1.5 列ボリューム) に 7.5 分の列を洗って、メタノール/アセトニ トリル/水 (6:8:86) で 1.0 mL/分の流量で 7.5 分のシステムを再平衡します。</li>
	<li>定量分析、それぞれの HPLC システム22のオペレーティング ソフトウェアを使用して興味のシアル酸のピークの曲線下の領域を計算します。 注: Neu5Ac または Neu5Gc 標準および細胞質画分 (5.1 項を参照) で測定されたタンパク質の濃度は、得られたデータが関連付けることができます。</li>
</ol>9. シアル酸糖の質量分析
注: 特定の HPLC 保持ピークさらに分析できます液体クロマトグラフィー (LC) エレクトロ スプレー イオン化質量分析法 (MS)、によって不自然なシアル酸種を確認するために。
<ol><li>質量分析用 LC/質量選択検出器 (MSD) システムに 79.9% メタノール、20% イソプロピル アルコール溶離液、0.5 mL/分の流量、4 kV キャピラリー電圧キャピラリー温度を 350 ° C と 0.1% ギ酸との採取試料の 20 μ L を注入する.22,23。</li>
	<li>それぞれの LC/MSD システムの評価版ソフトウェア、総イオンのクロマト グラムの関心のピークを選択します。解決のピークの質量スペクトルを表示します。300 と 700 の間の正の質量/電荷比を表示します。 注: DMB は、シアル酸のラベリング 116.2 g/mol の分子量の増加に します。シアル酸の DMB ラベル種次の分子固まりがある: DMB Neu5Ac = 424.2 g/mol、DMB Neu5Gc 441.8 g/mol、DMB Neu5Prop を = = 436.2 g/mol、DMB Neu5But 453.2 g = 付加体のモル共通/アセトニ トリル、ナトリウム、またはイソプロピル アルコール。</li>
</ol>10 ケリー神経芽細胞腫細胞におけるポリシアル酸西部のしみの分析
<ol><li>
セル lysates の準備
	<ol>
<li>ステップ 3.3 と渦から細胞ペレットに 1 mL の西部のしみの換散バッファーを追加します。氷の上で 30 分間インキュベートします。渦 5 分ごと。遠心分離機の 20,000 × g と 4 ° C で 1.5 h のサンプル分離細胞からタンパク質を含む上清を収集します。</li>
		<li>蛋白分画、例えば、ブラッドフォード、BCA アッセイのタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度は 1.5 μ g/μ L の換散バッファーのサンプルを希釈します。</li>
		<li>90 μ L タンパク質画分 (1.5 μ g/μ L) を 10 μ L 塩化物イオン サンプル バッファーを追加して SDS ページのサンプルを準備し、沸騰 5 分24サンプルです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
免疫ブロット
	<ol>
<li>20-30 μ L ポケットと 0.75 または 1 mm 厚 8 %sds アクリルアミドゲルを使用します。25 でゲルを実行室温 2 時間 mA</li>
		<li>ゲルからガラス ・ カバーを慎重に取り外します。カットし、読み込みポケットを含んでいるゲルの上の部分を破棄します。西部のしみバッファーに浸した (0.2 μ m)、ニトロセルロース膜にゲルを配置します。システム (例えば250 4 ° C で 1 時間の mA) の推薦によると硝酸セルロースに蛋白質を転送します。</li>
		<li>しみが付くシステムからニトロセルロース膜を削除します。Ponceau としみを汚れ蛋白質を視覚化する赤。プラスチック製チャンバーに硝酸セルロースの膜を転送し、解決を妨げる 10 mL を追加します。室温で 1 時間インキュベートまたは 4 ° C で一晩</li>
		<li>ブロッキング液をデカントし、PBS にモノクローナル抗 polySia 735 抗体 (1 μ g/mL) を追加します。RT で 1 h の膜を孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩インキュベーション後、少なくとも 3 回 PBS で 5 分間膜を洗浄します。</li>
		<li>ポリクローナル抗マウス igg 抗体二次抗体 (1 μ g/mL) は、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) または PBS の蛍光ラベルに結合を追加します。室温 1 時間膜をインキュベートします。インキュベーション後、少なくとも 3 回 PBS で 5 分間膜を洗浄します。</li>
		<li>適切な撮像素子のプレート上に膜を転送します。製造元の指示に従って信号を検出します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

化学的に合成された ManNAc 誘導体、ManNProp と ManNBut は質量分析器で分析し、両方の標本の正しいの質量ピークのみが識別必要があります。したがって、製品は、99% 以上の純度をあると仮定することができます。Neu5Gc は、ひと細胞29が存在しない通常の少量は、分離細胞の膜画分に検出されます。これは最も可能性の高いメディア30のウシ胎児血清 sialoglycoconjugates から Neu5Gc は募集サルベージ経路を介して行われます。ManNAc、シアル酸生合成の自然な前駆体と治療は、細胞表面に Neu5Gc エピトープ発現を大幅に低減します。
変更された mannosamines の適用は僅かところすべて細胞に有毒であります。セルは、 Nacylmannosamines 特定のトランスポーターがないので、必要が媒体の内で増加した millimolar 糖濃度を受け入れます。シグナル伝達経路はN- acylmannosam...

シアル酸は、 N- O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非還元テルミニでは見つけることができる通常単糖類です。すべての単糖の中でシアル酸はいくつかのユニークな化学的特性を持っています。C-5 位置にラジカルアニオンの下でそれにより負荷電の生理的条件、C-1 位のカルボン酸基とアミノ機能 9 C 原子のバックボーンがあります。50 以上の自然発生するシアル酸の亜種が日1に特徴付けられる人間は、シアル酸の優勢な形態はNアセチルノイラミン酸 (Neu5Ac)。他の哺乳類はまた、 N‐ グリコリルノイラミン酸 (Neu5Gc)2,3の多量を表現します。
複合糖質の露出した場所にあるためシアル酸など4ホスト細胞にインフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン依存結合受容体-リガンド相互作用の茄多が関係します。特に胚発生中や神経系の重要な生物学的機能を持つシアル酸エピトープはポリシアル酸です。ポリシアル酸は、最大 200 のアルファ 2, 8 リンク シアル酸の高分子です。ポリシアル酸の主要な蛋白質のキャリアは神経細胞接着分子 NCAM です。ポリシアル酸の発現はポリシアル酸式密着性を減少、増加する可塑性神経系5NCAM の接着性を調節します。
(ポリ) シアル酸の発現の変化は最終的に異なる生物間相互作用の多数に影響を与えます。これは、知られているシアル酸分子レベルで、新規複合糖質の相互作用を明らかにしたり、可能な治療上のアプローチを探るに依存するプロセスを研究に使用できます。ある異なる方法利用、細胞表面のシアル酸の発現を変調することができます、シアル酸特定グリコシダーゼ (シアリダーゼ)6 シアル酸生合成に関与する酵素の阻害による治療例 ,7、8、ノックダウンやシアル酸生合成9の鍵酵素の式を変更します。
シアル酸の発現を調節する別の汎用性の高い方法は、MGE (オリゴ糖とも呼ばれる代謝工学、萌え) です。ここで、細胞、組織、またはさらには動物は、C2 アミノ変更に耐える ManNAc の非天然誘導体と扱われます。細胞内取り込み後シアル酸の前駆体分子であること、これら ManNAc アナログ方向非自然代謝シアル酸、還元末端糖で表すことができます。ManNProp または ManNBut、 N- propionylneuraminic 酸 (Neu5Prop) や複合糖質10代でN- butanoylneuraminic 酸 (Neu5But) を組み込むかなど脂肪族 C2 の変更を運ぶ ManNAc 誘導体で処理した細胞,11ManNAc の C2 位置に導入された機能グループを使用して、発生する非天然型シアル酸が結合することができます、例えば、シュタウディンガー結紮またはアジ化 alkine 環、蛍光染料で、したがって。セルの表面12上で可視化します。
これらの非天然型シアル酸の発現は感染症病原体、密着性腫瘍細胞、一般的な細胞接着、血管新生、分化 (校閲用の移行など多くの生物学的プロセスに興味をそそられる効果参照してください: Wratilら13) です。 nMGE 興味深いことに、-変更アシル mannosamines ポリシアル酸の発現に干渉する使えます。ポリシアル酸は、2 つの異なる polysialyltransferases (ST8SiaII ・ ST8SiaIV) によって生成されます。それは、その polysialyltransferase ST8SiaII、ManNProp または ManNBut14,15などの不自然なシアル酸前駆体によって抑制される実証されています。さらに、ManNProp または ManNBut のアプリケーションがシアル化による全15も減少させることにはひと神経芽腫細胞で実証されてそれ。
NMGE-アシル変更 mannosamines は簡単に使用されています、だけでなく哺乳類の種,線虫16などの全体の動物においても細菌細胞培養法を適用するにはゼブラフィッシュ17、またはマウス18,19,20,21。僅か細胞毒性、細胞培養液や血漿中 millimolar 濃度でも、特に ManNAc デリバティブ脂肪族の修正、ManNProp、ManNBut などの軸受です。さらに、彼らは比較的容易に合成です。
ここで、 nMGE を使用する方法の詳細を提供-アセチル変更 mannosamines。最初に、2 つの ManNProp と ManNBut、この分野で最も広く使用されている ManNAc 誘導体の化学合成を説明します。次に、生体内で実験の MGE の適用方法を示します。例として、神経芽細胞腫細胞株ケリー ポリシアル エピトープの発現の低下を実証する西によって選ばれた ManNAc 誘導体投与後のしみ。細胞表面に非天然型シアル酸は高速液体クロマトグラフィーによる定量化され、さらに質量分析器で分析されました。

<table><tbody><tr><td>細胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml 組織培養フラスコ</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE機器(タンク、ガラス器具など、機械</td><td>VWR</td><td>SDS ゲル/ブロット</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質ラダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロー</td>ス <td>GE ヘルスケア</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>ポンソー レッド</td><td>ロス</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>粉乳</td><td>ロス</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>ミリポア</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 遠心フィルター ユニット 3 kDa 膜</td><td>メルク ミリポア</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離チューブ付き</td><td>Sigma-Aldrich(コーニング)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLCグラジエントグレード</td></tr><tr><td>4,5-メチレンジオキシ-1,2-フェニレンジアミン二塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48ウェル、平底組織培養プレート</td><td>Sigma-Aldrich(コーニング)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離管</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC グラジエントグレード</td></tr><tr><td>アプロチニン ウシ肺由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>凍結乾燥粉末、3-8 TIU/mg 固体</td></tr><tr><td>塩化ブチリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18RPカラム</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &Aring;, 3 &micro;m 粒子サイズ、4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-マンノサミン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝塩溶液</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>ギ</td>酸 <td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>塩酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%、水中</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC グラジエントグレード</td></tr><tr><td>N-アセチル-D-マンノサミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルノイラミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-グリコリルノイラミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>塩化プロピオニル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>セーフロックチューブ 1.5 mL 琥珀色 (光保護)</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock チューブ 1.5 mL 無色</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム重亜硫酸水素塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%、水中</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M、水中</td></tr> ナトリウム<tr>メト<td>キシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 0.25 %/EDTA 0.02 % PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC グラジエントグレード</td></tr><tr><td>シリカゲル 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-MSD-システム</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-mannosamines を変更

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

シアル酸 (Sia) は、 N- O型糖鎖や糖脂質などの複合糖質の非常に重要な成分です。オリゴ糖類とユニークな化学特性の非還元テルミニで地位によるシアル酸は異なる受容体-リガンド相互作用の多数にかかわる。変更すると細胞表面のシアル酸の発現、シアル酸依存性相互作用は影響その結果。これはシアル酸依存性相互作用を調査する役に立つことができる、有益な方法である特定の病気に影響を与える可能性があります。代謝独自 (MGE)、を介して細胞表面のシアル酸の発現を調整できます。ここで、C2 変更誘導体のN- acetylmannosamine (ManNAc) 細胞、組織、または全体の動物が扱われます。これらのアミノ糖シアル酸前駆体分子として従って対応するシアル酸種に代謝され、複合糖質の表現。このメソッドを適用すると、様々 な生物学的プロセスに興味をそそられる効果が生成されます。たとえば、ポリシアル酸 (polySia) 処理の神経細胞での発現を大幅に削減することができ、こうして神経細胞の増殖と分化に影響を与えます。ここで、 N- butanoylmannosamine (ManNBut)、およびN- propionylmannosamine (ManNProp) 最も一般的な C2 変更N- アシルマンノサミン誘導体の 2 つの化学合成を紹介し、さらにどのようにこれらの非天然を表示アミノ糖は、細胞培養試験において適用できます。変更されたシアル酸種の式は高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による定量化、さらに質量分析器で分析されました。ポリシアル酸の発現に及ぼす影響は、市販ポリシアル酸抗体を用いたウエスタンブロットによって解明します。

ラベル Neu5Ac Neu5Gc 規格蛍光灯の HPLC クロマト グラムを図 2で描かれています。ここに記述されたメソッドを使用すると、地上波 DMB ラベル Neu5Gc 通常た 7-9 分溶出時間と DMB Neu5Ac 10-12 分の間。クロマト グラムのいくつかのより小さいピークは通常 2-6 分間表示されます。これらのピークは、未反応の DMB を表し、反応中間体25。
セル lysates の代表的なクロマト グラムを図 3に示します。地上波 DMB ラベル基準 (図 2) のクロマト グラムと比較してこれらのクロマト グラムでいくつかの未定義のピークが表示されます。これはセル lysates の DMB はシ...

シアル酸は、典型的な単糖単位の複合糖質は、です。分子と細胞の相互作用の茄多になっています。代謝独自のN- acetylmannosamine 誘導体を用いた細胞表面のシアル酸の発現を変更する方法をご紹介します。

Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

この手法の全体的な目的は、シアル酸の発現を改変した細胞または細胞由来産物を生成することです。そのため、細胞をN-アシル修飾マンノサミンで処理し、これを対応するシアル酸に代謝させた後、細胞表面に発現させます。この方法は、糖鎖共役物が受容体-リガンド相互作用に及ぼす影響など、糖生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、適用が容易であり、純粋に細胞毒性を持つことです。代謝糖工学を実証するために、市販されているN-アセチルマンノサミンを使用します。さらに、N-プロピオニルマンノサミンおよびN-ブタノイルマンノサミンの合成と利用についても実証します。代謝性糖鎖工学がポリシアリル酸の発現に及ぼす生物学的影響を示します。まず、攪拌子を入れた15 mLのガラス瓶に、431.2 mgのマンノサミン塩酸塩と10 mLの3 mMナトリウムメトキシド溶液を入れ、溶解させます。この混合物を氷上で0 °Cまで冷却します。撹拌しながら、210 µm のプロピオニルクロリドを溶液にゆっくりと滴下して加えます。その後、撹拌した混合物を 0 °C で 4 時間インキュベートします。続いて、溶液を 50 mL プラスチックチューブに移し、細い針を用いてチューブのキャップに 4 ～ 8 個の穴を開けます。液体窒素を用いて溶液を急速凍結させます。次に、サンプルが完全に乾燥するまで凍結乾燥を行います。凍結乾燥後、乾燥した生成物を酢酸エチル、メタノール、および水に溶解させます。ピペットを用いて、あらかじめ調製したシリカゲルカラムに溶液をロードします。溶媒を500 milliliters溶出させた後、4 milliliterずつ分画して回収します。溶出した分画を15 milliliterのプラスチックチューブに移し、細い針でチューブのキャップに3〜6箇所の穴を開けます。液窒素で溶液を凍結させた後、サンプルが完全に乾燥するまで凍結乾燥させます。Kelly神経芽細胞腫細胞を、37°C、5%二酸化炭素の条件下でRPMI培地を用いて培養します。マンノサミンを添加する前に、TrypsinおよびEDTAで10分間インキュベートし、Kelly神経芽細胞腫細胞を剥離させます。RPMI培地でトリプシンを中和した後、ノイバウエル カウンティングチャンバーを用いて細胞数をカウントします。シアル酸モノ糖を測定する場合は、48ウェル組織培養プレートの各ウェルに500 µLの培地とともに細胞を播種します。ポリシアル酸の解析を行う場合は、直径6 cmの細胞培養ディッシュに3 mLの培地とともに細胞を播種します。RPMIに溶解させた各マンノサミン誘導体を、播種したばかりの細胞に最終濃度5 mMとなるように加え、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、N-アシル修飾マンノサミンを含む培地を24時間ごとに交換する。処理後、培地をデカンテーションして除き、PBSで細胞を洗浄する。TrypsinおよびEDTAを用いて10分間インキュベートし、細胞を剥離させる。遊離した細胞に同量の細胞培養基を加えてトリプシンを中和します。続いて、遊離した細胞を15 mLプラスチックチューブに移します。サンプルを500 ×gで3分間遠心分離します。上清を捨てた後、5 mLのPBSで細胞を3回洗浄します。遠心分離後、回収した細胞ペレットを500 µLの氷冷したHPLC溶解バッファーで再懸濁します。超音波処理装置のニードルを用い、中～高振幅で30秒間、計3回超音波処理を行い、各サイクルの間に少なくとも1分間、サンプルを氷上で冷却します。溶解した細胞サンプルを遠心分離した後、1.5 mLプラスチックチューブを用いて、上清と膜画分を分離します。酸加水分解を行うため、分離したメンブレン画分に1 M TFA溶液を150 µL加えます。サンプルを80 °Cで4時間、200〜600 RPMで振盪しながらインキュベートします。次に、サンプルを3 kDaカットオフメンブレンを備えた0.5 mLフィルターチューブに移します。サンプルを20,000 ×g、21 °Cで、上層の液量が20 µL未満になるまで約30分間遠心分離します。その後、インサートを取り除き、超ろ過液が入ったチューブのキャップに細い針で2〜4つの穴を開けます。液体窒素でサンプルを凍結させた後、一晩ライオフィライズ（凍結乾燥）します。乾燥させたサンプルを120 millimolar TFA溶液10 microlitersで再懸濁し、DMB溶液50 microlitersを加えます。紫外線から保護するため、サンプルを遮光1.5 milliliterチューブに移します。細胞膜サンプルと標準品を56 degrees Celsiusで1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、各サンプルに400 millimolarの水酸化ナトリウム溶液を4 µL加え、標識反応を停止させます。HPLC分析では、カラム温度を40 °Cに設定し、蛍光検出器の励起波長を373 nm、蛍光波長を448 nmにそれぞれ設定します。サンプルを10 µL注入し、メタノール、アセトニトリル、および水を溶出液として、流速0.5 mL/minで15分間プローブを分離させます。質量分析を行うため、回収した各HPLCサンプル20 µLをLC質量選択検出器システムに注入します。LC質量選択検出器システムの解析ソフトウェアを用いて、全イオンクロマトグラムの中から目的のピークを選択します。分離されたピークのマススペクトルを確認し、300から700の範囲の正の質量電荷比を表示します。あらかじめ準備しておいた糖鎖工学細胞のペレットにウェスタンブロット用溶解バッファーを1 mL加え、ボルテックスします。サンプルを氷上で30分間インキュベートし、5分ごとにボルテックスを行います。その後、サンプルを20,000 ×g、4 °Cで1.5時間遠心分離します。次に、溶出した細胞からのタンパク質を含む上清を1.5 milliliterチューブに回収します。各タンパク質分画90 microlitersにLaemmliサンプルバッファーを10 microliters添加し、SDS-PAGE用のサンプルを調製します。サンプルを5分間加熱し、沸騰させます。サンプルを8% SDS-アクリルアミドゲルにロードした後、室温で25 mAの電流を流し、2時間電気泳動を行います。終了後、ゲルからガラスカバーを慎重に取り除き、ウェルを含むゲルの上部を切り出します。次に、あらかじめウェスタンブロット緩衝液に浸しておいた0.2 µmニトロセルロース膜の上にゲルを置きます。システムの推奨に従って、タンパク質をニトロセルロース膜に転写します。ブロッティングシステムからニトロセルロース膜を取り出した後、ポンソー赤でブロットを染色し、タンパク質を可視化して転写の品質を確認します。その後、ニトロセルロース膜をプラスチックチャンバーに移し、10 millilitersのブロッキング溶液を加えます。ニトロセルロース膜をインキュベートした後、ブロッキング溶液を捨て、PBSに溶解したモノクローナル抗ポリシアリン酸735抗体を加えます。インキュベーション後、PBSで膜を5分間、少なくとも3回洗浄します。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼを標識したポリクローナル抗マウスIgG二次抗体をニトロセルロース膜に加えます。メンブレンのインキュベーションと洗浄後、適切なイメージャーのプレートに転写します。その後、製造元の指示に従ってシグナルを検出します。DMB標識N-グリコリルノイラミン酸は、7分から9分の間に溶出します。そして、DMB標識N-アセチルノイラミン酸は10分から12分の間に溶出します。クロマトグラムに見られるいくつかの小さなピークは、未反応のDMBおよび反応中間体を示しています。細胞溶解物のHPLCクロマトグラムにはいくつかの未定義のピークが見られますが、これらは内部不純物や、細胞溶解物中に存在する他のα-ケト酸とDMBとの反応による副産物を示しています。N-アセチルマンノサミンによる処理は、多くの場合、細胞表面のN-グリコールイルノイラミン酸の枯渇をもたらします。N-プロピオニルノイラミン酸またはN-ブタノイルノイラミン酸で処理した溶解細胞のクロマトグラムでは、対応する非天然シアル酸の出現を示すピークが観察されます。DMBとシアル酸種との反応により、この染料で標識されていないシアル酸種と比較して、分子量が116.2 dalton増加します。強力なイオン種に加えて、ナトリウム付加体も観察されます。DMB-Neu5Gcは、未反応または部分的に反応したDMB種とほぼ同時に溶出するため、DMB-Neu5Gcのマススペクトルに未定義のピークが現れます。Kelly神経芽細胞腫細胞をN-プロピオニルマンノサミンまたはN-ブタノイルマンノサミンで処理すると、細胞表面のポリシアル酸の発現が減少します。一方で、N-アセチルマンノサミンで処理すると、ポリシアク酸の発現が増加します。この手法を用いることで、数日以内に完全なシアリル化を施した細胞を生成することが可能です。このような糖鎖工学的に改変された細胞は、その後の実験に使用できます。例えば、受容体とリガンドの相互作用を研究する場合や、ここに示すようにポリシアル酸の発現を抑制する場合などが挙げられます。ここで提示する代謝工学の手順は、シアル酸の実験用に最適化されています。ただし、同様の手順を動物実験に適用することも可能です。本プロトコルとビデオ制作が、代謝糖鎖工学を研究室に導入し、生物学的システムにおけるシアル酸およびシアル酸受容体の機能と生物学的役割を解析する著者の方々の助けとなることを願っております。有機化学者は、より複雑な構造を持つN-アシル修飾マンノサミンを合成し、本プロトコルで提案した方法で利用することが可能です。本プロトコルに従い、すべてのサンプルは蛍光標識後、直ちに解析してください。その結果、HPLCとACMSアナライザーの間に遅延が生じないはずです。

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