ビオチン化細胞表面タンパク質の精製 Rhipicephalus microplus上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus上皮腸細胞からのビオチン化細胞表面タンパク質の精製。この研究では、修正されたPercoll勾配ベースの方法論を利用して、Rhipicephalus microplus腸組織から個々の上皮細胞を分離しました。表面結合タンパク質は、ストレプトアビジン磁気ビーズを介してビオチン化および精製され、ダウンストリームアプリケーションで利用されました。

半充血したRhipicephalus microplusからの腸上皮の解剖。以下の資料が必要です。ペトリ皿の底にダクトテープのストリップを接着します。

テープに瞬間接着剤を一滴加えます。ダニの腹側を下にして瞬間接着剤の上に置き、乾かします。ダニを100mLのPBSに完全に浸します。

サイズ11のメスを使用して、目の上部からダニの両側の下部の花綱にカットします。滅菌鉗子を使用して、胚盤と傍胴体を完全に取り除き、内臓を露出させます。細い白い糸状の臓器やその他の膜を取り除きます。

鉗子を使用して腸を取り出します。腸を氷冷したHBSSとPICで保存します。上皮細胞の解離。

以下の資料が必要です。解剖した腸を50mLのファルコンチューブ内の70ミクロンのセルストレーナーに注ぎます。ファルコンチューブ内に真空が発生する可能性があるため、フィルターを持ち上げて空気が循環できるようにします。

PIC入りの氷冷HBSS50mLで腸組織を洗い流します。PICを使用して、30 mLの氷冷HBSSに腸を再懸濁します。必要に応じて、滅菌スクレーパーを使用して腸の再懸濁を補助します。

500 gで遠心分離し、上清を取り除き、洗浄プロセスを3回繰り返します。腸細胞を10 mLのDMEM、2%FCS、5ミリモルEDTA、1ミリモルTCEPおよびPICに再懸濁します。

やさしく混ぜます。ローラーを使用して、ゆっくりと回転させ、摂氏37度で60分間インキュベートします。250ミクロンのセルストレーナーで懸濁液をろ過します。

流れを渦巻きます。そして、70ミクロンのセルストレーナーでろ過し、残りの流れを収集します。懸濁液を遠心分離します。

Percoll勾配を用いた単一上皮細胞の単離。以下の資料が必要です。AP15プレフィルターペーパーでろ過することにより、Milli-Q水で40%と20%のPercollを調製します。

滅菌シリンジにPercoll溶液をロードします。それをフィルターリグに適用し、Percollをゆっくりと排出します。グラディエントを重ねる前に、摂氏4度で1時間冷やします。

図のように蠕動ポンプをセットアップします。最低速度にセットしたペリスタルティックポンプを使用して、40%Percollを3 mLの超遠心チューブに3 mL重ねます。氷の上に15分間落ち着かせます。

ポンプの速度は、毎分1mL未満の流量につながるはずです。チューブを45度の角度に傾け、ペリスタルティックポンプを使用して、40%レイヤーの上に20%Percollを重ねます。液滴が下層と混ざらないように、出力チューブが遠心分離管に寄りかかっていることを確認してください。

ポンプの速度は、毎分1mL未満の流量につながるはずです。レイヤーを氷の上に15分間落ち着かせます。ペリスタルティックポンプを1分あたり1 mL未満の流速で使用して、単離された上皮細胞を含む3 mLのDMEM溶液を20〜40%Percoll勾配で層

液滴が下層と混ざり合って勾配が乱れるのを防ぐために、出力チューブが遠心分離管に寄りかかっていることを確認してください。600 gで10分間遠心分離します。DMEM、20%Percoll勾配、および20%40%Percoll勾配の間の間期を収集して、上皮性単一細胞を単離します。

細胞表面タンパク質のビオチン化とビオチン化表面タンパク質の単離。以下の資料が必要です。ビオチンタイプA標識キットを使用して、製造元の指示に従って100マイクロリットルの単一細胞上皮細胞をビオチン化します。

100マイクロリットルのPBS、1%Triton X-100、10%グリセロール、100マイクロモルの酸化グルタチオン、およびPICをビオチン化細胞に加えます。氷上で1時間インキュベートし、10分ごとに穏やかに混合します。細胞抽出物を摂氏4度で20,000gで20分間遠心分離し、脇に置きます。

1, 000マイクロリットルのTBS 1%Tween-20で洗浄することにより、50マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを準備します。指でフリックするようにしてやさしく混ぜます。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズをチューブの側面に集めます。

上清を取り除き、廃棄します。300マイクロリットルのビオチン化細胞表面タンパク質を洗浄した磁気ビーズと組み合わせます。撹拌しながら室温で2時間インキュベートします。

磁気スタンドでビーズを集め、上清を取り出して捨てます。300マイクロリットルのTBS 1%Tween-20をチューブに加え、穏やかに混合してビーズを再懸濁します。ビーズを集め、上清を取り除き、捨てます。

この洗浄手順を2回繰り返します。100マイクロリットルの1モルグリシンpH 2を磁気ビーズに加えます。そして、室温で5分間インキュベートします。

ビーズを採取し、溶出したビオチン化表面タンパク質を含む上清を除去します。図1は、ダニ全体から上皮細胞とその表面タンパク質を単離するために利用されたプロトコルの表現です。このプロトコルを利用すると、50ダニの初期解剖から75〜80%の生存率と20〜24マイクログラムの精製ビオチン化表面タンパク質を、1mLあたり約1.2×10〜7細胞で精製できます。

ダニの代表的な蛍光顕微鏡画像は、このプロトコルを使用して調製された上皮細胞を取得し、図2Aおよび2Bに示されています。不十分な単離は、個々の上皮細胞の不完全な解離を封じ込めるように視覚化され、さまざまな細胞サイズと形態を通じて特定されるさまざまな細胞集団があります。

宿主タンパク質からの交差汚染(図3A)は、ダニの腸を適切にすすぐことで、白色または透明なPercoll勾配を生成することで最小限に抑えることができます。SDS-PAGE(図4A)、銀染色(図4B)、ドットブロット(図5)、ELISAによるタンパク質の比較(図6)は、記載された方法論が、Rhipicephalus microplusダニ腸から単離された個々の上皮細胞からビオチン化表面タンパク質を首尾よく精製したことを示しています。結論として、この研究で利用された方法は、Rhipicephalus microplusの全腸から個々の上皮細胞を単離することに成功しました。

Rhipicephalus microplus上皮細胞の表面からタンパク質を採取し、さらなる分析と研究を行いました。最後に、開発されたプロトコルは、ダニ腸からの個々の上皮細胞の潜在的な収量と、細胞のビオチン化表面タンパク質の効率を実証しました。開発されたプロトコルは、腸の膜タンパク質組成を研究することにより、ダニと宿主の相互作用を調査する努力において、経済的に重要な任意のダニ種に利用できます。