2017年5月6日
このプロトコルは、長期のex vivo培養およびショウジョウバエ成虫ディスクのライブイメージングのための詳細な方法を記載しています。それは目のディスクのライブイメージングの10時間の期間内に光受容体の分化と個眼回転を示します。プロトコルは簡単で、高価なセットアップを必要としません。
この方法の全体的な目標は、細胞の増殖、分化、アポトーシス、競争など、さまざまな生命現象の研究に人気のある実験対象である仮想円盤のライブイメージングを示すことです。この方法は、細胞の形態や特定の組織への移動など、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、継続的なイメージングにより、細胞移動などの固定組織よりも多くの情報を表示できることです。
一般的に、この方法に不慣れな個人は、解剖と埋込みが難しいため、苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、不適切な解剖が解像度の低下につながるため、回転と転写のステージを習得するのが難しいため、非常に重要です。プロトコルを開始するには、機器を70%エタノールで消毒し、機器を風乾させます。
次に、ハエバイアルから3インスターの幼虫を選択し、ハエバイアルからの汚染を防ぐために、幼虫を1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。洗浄した幼虫を1ミリリットルの培地に室温で入れ、9ウェルガラススポットプレートに解剖顕微鏡で入れます。後端から1/3のところにある一対の鉗子で幼虫をつかみ、別の鉗子でマウスフックをつかみます。
2つの鉗子を反対方向に引っ張って、内部組織を解放します。次に、マウスフックに付着した眼脳複合体から唾液腺、脂肪体、キューティクルを取り出します。腹側神経索がまだ付着している場合は、ハサミで切り取ります。
1組の鉗子を使用して、マウスフックをつかみます。もう一方の鉗子を使用して、背側領域の脳と目の椎間板をつなぐ組織を切除します。次に、腹側が上を向くように複合体全体を回転させます。
フックまたはディスクを脳に接続しているフィラメントを取り外します。次に、プロセス中に目の椎間板を傷つけないように注意しながら、マウスフックを取り外します。眼椎間板は媒体内で自由になり、光学茎によってのみ脳に接続されています。
42mm×0.17mmのカバースリップの中央にOリングを2層に取り付けて、アガロースを保持します。次に、カバースリップでチャンバーを組み立てます。カバースリップをステージアクセプターに置きます。
次に、シリコンOリングをカバーガラスに取り付けます。次に、ベースをセットし、シーリングロッカーをロックして、カバーを取り付けます。先端が10〜200マイクロリットルの20マイクロピペットを使用して、解剖した眼脳複合体をOリングの中心に慎重に移します。
培地の大部分を取り除き、0.7%低融点、摂氏37度のアガロースを12マイクロリットルサンプルに加えます。寒天をサンプルの端に垂直にすると、組織をカバースリップに近づけ、サンプルから転がり落ちるのを防ぐことができます。室温で1ミリリットルの培地をOリングの中央に加えます。
サンプルがドリフトしないように、アガロースがOリングに接着されていることを確認してください。準備したチャンバーを倒立共焦点顕微鏡のステージに30分間置き、温度を平衡化します。長期のライブイメージングの前に、微分干渉造影顕微鏡で組織が損傷していないかどうかを確認します。
イメージングのために対物レンズを40倍に切り替えます。最後に、62 マイクロメートルの Z スタック画像を 1 マイクロメートルの光学間隔で 12 分で取得します。合計 10 時間にわたって 40 サイクルのスキャンを取得し、各サイクルに 12 分間のイメージングと 3 分間の休息が含まれていることを確認します。
R3とR4はGFPでラベル付けされました。10時間のライブイメージングセッションの開始時には、8列のオマティディアルクラスターがあり、最後には14列のオマティディアルクラスターがありました。R3とR4の相対的な位置に基づいて、ライブイメージング中にex vivo培養椎間板でオマチディアル回転が起こりました。
最初は、R3/R4軸は赤道に対して垂直に見えます。すると、3時間で15度、6時間で30度、9時間で45度回転するように見えることから、この方法では10時間のライブイメージングで視細胞の分化を維持できることが示唆されます。このビデオを見た後、ショウジョウバエの眼板を適切に解剖する方法とライブ画像を行う方法についてよく理解しているはずです。
このプロトコルは、ショウジョウバエの想像円盤の長期的なex vivo培養とライブイメージングの方法を概説し、光受容体分化と眼小胞の回転に焦点を当てています。この技術により、高価な機器を必要とせずに10時間の期間にわたって詳細な観察が可能になります。
Long-term live imaging of Drosophila imaginal discs enables real-time observation of dynamic developmental processes such as cell differentiation and tissue morphogenesis. This capability supports target validation by providing quantitative, time-resolved data on cellular behaviors in a genetically tractable system. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct visualization of phenotypic outcomes over extended culture periods.
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by supporting hypothesis testing and pathway clarification in developmental signaling pathways.