学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

この手順の総合的な目的は、酵母エストロゲン・スクリーンを用いて、パーソナルケア製品から抽出されたヒトエストロゲン受容体アゴニストを定量化することです。この手法は、水、食品、およびパーソナルケア製品中の環境エストロゲンを検出および定量できるため、毒性学、内分泌攪乱、および生態生理学の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。このin vitro法の主な利点は、安価で広く普及しており、技術的なラボスキルの教育に優れたプラットフォームを提供することです。

環境エストロゲンの検出は極めて重要です。なぜなら、これらはホルモンシグナルを変化させる可能性があり、特に胎児期の発達や、思春期のような生理的移行期においてその影響が顕著だからです。本手法で最も困難な部分は計算とデータ解析ですが、使いやすいアプリケーションを開発することで簡略化しました。また、正確なピペッティングが不可欠です。

このプロトコルでは、まず試薬の調製から開始します。アッセイの1日目に使用するグルコースおよびガラクトース培地、50%エタノールのビークルコントロール、およびエストラジオール標準液を準備し、さらに2日目に使用するLacZバッファー、ジチオスレイトール、および炭酸ナトリウムを準備します。グルコースおよびガラクトース培地は、0.2 µmフィルターを用いてろ過滅菌してください。

最大23種類のパーソナルケア製品（PCP）および抽出コントロールを、1枚の96ウェルプレートで3回ずつ（triplicate）試験することが可能です。PCPには、石鹸、ヘアクリーム、シャンプー、日焼け止め、メイクアップ、シェービングクリーム、ローションが含まれます。撮影のため、サンプルは8種類のPCPのみで調製します。

各サンプルの1 gを、15 mLコニカルチューブ内で10 mLの無水エタノールと混合します。加えて、15 mLコニカルチューブに11 mLの無水エタノールを入れたネガティブ抽出コントロールを準備します。手動での振盪とボルテックスを組み合わせて、各コニカルチューブの内容物を30分間均質化します。

コニカルチューブをバケット遠心機を用い、許容最大速度で10分間遠心分離します。各チューブの上清を40 µmのセルストレーナーでろ過しながら、50 mLコニカルチューブに回収します。その後、各50 mLチューブの内容物をガラス製シンチレーションバイアルに移します。

バイアルの蓋を開けたまま換気フード内で1週間放置し、エタノールを完全に蒸発させます。光に敏感な成分の分解を防ぐため、乾燥中のサンプルは遮光してください。サンプルが乾燥したら、各サンプルを1 mLの50% ethanolで再構成し、ボルテックスで均質化します。

酵母エストロゲン スクリーン（YES）プレートを調製する2夜前、または約42時間前に、無菌操作を用いて、各活性酵母培養液0.1 millilitersを滅菌三角フラスコ内のフィルター滅菌済みグルコース培地10 millilitersに加えて継代します。30 degrees Celsiusでインキュベートし、元の培養液はストックとして引き続きインキュベートします。2日後のYESアッセイの1日目に、無菌操作を用いて、懸濁した酵母培養液とフィルター滅菌済みガラクトース培地を滅菌ビーカー内で希釈します。

各酵母サンプルの120 µLを3連で、およびガラクトース培地のブランクを3連で透明ポリスチレンプレートにピペッティングし、光学密度を確認します。プレート分光光度計を使用し、希釈した酵母培養液の610 nmにおける正味の光学密度が0.065 ± 0.005であることを検証してください。ガラクトース培地ブランクのOD610を差し引くことで、酵母の正味のOD610を算出します。

滅菌済みのシリンジチップを装着したリピーティングピペッターを用いて、このプレートレイアウトに従い、希釈した酵母懸濁液を滅菌済みのポリプロピレン製96ウェルマイクロプレートの各ウェルに分注します。分注中は、ビーカーを絶えず回旋させるか、ピペットで混ぜ合わせることで、元の酵母懸濁液が沈殿しないように保持してください。最後に、プレートレイアウトで緑色に示されているウェルH10からH12に、フィルター滅菌済みのガラクトース培地を120 µLずつ加えます。これは、培地のみに起因する吸光度を補正するための培地コントロールとして使用します。

テストする酵母株と比色基質の組み合わせごとに、別々のプレートを用意します。次に、プレートのレイアウトに従い、各プレートで連続希釈を行って標準曲線を作成します。滅菌チップを装着したシングルチャンネルピペッターを使用して、ウェルA1、A2、およびA3に5 µLのエストラジオール標準液を加えます。マルチチャンネルピペッターを用いてピペッティングし、ウェル内の内容物を混合した後、ウェルA1からA3の205 µLをウェルB1からB3に分注します。この205 µLの分注を行 Gまで繰り返します。連続希釈が完了した後、ウェルG1からG3の205 µLを廃棄します。このステップが完了した時点で、すべての標準ウェルに120 µLが入っている必要があります。

プレートレイアウトで青色に示されている、酵母懸濁液を含む各ビークルコントロールウェル（H1、H2、H3）に、50% ethanolを5 µLずつ加えます。次のステップとして、プレートレイアウトで紫色に示されている酵母懸濁液を含むウェルに、サンプルまたは抽出ネガティブコントロールを5 µLずつ3連（triplicates）で加えます。どのサンプルまたは抽出コントロールをどのウェルに配置したかを記録してください。

どのウェルにサンプルがあり、どのウェルにないかを把握するために、新しいチップボックスを用意し、プレート内の対応するウェルの位置と同じ位置にあるチップを使用します。サンプル、抽出コントロール、およびビークルコントロールのウェルの中身をピペッティングして混合します。各ウェルから205 µLを除去し、これらのウェルの液量を120 µLに調整します。

各プレートを滅菌済みの粘着性多孔質フィルムで密封し、ラベルを貼付して30°Cで17時間インキュベートします。17時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出します。すぐに処理できない場合は、プレートをプラスチックラップで包み、4°Cで最大6日間冷蔵保存します。

プレートを処理する準備ができたら、ラップを外します。マルチチャンネルピペットを使用して、各行のウェルの内容物を混合し、その後、各ウェルから50 µLの酵母懸濁液を、透明なポリスチレン製96ウェルマイクロプレートの対応するウェルに転移させます。新しいプレートにラベルを貼ってください。

ウェル間のクロスコンタミネーションを避けるため、各ウェルには新しいピペットチップを使用してください。ただし、チップは滅菌されている必要はありません。ドラフトチャンバー内で、解凍して室温に戻した20 mLのLacZバッファーに1 MのDTTを20 µL加え、最終濃度を1 mM DTTにします。LacZバッファーを十分に混合してください。

リピーターピペットを使用して、DTTおよびONPGまたはCPRGを含むLacZバッファーを200 µLずつポリスチレンプレートのすべてのウェルに添加し、直ちにプレートリーダーを用いてすべてのウェルの610 nmにおける吸光度を測定し、記録します。追加のプレートがある場合は、必要に応じて同様に繰り返します。プレートに蓋をし、指示された時間、30 °Cでインキュベートします。

インキュベーションが完了したら、プレートをインキュベーターから取り出します。リピーティングピペッターを使用して、各ウェルに100 µLの炭酸ナトリウムを加え、β-ガラクトシダーゼ反応を停止させます。プレート分光光度計を用いて、全ウェルの吸光度を（ONPGの場合は405 nm、CPRGの場合は574 nmで）測定し、記録します。

LacZ値の算出は、Javaのインストールが必要な自動計算アプリケーションを用いて行うことができます。まず、付録1に記載されているLacZ自動計算アプリケーションを開きます。図1に示されているものと同じプレートレイアウトを用いて、すべてのウェルのONPG（405 nanometers）またはCPRG（574 nanometers）の吸光度測定値を貼り付けてください。

アッセイが呈色するまでのインキュベーション時間と時間を入力し、「Next」をクリックしてください。すべてのウェルの610ナノメートルにおける吸光度測定値を貼り付けます。「Submit」をクリックすると、LacZの結果が表示されます。

LacZの結果は、キーボードコマンドを使用してコピーし、必要に応じてスプレッドシートやその他のファイルに貼り付けることができます。まず、オンラインのYESアッセイデータ解析アプリケーションを開いて、この解析を開始してください。最初のタブに記載されている形式に従ってフォーマットされたCSVデータファイルをアップロードしてください。

2番目のタブでエストラジオールの標準曲線をデジタル化し、回帰パラメータを推定します。3番目のタブで回帰モデルの出力結果を確認し、次に4番目のタブでサンプルのLacZ値に対応する補間x軸値を求めます。5番目のタブをクリックして、サンプルのエストロゲン等量またはEEQ値を確認してください。

最後に、テキストプロトコルに従い、EEQ値を元のサンプル質量に標準化します。ここでは、酵母を17 beta-estradiolと共に17時間インキュベートした後の標準曲線の例を示しています。原稿内で述べている理由により、CPRGは多くの場合、ONPGよりも適切な基質の選択肢となります。

以前の観察結果と同様に、ER Betaを発現させた酵母を用いたアッセイは、ER Alphaを発現させた酵母を用いたアッセイよりも1桁以上感度が高かった。そのため、ER Beta発現酵母を用いることで、エストロゲン活性がより多く検出された。本研究のもう一つの目的は、学部生の実験コースのスケジュールに適合するインキュベーション時間に適合するかを検証することであった。

17時間のインキュベーション後に6日間の冷蔵期間を設けたところ、冷蔵したプレートから得られた標準曲線は、冷蔵しなかったプレートからの曲線と同等でした。4パラメーターロジスティック回帰モデルを用いて推定されたパラメーターの標準誤差は、冷蔵しなかったプレートよりも冷蔵したプレートの方がすべて小さくなりました。したがって、プレートを6日間冷蔵することで誤差が減少し、EEQ推定値の精度が向上します。

この手法に習熟すれば、3〜4時間のセッションを2回行うことで完了できます。手順を実施する際は、17時間のインキュベーション前に行うすべてのステップで無菌操作を徹底すること、ピペッティングを慎重かつ正確に行うこと、および図1に提示されているプレートレイアウトに従うことが重要です。本手順の後に、in-vivo動物アッセイなどの他の手法を実施することで、エストロゲン作用のさらなるメカニズムや個体全体への影響を調査することが可能です。

開発後、酵母エストロゲン・スクリーニング（YESアッセイ）は、食品、植物組織、パーソナルケア製品などの環境試料中のエストロゲン性リガンドを測定するための低コストな手法として認められるようになりました。このビデオを視聴することで、パーソナルケア製品の簡易的な抽出方法、酵母の培養、標準希釈曲線の作成、96ウェルプレートを用いたYESアッセイの実施、および関連する計算方法について十分に理解することができます。また、エストラジオールを取り扱う際は極めて危険であるため、本手順の実施中は、手袋やその他の個人用保護具の着用、および適切な廃棄の徹底など、常に予防策を講じてください。