Name: 脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶリアルタイムイオントフォレシス法による脳細胞外空間の体積分率とねじれの定量手法。テトラメチルアンモニウムを用いて生きた脳組織のECSパラメータをリアルタイムで測定し、脳生理と疾患の関係を解明する。

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この研究は、NIH NINDS助成金R01 NS047557によって支持された。

<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

<img alt="図10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> 図10：一般的な技術的問題を示す理想的でないデータ （ a ）イオントフォレーシス微小電極による一般的な技術的問題の図：機能的イオントフォレーシス微小電極からのTMAの正常放出と、技術的問題を示す3つの供給源との比較。 [高倍率、a1]理想的なイオン導入源の電流は、TMA放出および塩化物の取り込みによって等しく運ばれる。 [高倍率、a2]低いn tを有するイオントフォレシス微小電極は、TMAが少なく放出し、通常より多くの塩化物を取り込む。 [高倍率、a3]電気浸透を示すイオントフォレシス微小電極は、TMA、塩化物および溶媒を放出する。 [高倍率、a4]経時的な放出増大（ すなわち、 「ウォーミングアップ」）を示すイオントフォレシス微小電極。 （ b ）非理想データのグラフo寒天で得られる：データはウォルターによっ...

<html>細胞外空間（ECS）は、すべての脳細胞の外部にある相互接続されたチャネルのネットワークであり、間質液および細胞外マトリックスの両方を含む（ 図1aおよび図1b ）。栄養素、ホルモン、神経伝達物質を含む脳細胞機能に必要な多くの物質の分布は、ECSを通じた拡散によって起こります。体積、形状、および細胞外マトリックスを含む、この空間の物理的パラメータの変化は、急激ECSおよび脳細胞機能1、2に重大な影響を与える脳細胞を浸す局所イオン濃度、を通して拡散に影響を与えることができます。 、体積分率及びねじれ3、4：リアルタイムイオントフォレーシス（RTI）は、脳の領域の2つの構造的特徴を決定するために使用されます&quot;xref&quot;&gt; 5。体積分率（ α ）は、代表的な基本体積における全組織体積（ V 組織 ）に対するECS（ V ECS ）が占める組織体積の割合である。 <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" />屈曲（ λ ）は、物質が障害のない媒体と比較して脳領域を通って拡散するときに遭遇する相対的障害である。 <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" />ここで、 D * （cm 2 s -1 ）は脳内の物質の有効拡散係数であり、 D （cm 2 s -1 ）は希薄アガロースゲルなどの遊離媒質中の物質の自由拡散係数である。 現在、Rに最も一般的に使用されるプローブ物質TI法は、小さなカチオンのテトラメチルアンモニウム（TMA）である。 TMAは74g / molの分子量を有し、溶液中で完全に解離し、1つの正電荷を有する。このイオンによるRTIの研究は、 α <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0.2とλ <img alt="式" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1.6 1、2。これは、ECSが総脳容積のおよそ20％であり、小さな不活性分子の拡散が、障害物のない媒体と比較してECSにおいて約2.5倍遅くなることを意味する3 。しかし、 αとλの両方は、脳の年齢、地域、状態、および病的状態によって変化する1 。これらのパラメータの変更は、脳の発達、老化、睡眠、てんかん、および脳の多くの他の基本的なプロセスおよび疾患に関連している1、 6 。他の技術はαおよびλを測定するが、RTIはリアルタイムで生体組織の局所化された領域で両方を測定することができる。このため、RTIは、急性および可逆性挑戦中のαおよびλの変化を調査するために不可欠なツールとなっている。 RTIを支持する理論は、もともとニコルソンとフィリップスによって検証し、及び技術は、その時4,7ため広く使用されてきました。 RTIを用いた実験は、希薄アガロースゲル中へのイオン導入法によって、源微小電極からTMAのパルスを放出することから始まる。いったん放出されると、イオンは、潜在的に無数のランダムな経路から選択して、点源から自由に拡散する（ 図1d ）。イオンの変化する濃度は、大まかに位置付けられたイオン選択性微小電極（ISM）を用いて経時的に測定される100μm離れている（ 図1c ）。 TMA濃度の変化をグラフ化し、イオントフォレーシス微小電極（プロトコルで議論されたパラメータ）のDおよび輸送数の両方の計算を可能にする曲線に適合させる。これらの値を用いて、脳の関心領域で手順を繰り返してD *を求め、 αとλの両方を計算する。イオントフォレーシス微小電極の制御、データ収集、TMA濃度曲線のグラフ化およびフィッティング、および実験パラメータの計算はすべて、典型的にはこの目的のために特別に設計されたプログラムWandaおよびWalterによって行われる（ソフトウェアおよびそのマニュアルは要求に応じて著者から自由に入手可能）。 このレビューの議定書のセクションでは、げっ歯類の脳スライスをRTIで設計および実施するために必要な基本的な手順について説明しています。この技術はまた、非ロッドヒト脳切片を含むとインビボ脳調製物1、4、6、8、9 で ENTモデル、。代表結果セクションでは、データ解釈のニュアンスを強調する理想的な結果と理想的でない結果の両方を提供します。最後に、ディスカッション・セクションでは、トラブルシューティング手法、RTIの制限事項、ECSの研究に使用される代替技術、およびRTIの今後のアプリケーションについて簡単に説明します。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> 図1：ECSによる拡散の図。 （ a ）ECSの図：典型的な脳切片におけるECSの大きさと位置を示す。黄色は、灰色の脳細胞プロセス間のECSをマークする。 ECSの体積は、全組織体積の約20％である（ すなわち、体積率= 0）。2）。 （ b ）ECSの拡大図：脳細胞の形状（灰色）および細胞外マトリックス（多糖グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンのメッシュとして図示）を含む、蛇行に寄与する物理的パラメータを強調する。 （ c ）点源からの拡散の3D図：イオントフォレシス源からISMへの不活性分子の正味の移動を示す。拡散障壁および細胞摂取を除いて、分子はあらゆる方向に外側に拡散し、球状の濃度の前面を生成する。 ISMは、イオントフォレシス源から放出された不活性分子の局所濃度を定量化する。 （ d ）脳のECSにおける拡散のコンピュータシミュレーション：[Far left]モンテカルロシミュレーションのセットアップ;緑色の球体は脳細胞プロセスを表し、赤色の十字形は点源を表す。このセットアップは、 図1aに示す脳組織をモデリングします 。 [中間画像] 3と6分子は、2次元で示される脳の細胞外空間を通って拡散する際にランダムな動きをする。 [原爆]点源から放出された多くの分子のランダムな散歩。 図1cに示すように、点源からのすべての分子の正味の移動は外向きである。累積ランダムウォークは、細胞間の空間を概説する（ すなわち、 ECS;さらなる説明については、参考文献5を参照）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>A/DおよびD/Aコンバータ</td><td>ナショナルインスツルメンツコーポレーション</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>NI USB-6221は、NIから「レガシー」デバイスとして販売されています。新規インストールにはNI USB-6341 XシリーズDAQの使用を推奨していますが、新しいユニットではテストしていません。NI USB-6221とMATLABおよびWindows 7(32ビット)の使用方法について説明します。代替案:はるかに古いPCI-MIO-16E-4 A / Dコンバーター(Windows XPまたは古いOSでのみ使用)とBNC-2090 BNCコネクタパネルとSH68-68-EPケーブル。Wanda Manualに記載されているように、Axon Binary Filesを使用するための実験的なMATLABプログラムが利用可能です。</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>ロンザ</td><td>NuSieve GTG アガロース #50081</td><td>RTI測定用希薄アガロースゲルを調製</td></tr><tr><td>ISM</td><td>Dagan</td><td>Model IX2-700 デュアル細胞内プリアンプ</td><td>イオンおよび参照電圧増幅器 N=0.1 (参照バレル用) および N=0.001 (イオンバレル用) ヘッドステージ</td></tr><tr><td>生物学的化合物 ミスクロスコープ (4倍および10倍対物レンズ付き)</td><td></td><td></td><td>微小電極の先端を削り、微小電極を検査するため。さまざまなサプライヤー、例 AmScope</td></tr><tr><td>ホウケイ酸シータ毛細管ガラス管</td><td>ハーバード装置</td><td>ワーナー・インスツルメンツ モデル TG200-4; 注文 #64-0811</td><td>イオン選択性微小電極およびイオン導入微小電極用ダブルバレルガラス管; 外径 2.0 mm、内径 1.4 mm、セプタム 0.2 mm、長さ 10 cm</td></tr><tr><td>ブラシ</td><td>Winsor &ニュートン</td><td>大学シリーズ233、サイズ0</td><td>ラウンドショフトハンドルブラシ、アマゾンブ</td></tr><tr><td>ンゼンバーナー</td>フィ<td>ッシャー</td><td></td><td></td></tr>カメラから入手可能マイクロ<tr><td>ピペットオ</td><td>リンパス</td><td>OLY-150</td><td>はモニターが必要、サブステージイルミネーターのIRフィルターはオプションの</td></tr><tr><td>チャートレコーダー</td><td></td><td></td><td>ですテトラメチルアンモニウム標準試料の較正中およびRTI実験中にイオン選択性微小電極の電圧を連続的に記録する。例: Kipp &ゾーネンタイプBD112デュアルカネルチャートが記録され、利用可能な再生</td></tr>クロ<tr><td>ロトリメチルシラン、純度、>99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>カタログ#92360</td><td>のシラン化用。注意:可燃性、急性毒性(経口、皮膚、吸入)、皮膚の腐食、目の損傷、水と激しく反応する、完全な説明については、Sigma-Aldrichの安全情報を参照してください</td></tr><tr><td>商用ソフトウェア</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB、</td><td>WandaおよびWalterプログラムを使用したデータ収集と分析のためのデータ収集ツールボックス。アカデミックライセンスが利用可能です。</td></tr><tr><td>目の保護メガネ</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定ステージ複合顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WI</td><td>は、固定ステージ鉗子を備えた他の複合顕微鏡を使用することができます</td></tr><tr><td></td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#11251-10</td> ガラス<td>キャピラリーをチップ化するために;Dumond #5は、好ましくは使用し、</td></tr>液体<tr><td>イオン交換器が付いているイオン選択バレルの先端を充填し、silanizationのための良い仕事の発煙フード</td><td></td><td></td><td></td>のためにもはや必要としない;さまざまなsupliers、例えばErlab</tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>Fisher</td><td>#12-550A</td>によって販売されるapproriateフィルターが付いているCaptairを<td>チップmicroelectroelectrodのヒント</td></tr><tr><td>のヒーター/スター</td><td>ラーFisher</td>コー<td>ニングPC-420D</td><td>希薄なアガロースゲルを調製し、イオン</td></tr><tr><td>トフォレティックユニット</td><td>Dagan</td><td>ION-100およびPS-100</td><td>ION-100は、シングルチャネルイオントフォレーシスユニット+/-130Vコンプライアンスです。PS-100は外部電源です。代替案:Axon Instruments社製Axon Instruments社製例えば/emAxoprobe-1Aは、テトラメチルアンモニウムの再生ユニット(eBayおよびその他のサイト)の入手可能性を確認します</td></tr>テ<tr><td>トラメチルアンモニウム用液体イオン交換体(LIX)</td>世界<td>精密機器</td><td>IE190カリウムイオン交換体</td><td>注:これは、テトラフェンリホウ酸塩に基づく元のコーニングカリウム交換体477317に相当します-中性キャリアカリウム交換体と混同しないでくださいテトラメチルアンモニウムを感知しないチューリッヒのサイモン博士の研究室に由来し、フルカによって販売されています。また、テトラメチルアンモニウム用の液体イオン交換体を自分で作ることもできます:重量の3%テトラキスカリウム=(p-クロロフェニル)ホウ酸塩を2,3-ジメチルニトロベンゼンに溶解。Fluka(現在はSigmaの一部)から化学薬品を購入します。See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim.使徒行伝86:21-25;注意:この液体イオン交換体の毒物学的特性は完全には決定されていません。人体への摂取や接触は有害な場合があります。運動には十分注意してください!液体イオン交換体は、直射日光の当たらない涼しい場所に保管する必要があります。</td></tr><tr><td>微小電極</td><td>ホルダーWPI</td><td>M3301EH</td>、<td>シラン化のためにイオン選択性マイクロエレトロードをプレハブで保持し、イオン選択バレルの先端を液体イオン交換体で充填します。WPIは、このホルダーの2つのバージョン、クリアM3301EHとブラックM3301EHを販売しています。私たちの経験では、透明なM3301EHは黒いM3301EHよりも頑丈に見えます。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MM-3</td><td>は、シラン化中にイオン選択性微小電極をプレハブに配置し、イオン選択性バレルの先端を液体イオン交換体で充填します。良好な作業状態の任意の3軸マイクロマニピュレーターに置き換えることができます</td></tr>マイクロ<tr><td>ピペットプーラーSutter</td><td>Instruments</td><td>Model P-97</td><td>ダブルバレルガラス管を引っ張る。他のプーラーは、大口径のダブルバレルガラス管マイクロプローブ温度計を収容できる限り、この</td></tr><tr><td></td>温度計の<td>Physiotemp</td><td>モデルBAT-12R</td><td>ファインプローブは、記録部位の</td></tr><tr><td>針</td><td>BD</td><td>シリンジと針#305122(25ゲージ)</td>の近くに配置され、<td>シラン化のために使用することができます。BD PrecisionGlideの針 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)</td></tr><tr><td>対物レンズ 5X ドライ</td><td>オリンパス</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 10X 水浸</td><td>オリンパス</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X 対物レンズは水浸、開口数は 0.3、作動距離は 3.3 mm</td></tr><tr><td>プラスチック容器 (蓋付き)</td><td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>テトラメチルアンモニウム標準溶液と微小電極</td></tr><tr><td>を保管します固定ステージ顕微鏡用プラットフォームとx-y平行移動ステージ</td><td>EXFO</td><td>ジブラルタル バーレー</td><td>プラットフォームは、スライスチャンバー、マイクロマニピュレータ、アクセサリーを保持し、x-y並進ステージは、記録の安定性を損なうことなく顕微鏡を移動</td></tr><tr><td>希薄なアガロースゲルでのRTI測定用</td>多<td>孔質ミニカップ</td><td></td><td></td>; 自家製</tr><tr><td>の再利用可能な接着剤</td><td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>微小電極を保持容器に固定するため、その他の用途に使用します。</td></tr><tr><td>アマゾンのロボットマイクロマニピュレーターから入手可能な様々なサプライヤー、正確なx、y、z位置決め</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>2つのミルコマニピュレーターは、イオン選択性微小電極とイオントフォレティック微小電極を別々に保持するために必要です。マイクロピペットを間隔を空けて並べて接着することも可能です(テキストを参照)。</td></tr><tr><td>ローパスフィルター付きシグナルコンディショニングユニット</td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320または380</td>は<td>、メーカーから入手できなくなりましたが、E-Bayから入手できる場合があります。代替品:e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology.これは、マルチポールベッセルフィルターを使用して10 Hzで最小カットオフを持つシングルチャンネル機器ですが、必要に応じて、会社はそれをより低いカットオフ周波数(2 Hz)に変更する用意があります。</td></tr><tr><td>銀線</td><td>AMシステム</td><td>#7830</td><td>直径0.015インチ、裸(コーティングなし)</td></tr><tr><td>スライスチャンバー</td><td>ハーバード装置</td><td>ワーナーモデルRC-27L</td><td>これは水中スライスチャンバーです。</td></tr><tr><td>シラン化やイオン選択バレルの先端に液体イオン交換器を充填するための</td>インターフェーススライスチャンバー<td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td>を使用しないでください。水平に取り付けられています。さまざまなサプライヤー</tr>の<tr><td>注射器、10mL</td><td>BD</td><td>シリンジとニードル#309604</td><td>は、微小電極を埋め戻し、シラン化するためのものです。BD Luer-Lokチップ</td></tr><tr><td>シリンジフィルター0.22 &micro;m 細孔</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>埋め戻し溶液をろ過します; フィッシャー</td></tr><tr><td>シリンジ ニードル、28 ゲージ、97mm</td><td>ワールド プレシジョン インスツル</td>メンツ <td>MicroFil MF28G-5</td><td>から利用可能 マイクロ電極</td></tr><tr><td>テフロン (=PTFE) チューブ</td><td>コンポーネント サプライ</td><td>STT-28 PTFE チューブ ライト ウォール (28 ゲージ)</td><td>イオン選択性バレルのシリナイズ用。BD PrecisionGlideニードル25 G x 5/8インチに適合します。注:テフロンは必須であり、PVCチューブはホットワックスによって溶けます。</td></tr><tr><td>温度制御システム</td><td>ハーバード</td>装置<td>ワーナーモデルTC-344BとSH-27A</td><td>TC-344Bはデュアル自動温度コントローラであり、SH-27Aはインラインヒーターです。コントローラとヒーターはワーナースライスチャンバー</td></tr><tr><td>テトラメチアンモニウム(TMA)塩化</td>物<td>シグマアルドリッチ</td><td>T-3411</td><td>5 Mソリューションで動作します。注意:急性毒性(経口、経皮、吸入)、発がん性、水生環境に有害、シグマ-アルドリッチ安全情報を参照してください 完全な説明については</td></tr>、<tr><td>振動ブレードミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td>を<td>脳スライスを切断しますキシ</td></tr><tr><td>レン</td><td>フィ</td><td>ッシャーX5-1</td> シ<td>ラン化のために;注意:可燃性、急性毒性(経口、皮膚、吸入)、皮膚腐食、眼の損傷、発がん性、完全な説明についてはフィッシャー安全情報を参照してください</td></tr></tbody></table>

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

このレビューでは、生きた脳の細胞外空間（ECS）を探索および定量するための金標準である、リアルタイムイオントフォレーゼ（RTI）法を実行するための基本概念およびプロトコルについて説明しています。 ECSはすべての脳細胞を囲み、間質液と細胞外マトリックスの両方を含む。神経伝達物質、ホルモンおよび栄養素を含む脳活動に必要な多くの物質の輸送は、ECSを通る拡散によって起こる。この空間の容積および形状の変化は、睡眠のような正常な脳プロセスおよび虚血のような病理学的状態の間に生じる。しかしながら、特に罹患した状態での脳ECSの構造および調節は、未だに未解明のままである。 RTI法は、生きた脳の2つの物理的パラメーター、すなわち体積分率および蛇行を測定する。体積分率は、ECSが占める組織体積の割合である。屈曲は、脳に拡散して物質が遭遇する相対的障害の尺度である妨害のない媒体と比較して、 RTIでは、不活性分子が供給源の微小電極から脳ECSにパルスされる。分子がこの供給源から拡散するにつれて、イオンの変化する濃度は、約100μm離れて配置されたイオン選択性微小電極を用いて経時的に測定される。得られた拡散曲線から、体積分率と曲がり率の両方を計算することができる。この技術は、複数の種（ヒトを含む）およびインビボの脳切片において、ECSに対する急性および慢性の変化を研究するために使用されている。 RTIは、他の方法とは異なり、リアルタイムで脳ECSの可逆的および不可逆的変化の両方を調べるために使用することができる。

RTI技術の有用性は、 αの変化および低浸透圧チャレンジ中の変化を測定するために設計された実験で実証されている（ 図8および図9 ）。以前に低張ACSFで洗浄することにより、ECSの浸透圧を低下させることはαの減少及びλ13の増加を生じさせることが示されています。 この実験において、RTIは、制御条件下および低張性ACSFのウォッシュ・オンの両方の条件下で、ラットの脳スライスで実施した。 ISMを製作し、その較正パラメータを、58.21mVの勾配（ M ）を計算したNicolsky方程式に適合させるためにWandaに入力した。 ISMおよびイオントフォレシス微小電極を寒天中に置き、輸送ニューロンを測定するために互い...

このプロトコールは、生体内の脳の細胞外空間（ECS）の物理的パラメータを測定する方法であるリアルタイムイオントフォレシスを説明しています。 ECSに放出された不活性分子の拡散を用いて、ECSの体積分率および蛇行度を計算する。これは、脳のECSへの急性の可逆変化を研究するのに理想的です。

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

この手順の全体的な目標は、脳組織の細胞外空間の体積分率と曲がりくねりを定量化することです。この方法は、細胞外空間と生理機能および疾患との関係に関する重要な質問に答えます。この手法の主な利点は、細胞外空間の2つの重要なパラメータをリアルタイムで特性評価できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、イオントフォレティック微小電極が実験中にその特性を変化させる傾向を示し、実験中にトラブルシューティングが頻繁に必要になるため、苦労するでしょう。この方法の視覚的なデモンストレーションは、イオン選択性微小電極、イオントフォレティック電極の正確な操作が複数のステップで必要であるため、成功裏に記録を得ることが重要です。この手順を開始するには、テトラメチルアンモニウム(TMA)を含むACSFを、毎分2ミリリットルで浸漬チャンバーに通します。温度コントローラーを希望の温度に設定し、実験期間中、ACSFを95%の酸素、5%の二酸化炭素で泡立てます。次に、接地電極をホルダーに取り付け、その先端を水没チャンバーを通るACSFに沈めます。次に、事前に調製したTMAを含む0.3%アガロースを多孔質カップに充填し、浸漬チャンバーに入れます。次に、イオントフォレーシス微小電極を1つのマイクロマニピュレーターのピペットホルダーに固定します。イオントフォレーシス微小電極ワイヤーをイオントフォレーシスユニットのヘッドステージに接続します。次に、キャリブレーションされたISMを2番目のマイクロマニピュレータに固定し、ISMをヘッドステージに接続します。その後、Wanda と Walter のプログラムがインストールされているコンピューターの電源を入れます。Wanda GUI で、「キャリブレーション」をクリックします。次に、[キャリブレーション]ボックスにISMキャリブレーション中に測定された電圧を入力し、[データの適合]をクリックします。その後、[キャリブレーション]ボックスで[同意する]をクリックして、生成された勾配と干渉をメインGUIに自動的に転送します。GUIの左側で、すべての実験パラメータが対応するエントリに設定されていることを確認します。次に、温度プローブを寒天カップに入れます。GUIの[Measuring Electrode]ボックスの[Temperature]エントリに測定された温度を記録します。次に、微小電極をアガロースの深さ少なくとも1, 000マイクロメートル下げ、カップの中央に配置します。10倍対物レンズを使用して顕微鏡でそれらを視覚化します。2チャンネルアンプで、ISMチャンネルコネクタを手動で電圧減算出力に移動して、リファレンスチャンネルとISMチャンネル間の減算をオンにします。3 つの方向軸すべてで先端を互いに中央に配置します。次に、マイクロマニピュレータ制御ボックス上の両方の微小電極の相対位置をゼロにし、微小電極が正確かつ正確に中心に配置されていることを確認します。次に、ISMをイオントフォレーシス微小電極から120マイクロメートル離して1軸で動かします。その後、GUIで[取得]をクリックして録音を開始し、プログラムを実行して完全な録音を実行できるようにします。この手順では、コンピュータで Walter プログラムを開きます。「Zero Records From」メニューで、「Wanda Voltoro」ボタンをクリックして、Wanda によって生成されたレコードを読み取ります。次のポップアップウィンドウで、読み取るレコードを1つ以上選択し、[開く]をクリックします。One Write Excelメニューで、シート1.3をクリックし、レコードが自動的にグラフ化されるまでプロンプトに従います。フィッティング手順を開始するには、Two Optionsメニューでselect recボタンをクリックします。次に、図 2 のポップアップ ウィンドウで、マウスを使用して、処理する最初のレコードに十字線を移動し、いずれかのマウス ボタンを押してレコードを選択します。その後、メニューの[フィットカーブ]をクリックし、少なくとも20回のフィッティングの反復を使用して、データの正確なフィットを取得します。次に、すべてのデータポイントを合わせるためにすべてを選択し、続行を選択します。プログラムは表示された曲線にフィットします。次に、7つの結果メニューでExcelをクリックして、結果を適切なスプレッドシートプログラムに書き込むオプションを選択します。Excel ファイルに名前を付けます。生成されたデータをメモして記録し、イオントフォレーシス微小電極の機能を決定するために使用されます。イオントフォレーシス微小電極が実験に適していると判断された場合は、Wanda GUI の TransportNum end フィールドにすべての試行の平均輸送数を記録します。この手順では、厚さ400マイクロメートルの脳スライスを記録チャンバーに配置し、流れるACSFに完全に浸されていることを確認します。次に、イオントフォレーシス微小電極とISMの両方を脳スライス上の対象フィールドの上に移動します。両方の電極を流れるACSFに浸しますが、スライスの上にあります。次に、リファレンスチャンネルとイオン検出チャンネルの両方の電圧を0ミリボルトにオフセットします。両方のチャネルの電圧が安定するまで待ちます。チャートレコーダーで、ISMのイオン検出チャネルで測定された電圧をマークします。次に、ISMとイオントフォレーシスの微小電極をスライスの深さ200μm、互いに120μm離して配置します。流れるACSFと脳で測定されたTMA信号の間の電圧差を計算し、この値をWanda GUIの測定電極ボックスのベースラインボルトミリボルトフィールドに入力します。GUIの左側で、すべての実験パラメータが正しく入力されていることを確認します。[取得] をクリックして録音を開始し、完全な録音を許可します。両方の微小電極をスライスから移動させた後、チャートレコーダーを使用して、現在測定された電圧と以前の測定との間の変化を判断します。脳からの記録を分析するには、Walterプログラムを使用してアガロースデータ解析の手順を繰り返します。Walter メニューの Excel をクリックして、スプレッドシートプログラムにデータを書き込みます。次に、脳ECSの体積分率、脳ECSの曲がりくねり、および非特異的クリアランスを記録します。トランスポート番号を確認するには、アガロースで新しい録音を行い、Walterプログラムで手順を繰り返してトランスポート番号を取得します。スプレッドシートを検査し、トランスポート番号が脳測定前に得られたトランスポート番号から10%以上変化していないか確認します。もしそうなら、イオントフォレティック微小電極で得られたデータは信頼できません。このステップで測定された輸送数は、脳の測定前に得られたものと厳密に一致しなければならず、そうでなければ体積分率は正確とは見なされません。新しく取得したISMキャリブレーションデータをWanda Calibrateボックスの入力として使用し、傾き値が前回のキャリブレーションと10%未満異なることを確認します。ここに示されているのは、寒天で得られたTMAの濃度曲線を示す単一の試験からの代表的なデータです。そして、これはWalterでのデータ処理から得られたフィット曲線です。フィット曲線のデータの重なりは、Walterが行ったカーブフィットがこの試行での拡散を正確にモデル化していることを示しています。これは、脳内で実験する前の寒天測定の表です。これは、制御条件と実験条件下でマウスの脳スライスで行われた測定の要約です。低浸透圧チャレンジ中にアルファは減少しましたが、曲がりくねりは予想どおりに増加しました。アルファが回復条件の制御値をオーバーシュートしました。そして、これが脳内での実験後のagra測定値の表です。実験前後の平均輸送数は互いに10%以内であり、脳に記録された値が信頼できることを示しています。一度習得すれば、この手順は2日間で14時間で実行できます。初日に、ISMの作製と校正が行われます。2日目には、ISMを再校正し、リアルタイムのイオントフォレーシスを行います。この手順を試みるときは、まず電極の間隔を正確にすることが重要です。次に、イオントフォレティック微小電極の輸送数が実験の過程で安定している場合にのみ、実験を受け入れることが重要です。この手順は、細胞外空間における小さな陽イオンの拡散を特徴付けるもので、その後、大きな微分子が細胞外空間でどのように移動するかという問題に答えることができる統合光学イメージング法などの他の手法に進むことができます。このビデオを見れば、リアルタイムイオントフォレーシス法を実施して、健康と病気の生きた脳の脳の細胞外空間の体積と曲がりくねりを定量化する方法についてよく理解できるはずです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

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出典:Moye, S. L., et.al.Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019).

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このプロトコルは、血液脳関門透過性を高めるために、焦点を合わせて超音波およびマイクロバブル治療中にげっ歯類脳の生体 内...

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

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学ぶリアルタイムイオントフォレシス法による脳細胞外空間の体積分率とねじれの定量手法。テトラメチルアンモニウムを用いて生きた脳組織のECSパラメータをリアルタイムで測定し、脳生理と疾患の関係を解明する。

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

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