Name: 体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ間葉系幹細胞の心筋細胞様細胞への分化誘導法。環境シグナルと凝集体形成を用いて薬剤や遺伝子操作なしで機能的心筋細胞を生成する技術。心血管疾患治療への応用可能性を示す。

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著者らは次のスタッフ メンバーに感謝し、彼らの貢献のための人員を研究: マシュー Librach、レイラ ・ Maghen、ターニャ A. Baretto、Shlomit Kenigsberg Andrée ゴーティエ ・ フィッシャー。この作品は、オンタリオ州研究基金 - 研究の卓越性 (ORF 日時、ラウンド #7) と作成プログラム株式会社によって支えられました。

動物を含むすべての研究は、ARRIVEガイドラインに従って実施および報告されました48。すべての研究は、機関研究倫理委員会の承認を得て実施されました(REB番号454-2011、サニーブルック研究所;REB 29889、トロント大学、トロント、カナダ)。すべての動物の処置は、University Health Network(カナダ、トロント)の動物管理委員会によって承認され、すべての動物は、実験動物の世話と使用に関するガイド、第8版(国立衛生研究所、2011年)に準拠して人道的なケアを受けました。
1. 組織培養
<ol>
	<li>培養FTM HUCPVC、用語HUCPVC(以前に確立され、それぞれにn≥3つの独立したライン)42およびα最小必須培地(MEM)中の市販のBMSCに10%のウシ胎児血清(FBS)と1%のペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)カクテルを補給。Dulbecco's Modified Eagle Medium: 10% FBS and 1% P/S. を含有する栄養混合物 F-12 (DMEM-F12) でのラット初代心筋細胞と MSC-心筋細胞共培養
	注:0.2μmフィルターを使用して培地を滅菌します。調製した培地溶液は、4°Cで最大3週間保存してください。</li>
	<li>加湿インキュベーター(相対湿度95%、37°C、CO25%)で細胞培養を維持し、位相差顕微鏡で測定する70〜80%のコンフルエント度で継代します。使用する組織培養ディッシュのサイズに適した量の培地を使用してください(例:10cmディッシュに10 mL、6ウェル組織培養プレートにウェルあたり2 mL)。これらの培養条件は、プロトコルの期間中使用します。</li>
	<li>継代またはMSC-心筋細胞共培養確立のために、解離酵素溶液(6ウェルプレートに2 mL/well)を使用してMSC単分子膜を解離し、37°Cで4分間インキュベー</li>トします。
	<li>解離した細胞を15 mLチューブに移し、400 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞ペレットを乱さずに上清を吸引し、自動セルカウンターを使用してカウントに適した1 mLの培養培地に細胞を再懸濁します。次のプロトコルセクションで説明されているように、セルをシードします。</li>
</ol>
2. 初代ラット心筋細胞-MSC共培養液の調製
<ol>
	<li>一次心筋細胞を単離するための心臓組織を採取します。
	<ol>
		<li>ラットの子犬(生後5〜6日)をCO2窒息を使用して安楽死させます。CO2チャンバーを20%のガス置換に設定します(流量= 0.2 xチャンバー容積/分)。ピンチ反射がないことで出口を確認します。</li>
		<li>滅菌された器具(鉗子や湾曲したハサミなど)を使用して、主要な血管が接続されている心房を切除します41。氷上で1%P/S(PBS-P/S)を含む滅菌PBSを含む50mLチューブに心臓を移します。</li>
		<li>心室を半分に切り、10 cmの皿に10 mLのPBS-P / Sを氷の上に置いて血液を洗い流します。湾曲したハサミを使用して、心室壁を小片(直径= 2〜3 mm)に切ります。</li>
		<li>血清学的ピペットを使用して10〜12匹の動物から心臓片を50mLチューブに移し、それらを落ち着かせます。</li>
		<li>ハートピースを取り外すことなく、できるだけ多くのPBS-P / Sを取り外します。新しいPBS-P / Sを10mL追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心臓組織を消化して心筋細胞を分離します。
	<ol>
		<li>ハートのピースが落ち着くのを待ちます。PBS-P/SをPBS中の0.15%トリプシン10mLと交換し、37°Cで10分間振とうします。</li>
		<li>上清を捨てます。ステップ2.2.1で説明した消化をさらに3回繰り返しますが、上清を10 mLの100% FBSが入った50 mLの収集チューブにデカントします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>細胞を遠心分離(400 x g、5分)し、上清を吸引します。10% FBSと1% P/Sを含むDMEM-F12に細胞を再懸濁し、6ウェルプレート(1 x 105細胞/cm2、ウェルあたり2 mLの培地)に播種します。</li>
	<li>1時間後、非接着細胞を含む培地を50mLチューブに移し、付着した細胞を廃棄します。懸濁液中の細胞をカウントし、新しい6ウェルプレート(1 x 105細胞/cm2、ウェルあたり10% FBSと1% P/Sを含む2 mLのDMEM-F12)に再播種します。</li>
	<li>ブロモデオキシウリジン(BrdU). で細胞増殖を阻害します。
	注意:BrdUは強力な催奇形性物質であり、変異原性が疑われます。適切なトレーニングが提供されていることを確認し、使用前に安全データシートを参照してください。
	<ol>
		<li>細胞が付着したら、6ウェルプレートの培地を、10% FBS、1% P/S(ウェルあたり2 mLの培地)、および5 μM BrdUを含むDMEM-F12と交換します。16時間(37°C、5%CO2)インキュベートします。</li>
		<li>BrdU含有培地を取り出し、10%FBSと1%P/Sを含むDMEM-F12(ウェルあたり2mLの培地)と交換します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色済みMSCを調製します。
	<ol>
		<li>MSC培養物が10cm皿中で70〜80%のコンフルエントになったら、培地を取り出し、3mLの細胞解離溶液を加えます。皿を37°Cおよび5%CO2で5分間インキュベー</li>トします。
		<li>解離した細胞を15 mLチューブに移し、400 x gで5分間遠心分離します。</li>
		<li>細胞ペレットを乱さずに上清を吸引し、10% FBSおよび1% P/Sを含むDMEM-F12 mLに細胞を再懸濁して、自動セルカウンターを使用してカウントします。</li>
		<li>細胞を1 x 106 MSC/mLの濃度に希釈し、10%のFBSと1%のP / Sを含むDMEM-F12</li>を溶解します。
		<li>MSCを、1.5 mL遠心チューブ内の生存可能な転写不能な蛍光色素(5 μM、30分、37°C、5% CO2)と1時間インキュベー</li>トします。
		<li>チューブを400 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを10% FBSおよび1% P/Sを含むDMEM-F12に再懸濁して、細胞濃度1 x 106 MSC/mLにします。これを合計3回繰り返します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MSCを心筋細胞に移し(ステップ2.5.2)、6ウェルプレートのウェルあたり10×104細胞の濃度で移します。</li>
</ol>
3. 集合体共培養の準備
<ol>
	<li>10% FBSおよび1% P/Sを添加したα-MEM中のMSCs(2 x 104細胞/mL培地、継代#≤ 6)の単一細胞懸濁液を調製します(ステップ2.6を参照). 
	注:細胞の継代については、プロトコルのセクション1を参照してください。または、ステップ2.6に従ってMSCを事前に染色します。</li>
	<li>10 cm組織培養皿(1蓋あたり最大50滴)の蓋の内面に25 μL滴の細胞懸濁液(500細胞)を配置することにより、凝集体形成を開始します。PBS-P/S を含む底面の対応物に蓋を置き、37 °C および 5% CO2. でインキュベートします。
	注:液滴の蒸発を避けるために、5〜7 mLのPBS-P / Sを吊り下げ液滴の下の培養皿に入れます。</li>
	<li>実体顕微鏡を使用して、3日後の液滴中の凝集体形成を観察します。50滴中40滴以上に形成された凝集体が含まれている場合は、1mLマイクロピペットを使用して蓋から滴を収集し、凝集体を直接初代ラット心筋細胞単層(ステップ2.1-2.7で調製、10滴/ウェル)に移します。骨材の完全性を保つために、激しいピペッティングは避けてください。</li>
	<li>凝集体共培養物をインキュベーターで最大2週間保持し、培地の全容量(10%FBSと1ウェルあたり1%P/Sを含む2 mLのDMEM-F12)を72時間ごとに交換します。
	<ol>
		<li>フィーダーセル層に付着した凝集体を明視野顕微鏡で毎日観察します。観察されたら、収縮する骨材を記録します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析用の骨材を準備します。
	<ol>
		<li>培地を取り出し、6ウェル組織培養皿のウェルあたり2 mLのPBSを加えます。PBSを取り出し、ウェルごとに2 mLの解離溶液を加えます。37°Cおよび5%CO2で3分間インキュベートします。</li>
		<li>400 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。後続のステップ(ステップ4.1、5.1、および6.1を参照)で説明しているアプリケーション用に指定されているように、培地に再懸濁し、70μmのセルストレーナを通過します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. フローサイトメトリー(FC)および蛍光活性化セルソーティング(FACS)
<ol>
	<li>細胞懸濁液(3% FBSを含むPBSの200 μLに1 x 105細胞)を蛍光色素標識(FITCまたはAPC)一次抗体(FCの場合はCD49f、Cx43、TRA-1-85、HLA-A、HLA-G、SILPA、FACSの場合はTRA-1-85、1:40)と4°Cで30分間インキュベートし、光から保護します。</li>
	<li>遠心分離(400 x g、5分)し、1 mLのPBS(FC用3% FBS)またはPBSと0.5% FBS製(FACS)に再懸濁します 
	注:MSCのFCは、Hongらによって最適化されました。41.</li>
	<li>細胞を暗所で4°Cに維持し、FC(少なくとも1 x 104イベント)またはFACSで分析する準備が整います。説明されているようにセルを並べ替えます41。6ウェルプレート(1 x 104細胞/ウェル、10% FBSと1% P/Sを含む2 mLのDMEM-F12)でTRA-1-85ハイポジティブソーティング細胞を1時間以内で再プレートします 
	注:TRA-1-85ヒト細胞表面抗原のゲーティング戦略については、補足図を参照してください。</li>
</ol>
5. 免疫細胞化学(ICC)と顕微鏡
<ol>
	<li>共培養(ステップ3.5.2)またはFACS(セクション4)から得られた細胞懸濁液をチャンバースライド(1 x 104細胞/ウェル、10%FBSおよび1%P/S/ウェルを含む2 mLのDMEM-F12/ウェル)に再播種します。細胞を組織培養インキュベーターで一晩接着させます(条件についてはセクション1を参照)。</li>
	<li>3 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBS中で室温で15分間使用して細胞を固定します。1%ウシ血清アルブミン(BSA;PBS-BSA)を5分間洗濯 
	注意:PFAを取り扱う際は、適切な個人用保護具を着用してください。</li>
	<li>3 mLのPBS-BSAに0.1% Triton X-100で細胞を透過処理します。細胞内抗原(アルファサルコメアアクチニン(aSarc)およびCx43)については室温で10分間、核内抗原(Mef2cおよびヒト核抗原(HuNu))については25分間インキュベートします。1回の洗浄につき、PBS-BSAを3mLで5分間3回洗浄します。</li>
	<li>5% 正常ヤギ血清(NGS)と 1% BSA を含む 3 mL の PBS で、室温で 15 分間、非特異的抗体反応に対してサンプルをブロックします。1回の洗浄につき、PBS-BSAを3mLで5分間3回洗浄します。</li>
	<li>1:200に希釈したPBS-BSAの3 mLで1:200に希釈した一次抗体(Mef2c、aSarc、Cx43、HuNu)で細胞をインキュベートし、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	1<li>回の洗浄につき、3 mLのPBS-BSAを5分間3回洗浄し、室温で二次抗体と30分間インキュベートします。1回の洗浄につき、PBS-BSAを3mLで5分間3回洗浄します。</li>
	<li>染色した標本を3 mLの封入剤で保存します。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を使用して画像を取得します。10倍対物レンズ(NA = 0.3)と20倍対物レンズ(NA = 0.45)を使用して、低倍率イメージングを行います。使用する二次抗体には、GFP(例 = 470/22 nm、em = 525/50 nm)およびRFP(例 = 531/40 nm、em = 593/40 nm)には蛍光フィルターキューブと波長を使用します(材料および装置表を参照)。</li>
	<li>イメージングソフトウェアを使用して画像を定量化します(推奨ソフトウェアについては、材料および機器の表を参照してください)。蛍光強度の読み取り値を二次コントロール取得に正規化します。</li>
</ol>
6. RNA単離と定量的RT-PCR
<ol>
	<li>未分化MSC培養物またはカラムベースのRNA単離法を用いて共培養物から選別したMSCからRNAサンプルを調製します。1サンプルあたり0.7 mLの細胞溶解バッファー(RNA単離キットに付属)に1 x 104〜1 x 106細胞を調製します。</li>
	<li>100 μL RT反応あたり最大2 μgのRNAからcDNAを調製します。</li>
	<li>1反応あたり10 ngのcDNAを使用してqPCRを実施します(40サイクル、60°Cのアニーリング/拡張温度)。
	<ol>
		<li>ヒトMY6HおよびcTnTのプライマーを、1反応あたり500 nMの濃度および1-100 ngのcDNAで使用します(材料および装置の表を参照)。GAPDH、ACTB、および HPRT を内部ハウスキーピング・ノーマライザーとして使用します。市販のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞をポジティブコントロールとして用いる 
		注:未分化のMSC由来cDNAサンプルと比較した発現の倍率変化を表現します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

博士クリフォード ・ l ・ Librach は、特許の共同保有者:最初の学期臍帯組織由来細胞の分離とファージのメソッドカナダ、オーストラリアで。

幹細胞の心筋分化は、MSC のソースから心筋細胞のような細胞の生成に使用されているいくつかの異なる戦略と 2 年以上にわたって開発を進めています。これらの戦略の多くはただし、効率的ではありません、使用条件、環境移植細胞の出会い、生体内の代表的なよくないです。
既存のメソッドとは対照的は、ここで提示されたプロトコルはプライマリ心臓フィーダー層と MSC 形成の組み合わせを利用しています。主な心臓フィーダー層と同様に、hMSCs が移植時にさらされている、差別化環境を提供します。凝集体は、酸素と栄養のグラデーションを分化系列決定を開始する誘導効果を持つことができる環境を生成します。低酸素向き前処理を用いた PSC と ESC に基づく心臓差別化戦略と会合体形成幹細胞5,52,53この誘導効果を設けてください。さらに、3 D 構造より提供される細胞間の接続の体内に似て...

うっ血性心不全 (CHF) は、罹患率と死亡率の世界の一流の原因として保持します。スイスフランは、心筋細胞の大規模な損失と心筋梗塞 (MI)1の病理の結果として瘢痕組織の細胞の開発を多く発生します。中心部は部分的に自己更新器官が、豊かさと多くの場合受傷後適切に回復するが不十分となった高齢者の患者の機能で常駐幹・前駆細胞プール大幅組織再生を実行するための責任が減少します。従って、健康なドナー細胞の損傷を受けた心筋への移植を含む実験的治療法の開発に大きな関心があります。ドナー細胞だけでなく、組織の構造を復元、また影響を受けた心筋の機能回復を達成するために不可欠です。
ネイティブの心は心臓組織に常駐を採用し、受傷後の内因性骨髄由来幹細胞修復2,3,4。再生細胞ホストとドナー由来もありますは、適切な表現と効率的にかつ安全に失われた細胞を置換する機能と共に、改造の心筋の微小環境で関数を取得する能力を持っています。In vitro分化の方法は、高効率、幹細胞を用いた心筋細胞生産5,6を達成するために広く使用されています。心臓系統マーカーの発現プロファイルを使用して、心臓系統7に向かって幹細胞分化のプロセスを定義します。初期分化マーカー、NKX2.5、心筋増強因子 2 C など (Mef2c) および GATA48,9、cardiomyogenic プロセスの開始を示すことができます。差別化の有効性を評価するために一般的に使用される成熟心筋細胞マーカーが信号調節タンパク質 α (SIRPA)10, 心筋トロポニン T (cTnT)11、重鎖心筋ミオシン (MYH6)8,12,13, とコネキシン 43 (cx 43)14,,1516。胚性幹細胞 (Esc) と多能性幹細胞 (Psc) を使用してメソッドは徹底的に最適し、誘導要因、酸素および栄養素のグラデーションの詳細とアクション5,6,7,17,18の正確なタイミングについて説明しました。それにもかかわらず、ESC と PSC ベースの技術はまだ次善の電気生理学的および免疫学的機能19,20と共に複数の倫理と安全性懸念を提示します。多くの場合これらの細胞移植ホストは、immunorejection を体験し、永久的な免疫抑制を必要とします。これは、主に主要組織適合性の複雑な (MHC) 分子ホストとドナーおよび結果 T 細胞応答21までの不一致によるものです。ながら個々 の MHC クラス I 可能な解決策は、マッチング、やすく実習が拒絶反応の懸念を克服するために immunoprivileged では普遍的に細胞ソースが必要があります。
特に、BMSCs、臨床では、MSCs 用代替細胞ソースとして 1995年22で彼らの初期の説明から歯周組織再生用検討しました。MSCs は、ほぼすべての血管柄付き組織23で見つけることができる居住者の再生細胞であると考えられています。目的のソースからの分離、MSCs 文化で容易に拡張することができます、広範な傍分泌能力を持っている、しばしば immunoprivileged または免疫調節特性24,25を持っています。その安全性と有効性既に示されているいくつかの臨床研究で特に心筋再生3,26。
多くの MSC 差別化戦略は、変数効率 5-アザシチジン22や DMSO27、および成長のような Bmp5,7,28,29またはアンジオテンシン II30、形態形成の要因などの薬理学的エージェントを利用します。これらの戦略は、素朴な再生細胞はホーミングまたは傷害のサイトに配信されている後に発生する可能性が障害物に基づいていないただし、体内。もっと生理学的に関連する戦略は、一方が難しく定義し操作、組織微小環境自体からの信号を通して MSC 分化を誘起することを前提に基づいています。以前の研究は心臓セル lysates31または心室心筋32,33, への曝露が示されているまたは直接プライマリ心筋細胞の in vitro15,34, との接触が MSCs で心臓マーカーの発現を高めることができます。他の人は一部、BMSCs と心筋細胞39,40の融合生成初期の心筋が MSCs35,36,37,38, 心臓傷害の治療後特発性心筋を実証しています。私たちの知る限り、ヒト MSCs (hMSCs) の組織の任意のソースから機能、自発的に引き締まる心筋細胞がまだ報告されていません。
現在のコンセンサスは、MSCs のすべてが血管周囲細胞23から発生することです。周皮細胞プロパティを持つ若い MSCs は、ひと臍帯組織41,42,43の血管領域から分離できます。BMSCs と比較して HUCPVCs は、潜在的な増加の分化と他のいくつかの再生の利点、両方生体外で41,44とin vivo45,46,47を所有しています。特に、妊婦の胎児のインターフェイス ソース、HUCPVCs MSCs の大人の情報源と比較して有意に低い免疫原性があります。我々 の研究に焦点を当てて評価と FTM HUCPVCs、調査、MSCs の最年少のソースの前臨床応用増殖性と高い multilineage を増加するいると我々 は以前に、分化能力、cardiomyogenic 系統41を含みます。
ここでは、MSCs。 集計の完了 cardiomyogenic 差別化を達成するために誘導の力より良い条件モデル生体内で2D 付着性文化と比較して 3 D 環境を提供するように、粒の形成と心筋細胞の主要な送り装置の層を組み合わせたプロトコルを提案する.心臓フィーダー層を利用した MSCs の究極移植サイトの代表である環境を提供します。集合体を形成し、彼らの免疫特権を維持しながらアダルト BMSCs に比べて心臓表現型に到達する能力が高いを前または出生後のへその緒から分離された MSCs の若いソースにことを示します。心臓系統マーカー遺伝子の誘導発現細胞内急昇格以外 (すなわち、 cTnT および MYH6) および細胞表面蛋白質 (すなわちSIRPA と配列とコネキシン 43) 心筋細胞の特定、紹介は FTM HUCPVCs の微分の潜在性ことができますこの方法で活かされることや心筋細胞のような細胞を自発的に契約に上昇を与えることができます。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>細胞解離用</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>HUCPVC および BMSC 培養培地用。</td></tr><tr><td>PE標識抗ヒト/マウスCD49f抗体</td><td>Biolegend</td><td>313612</td> FC <td></td></tr><tr><td>APC標識ヒトCx43/GJA1抗体</td><td>R&のインテグリンマーカーD Systems</td><td>FAB7737A</td> FC FITC標識HLA-A2抗体<td>用Connexin 43マーカー</td></tr><tr><td></td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>FC</td></tr><tr><td>FITC標識抗HLA-G [MEM-G/9]抗体</td>の免疫原性マーカー <td>Abcam</td><td>ab7904</td> FC <td></td></tr><tr><td>FITC標識マウス抗ヒトSIRPA/CD172a抗体</td><td>AbDの免疫原性マーカー Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>FC</td></tr><tr><td>APC標識ヒトTRA-1-85/CD147抗体</td>の心臓マーカー <td>R&Dシステム</td>ズ<td>FAB3195A</td><td>FCおよびFACS FITC</td></tr><tr><td>標識ヒトTRA-1-85/CD147抗体</td><td>R&用ヒト細胞マーカーD Systems</td><td>FAB3195F</td><td>FCおよびFACSのヒト細胞マーカー</td></tr><tr><td>抗コネキシン43/GJA1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43.ICC</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 交差吸収二次抗体、Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>ICC</td></tr><tr><td>抗肉体αアクチニン [EA-53] 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC 用。ICC</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>For ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>ICCロ</td></tr><tr><td>バ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>ICC</td></tr><tr><td>抗核(HuNu)(クローン235-1)抗体</td><td>EMDミリポア</td><td>MAB1281</td><td>ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>イメージング凝集体用。</td></tr><tr><td>1.5 ml 遠心分離機用マイクロチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>蛍光色素によるMSCの染色用。</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>オープンソースの画像処理ソフトウェア。</td></tr><tr><td>アリアII&nbsp;</td><td></td><td></td> BD <td>UHN SickKids FC施設。細胞の選別用。</td></tr><tr><td>骨髄中皮間質間質細胞</td><td>ロンザ</td><td>PT-2501</td><td>BMSC、</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>、シグマ-アルドリッチ</td><td>A7030-100G</td><td>BSA。ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td>の溶液を準備するには <td>MAB3424</td><td>注意:BrdUは強力な催奇形性物質であり、変異原性が疑われます。適切なトレーニングを確認し、使用前にSDSを参照してください。</td></tr><tr><td>Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC施設。フローサイトメトリー用。</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>For preparation of cDNA for qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>細胞質の蛍光イメージング</td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>細胞計数用</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>ラット初代心筋細胞培養液用。</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>D-PBS, Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>自社製蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>社内.フローサイトメトリー用。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(ハイクロン)</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH3039603</td><td>FBS.細胞培養培地の成分。</td></tr><tr><td>IDT Prime Time qPCR probes</td><td>Integrated Data Technologies FAM</td><td>fluorophore</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor 水性封入剤</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td></td> BD <td>UHN SickKids FC施設。フローサイトメトリー用。</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC施設。細胞の選別用。</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>5425S</td><td>NGS。ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek IIチャンバーカバーガラス、8ウェル</td>のブロッキング溶液に使用 <td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>ICC</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 界面活性剤</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td>のサンプル調製用 <td>ICC</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16%溶液、EMグレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>ICCの細胞固定用。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>細胞培養培地の成分。</td></tr><tr><td>プライマー</td><td>Sigma</td><td>カスタムスタンダード DNA オリゴ、脱塩、0.2 &mu;mol</td><td>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G Quorum</td></tr><tr><td>Spinning Disk Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardiohiPS細胞由来心筋細胞</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>qPCR用ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>qPCR用RNAを単離</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBRグリーンPCRキット</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>マスターミックスによるqPCR用</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>MSC用、単球共培養培地。</td></tr><tr><td>TaqMan qPCR プライマーアッセイ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4444556</td><td>qPCR トリ</td></tr><tr><td>パンブルー</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>T10282</td><td>生存率とカウントのための細胞の染色</td></tr><tr><td>トリプ</td><td>シン Gibco</td><td>272500108</td><td>細胞解離用</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>0.2 &mu;mポアフィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>566-0020</td><td>組織培養培地の滅菌用</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51026410</td><td>細胞のインキュベーション用</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, 塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Almedic</td><td>7727-A10-704</td><td>ネズミの心臓を手渡すため。同様の鉗子を使用できます。</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14059-11</td><td>ネズミの心臓をミンチにするため。湾曲したハサミをお勧めします。</td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>心筋細胞採取および一般組織培養手順中の収集用</td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>一般組織培養手順用</td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>10 cm 組織培養皿</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>凝集体形成用</td></tr><tr><td>Axiovert 40C 顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>組織培養とプロトコルの残りの部分を通じた明視野イメージング用</td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22363548</td><td>フローサイトメトリーまたはソーティングの前に単一細胞懸濁液を確保するため</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td> ICC Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 の<td>透過化溶液に使用</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Cx43局在の可視化に使用される染色</td></tr></tbody></table>

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

心筋梗塞とその後虚血性連鎖結果心筋細胞、うっ血性心不全、世界の死亡率の一流の原因につながるの広汎な損失。間葉系幹細胞 (Msc) は、現在、侵襲的な技術を交換する細胞ベースの治療に有望なオプションです。MSCs は、心筋細胞の種類を含む、間葉系の系統に区別できるが、完全な機能的な細胞分化がまだ達成されていません。以前の差別化の方法は、薬理学的エージェントまたは成長の要因に基づいていた。しかし、もっと生理学的に関連する戦略には MSCs cardiomyogenic 変換を受けることも可能です。心筋細胞のような収縮細胞を生産する心筋細胞の送り装置の層に MSC 骨材を用いた微分法を紹介します。
ひと臍帯血管周囲細胞 (HUCPVCs) がより大きい微分よりも潜在的なを持っている示されている一般的骨髄 MSCs (BMSCs) など、MSC の種類を調査しました。ひきつづいて若いソースとして古いソースと比較して妊娠 (FTM) の HUCPVCs の cardiomyogenic の可能性を検討した.FTM の HUCPVCs プロパティを保持、子宮内immunoprivileged 培養 MSCs の小説、豊かな源である生体外で。HUCPVCs この分化プロトコル、FTM の用語を使用して (すなわち、心筋増強物の要因 2 C、心筋トロポニン T、心筋ミオシンの重鎖、信号規定する蛋白質の α とコネキシン 43) 心筋細胞マーカーの発現の増加によって示されるように、BMSCs と比較して大幅に増加した cardiomyogenic 分化を達成しました。彼らはまた彼らの低い HLA A 式と高い HLA G 式で実証としての有意に低い免疫原性を維持しました。分化の集計ベースを適用すると、FTM HUCPVCs は、潜在的なと心臓フィーダー層を共培養後 1 週間以内のセルのクラスターを契約、そう最初の MSC 型になって生成された高められた形成を示した。
我々 の結果はこの差別化戦略 FTM HUCPVCs などの若い MSCs の cardiomyogenic の可能性を効果的に活用することができることを実証してから、その再生効果で体内を向上させる潜在的な戦略ができるその体外前分化を示唆しています。

HUCPVCsは、BMSCsと比較して、より高い凝集形成能およびCD49f発現レベルを示す：
hMSC（すなわちFTM HUCPVC、term HUCPVC、およびBMSC）の分化を誘導するため、未分化MSCの単一細胞懸濁液またはMSCを含むハンギングドロップ（Table 1）を、ラット一次心筋細胞単層上にそれぞれ移して、直接共培養または凝集共培養を構築した。3種類の異なるMSCは、直接共培養において同様の量と外見を示した（Figure 1A）。凝集共培養においてハンギングドロップを心筋細胞上に移してから2〜3日後（Table 1）、FTM HUCPVCおよびterm HUCPVCは、BMSC（180 µm ± 30 µm；<strong c...

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro 。

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

この実験手順の全体的な目的は、間葉系幹細胞の心筋分化誘導を行い、それを観察することです。本手法は、機能的な心筋細胞を生成するために、どのような環境シグナルによって治療的手段を誘導できるかという、間葉系幹細胞分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、薬理学的薬剤や遺伝物質ではなく、凝集体の形成と胎児心層を利用している点にあります。この手法は、間葉系幹細胞の心筋分化能を詳しく検討するものであるため、心血管疾患の治療への応用が期待されます。本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の博士課程学生であるFarwah Iqbal氏、および同研究室の研修員であるMax Librach氏とNadav Gasner氏です。テキストのプロトコルに従ってラット仔の部位を分離した後、心室を半分に切断し、10 mLのPBSを入れた10 cmディッシュに移して氷上で静置し、血液を洗浄してください。次に、曲剪を用いて、心室壁を直径2〜3 mmの小さな断片に切断します。セロロジカルピペットを用いて、10〜12匹分の心臓断片を50 mLチューブに移し、沈殿させます。心臓断片を失わないように注意しながら、PBS P/Sを可能な限り除去します。次に、新鮮なPBS P/Sを10 mL加えます。心筋細胞を単離するため、心臓の断片が沈降した後、PBS P/Sを0.15% trypsin in PBSに置換し、組織を37 °Cで10分間振盪しながらインキュベートします。その後、上清を廃棄します。次に、トリプシン消化をさらに3回繰り返します。ただし、上清は10 mLの100% FBSを含む50 mLの回収チューブにデカンテーションして回収してください。その後、細胞が入ったチューブを遠心分離し、上清を吸引します。続いて、10% FBSおよび1% P/Sを含むDMEM-F12を用いて細胞を再懸濁し、6ウェルプレートに播種します。細胞が付着した後、培地を2 mLの新鮮な培地に交換します。事前染色MSCを調製するためには、10 cmディッシュでコンフルエンシーが70%から80%に達したMSC培養液から培地を除去し、3 mLの細胞解離液を添加します。ディッシュを37 °C、5% CO2条件下で5分間インキュベートします。解離させた細胞を15 mLチューブに移し、400 x Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さないように上清を吸引し、細胞を再懸濁します。その後、自動細胞計数器を用いて細胞数をカウントします。10% FBSおよび1% P/Sを含むDMEM-F12を用いて、細胞を1 x 10⁶ MSCs/mLの濃度に希釈します。次に、1.5 mL遠心チューブに入れた細胞に、生存細胞用の非透過性蛍光染料を添加し、MSCを30分間インキュベートします。チューブを400 x gで5分間遠心分離した後、上清を吸引し、ペレットを1 x 10⁶ MSCs/mLの濃度で再懸濁します。次に、MSCを心筋細胞へ、6ウェルプレートの1ウェルあたり10 x 10⁴個の濃度で播種します。凝集共培養を行うには、10% FBSおよび1% P/Sを添加したα-MEMを用いて、MSCの単一細胞懸濁液を調製します。10 cm組織培養ディッシュの蓋の内表面に、細胞懸濁液を25 µLずつ滴下し、凝集体の形成を開始させます。PBS P/Sが入った底面容器に蓋をします。ディッシュを37 °C、5% CO2でインキュベートします。3日後、実体顕微鏡を用いて液滴内の凝集体の形成を観察します。液滴の80%以上に凝集塊が形成されている場合は、1 mLマイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、凝集塊をラット一次心筋細胞単層上に直接転移させます。凝集塊の共培養を最大2週間行います。その際、72時間ごとに培地を全量交換してください。毎日、明視野顕微鏡を用いて、胎児細胞層に付着する凝集塊を観察します。収縮する凝集塊が観察された場合は、それを記録します。活動的な凝集塊は同期して収縮しており、物理的な活動がない胎児層を通じて、それらの間に伝導性があることが示唆されます。培地を吸引し、6ウェルプレートの各ウェルに2 mLのPBSを加えます。次にPBSを除去し、各ウェルに2 mLの解離液を加えます。プレートを37 °C、5% CO2条件下で3分間インキュベートします。ここで示されているように、3種類の異なるHMSCは、直接共培養において同様の量と外観を示しました。凝集共培養においてハンギングドロップを心細胞上に転移させてから2〜3日後、FTMおよび終末分化huck PBCは、BMSCに見られたものよりも大きな凝集塊を形成しました。本実験において、未分化MSCのCD49F発現をフローサイトメトリーで分析したところ、FTM huck PBCの96%、term huck PBCの89%、BMSCの53%が細胞表面CD49F陽性であることが示されました。TRA won 85細胞のフローサイトメトリー解析では、直接心筋細胞共培養におけるFTM huck PBCsおよびterm huck PBCsにおいて、心筋細胞関連マーカーであるSIRPAの上昇が認められましたが、BMSCsでは認められませんでした。ここで示されているように、cx43の上昇は、直接共培養におけるterm huck PBCsまたはBMSCsと比較して、FTM huck PBCsで有意に高い値を示しました。蛍光顕微鏡分析により、分化中のFTMおよびterm huck PBCsのいずれにおいても、cx43が上昇していることが明らかになりました。term huck PBCsはFTMsよりも高い割合を示しました。しかし、蛍光顕微鏡観察により、FTM huck PBCsの細胞膜にはcx43陽性の点状構造（puncta）が観察されたのに対し、term細胞では主に細胞質に存在することが明らかになりました。最終的に、こちらに示すように、共培養後にソートしたヒト細胞に対して高倍率蛍光顕微鏡観察を行い、形質膜におけるcx43の高発現が確認されました。この手順の主要なステップは、適切に実施すれば、習得後はそれぞれ1時間で完了させることができます。この手順を行う際は、無菌操作を維持することが重要です。適切に処理されない場合、使用する動物一次組織から汚染が導入される可能性があります。本手順の後、収縮する凝集体のさらなる培養などの他の手法を行うことで、これらの構造体の生存期間といった追加の疑問を解明することができます。この技術の開発により、MSC分野の研究者は、胚外組織などのより若い供給源である間葉系幹細胞の分化能を探索することが可能になります。このビデオを視聴することで、MSC凝集体を調製し、それらを直接的な一次組織の胎児層と組み合わせることで、心筋分化に適切な誘導を行う方法について十分な理解を得られるはずです。BRDUの使用は極めて危険であるため、本手順の実施にあたっては、細胞毒性廃棄物の適切な処理などの予防策を常に講じてください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

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小分子変調分化とその後のグルコース飢餓を用いたヒト人工多能性幹細胞からの高度に精製された心筋細胞の導出

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。...

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多電極アレイ（MEA）を用いたヒト多能性幹細胞由来心筋細胞（hPSC-CM）の電気生理学的解析

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体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

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