体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

この実験手順の全体的な目標は、間葉系幹細胞の心筋原性誘導を誘導および観察することです。この方法は、環境シグナルによって機能的な心筋細胞を生成するためにどのような治療法を誘発できるかなど、間葉系幹細胞分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、薬理学的薬剤や遺伝物質の代わりに、凝集体形成と心臓の胎児層を適用することです。

この技術の意味は、間葉系幹細胞の心筋形成の可能性を詳しく説明しているため、心血管疾患の治療にまで及びます。私と一緒にこの手順を実演するのは、私たちの研究室の博士課程の学生であるミス・ファルワ・イクバル、私たちの研究室の研修生であるマックス・リブラッハとナダブ・ガスナーです。テキストプロトコルに従ってラットの子犬の部分を分離した後、心室を半分に切断し、10ミリリットルのPBSと氷の上のピンストライプを入れた10センチメートルの皿に移し、血液を洗い流します。

次に、湾曲したハサミを使用して、心室壁を直径2〜3ミリメートルの小片に切断します。血清学的ピペットを使用して、10匹から12匹の動物から心臓片を50ミリリットルのチューブに移し、それらを落ち着かせます。ハートピースを取り外すことなく、できるだけ多くのPBS P / Sを削除します。

次に、10ミリメートルの新鮮なPBS P / Sを追加します。心筋細胞を単離するには、心臓片が落ち着いた後、PBS中の0.15%トリプシンを使用してPBS P / Sを交換し、組織を摂氏37度で10分間振とうします。上清を捨てます。

次に、トリプシン消化をさらに3回繰り返しますが、上清をデカンターして、100%FBSの10ミリリットルを含む50ミリリットルのコレクションチューブに入れます。次に、細胞のチューブを遠心分離し、上清を吸引します。次に、DMEM-F12を10%FBSおよび1%P/Sで使用して細胞を再懸濁し、6ウェルプレートに播種します。

細胞が付着したら、培地を2ミリリットルの新しい培地と交換します。染色済みMSCを調製するには、10cm皿で70%から80%のコンフルエントに達したMSC培養物から培地を取り出し、3ミリリットルの細胞解離溶液を加えます。皿を摂氏37度と二酸化炭素5%で5分間インキュベートします。

解離した細胞を15ミリリットルのチューブに移し、400 x Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引し、細胞を再懸濁します。次に、自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。

細胞を10%FBSおよび1%P / Sを含むDMEM-F12で、1ミリリットルあたり1×10〜6番目のMSCの濃度に希釈します。次に、1.5ミリリットルの遠心チューブ内の細胞に、生細胞、転写不能な蛍光色素を添加し、MSCを30分間インキュベートします。チューブを400 x Gで5分間遠心分離した後、上清を吸引し、ペレットを1 x 10の濃度で1ミリリットルあたり6番目のMSCに再懸濁します。

次に、MSCを10 x 10の濃度で心筋細胞に、6ウェルプレートのウェルあたり4番目の細胞に移します。凝集体共培養を行うには、10%FBSおよび1%P / Sを添加したαMEM中のMSCの単一細胞懸濁液を調製し、10センチメートルの組織培養皿の蓋の内面に細胞懸濁液の25マイクロリットル滴を置くことにより、凝集体形成を開始します。

PBS P / Sを含む底の対応物に蓋を置き、摂氏37度と二酸化炭素5%で皿をインキュベートします。実体顕微鏡下で、3日後に液滴中の凝集体形成を観察します。

液滴の80%以上に形成された凝集体が含まれている場合は、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、凝集体を直接初代ラット心筋細胞単層に移します。凝集体共培養物を最大2週間インキュベートします。メディウムの全容量は72時間ごとに交換します。

日常的には、明視野顕微鏡を使用して、胎児の細胞層に付着している凝集体を観察します。観察されたら、収縮する骨材を記録します。活性凝集体は同期して収縮し、身体活動のない胎児層全体でそれらの間のコンダクタンスを示唆しています。

培地を吸引し、6ウェルディッシュのウェルごとに2ミリリットルのPBSを追加します。次に、PBSを取り外し、ウェルごとに2ミリリットルの解離溶液を追加します。皿を摂氏37度と二酸化炭素5%で3分間インキュベートします。

ここに示すように、3つの異なるタイプのHMSCは、直接共培養で同様の存在量と外観を示しました。凝集体共培養でハンギング滴を心細胞に移してから2〜3日後、FTMとタームハックPBCは、BMSCから見られるものと比較してより大きな凝集体に現れました。この実験では、未分化MSCにおけるCD49F発現のフローサイトメトリー解析により、FTMハックPBCの96%(ハックPBCの89%、BMSCの53%)が細胞表面CD49Fに陽性であることが示されました。

TRA上のフローサイトメトリーは85細胞を獲得し、FTMハックPBCおよびタームハックPBCにおける心筋細胞関連マーカーSIRPAのアップレギュレーションを示しましたが、直接心筋細胞共培養からのBMSCでは示されませんでした。ここで見られるように、cx43のアップレギュレーションは、直接共培養のタームハックPBCまたはBMSCと比較して、FTMハックPBCで有意に高かった。蛍光顕微鏡分析により、FTMとタームハックPBCを区別すると、どちらもcx43がアップレギュレーションされることが明らかになりました。

タームハックPBCはFTMよりも高い部分にあります。しかし、蛍光顕微鏡法により、FTMハックPBCの細胞膜にcx43陽性の点が観察され、それらは主に正期産の細胞質であることが明らかになりました。最後に、ここで見られるように、共培養後に選別されたヒト細胞に対して高倍率蛍光顕微鏡法を行い、原形質膜中のcx43の存在量が高いことを確認しました。

マスターすると、この手順の主要なステップは、適切に実行されれば、それぞれ1時間で完了することができます。この手順を試みるときは、無菌予防策を維持することが重要です。適切に取り扱わないと汚染を引き起こす可能性のある一次動物組織が関与しています。

この手順に続いて、収縮する凝集体のさらなる培養のような他の方法を実行して、これらの構造の寿命などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術により、MSCの分野の研究者は、余分な胚組織などの間葉系幹細胞の若い供給源の分化の可能性を探求することができます。このビデオを見た後、MSC凝集体を調製し、それらを直接の胎児一次組織層と組み合わせて、心筋原性分化に適切な誘導を提供する方法についてよく理解しているはずです。

BRDUでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、細胞毒性廃棄物の適切な取り扱いなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。