ラットの断面アキレス腱の治癒過程に及ぼす同種多血小板血漿 (PRP): 方法論的説明

この手順の全体的な目標は、多血小板血漿 (PRP) の単回注射が、さまざまな時点で外科的に切片化されたラット アキレス腱の耐性と治癒プロセスに及ぼす影響を観察することです。この方法は、腱の病変に関する筋骨格フィールドに関する簡単な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、外科的、生体力学的、および PRP 進行手順が十分に標準化されていることです。

これらの技術の意味は、ラットとヒトの間でこれらのタイプの病変と腱の治癒過程が類似しているため、ヒトでのPRPの使用にまで及びます。この方法は、筋骨格系損傷のPRP調製に関する洞察を得ることができますが、この注射技術は、心臓病や皮膚疾患などの他のシステムにも適用できます。この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。なぜなら、外科的および生体力学的ステップでは、最適な結果を得るために一貫した再現性が必要なからです。

ラットの体重を量り、耳にタグを付けることから始めます。つま先をつまんで適切な鎮静量を確認した後、動物の角膜に水滴を当て、左後肢の毛を取り除きます。露出した皮膚を1〜10希釈のイソベタジン溶液で消毒し、動物を解剖顕微鏡下の摂氏20度の加熱パッドに置き、左側褥位で、左後肢を上端に置きます。

鉗子で左後肢の足をつかみ、アキレス腱の周りに20〜25ミリメートルの横方向の皮膚切開を行います。細いハサミを使用して、筋膜を解剖してアキレス腱複合体を露出させ、足底腱を取り除きます。アキレス腱を横方向に、踵骨の挿入部に近位5ミリメートルで切断し、5ミリメートルの長さの部分を取り除きます。

次に、再吸収性糸を使用し、縫合糸を続けて筋膜と皮膚を閉じ、ラットを完全に回復するまで監視しながら熱源の下に置きます。レシピエント動物が回復している間に、実験動物1匹につき1匹のドナーラット心臓から20ミリリットルの全血を、3.2%緩衝クエン酸ナトリウムを含む個々のチューブに集めます。多血小板血漿を得るには、血液を遠心分離し、プラスチックトランスファーピペットを使用して、上部PRP含有相を2番目のプラスチックチューブに慎重に採取します。

収集されたPRPの量を決定し、血液分析装置で血小板数を測定します。PRPを再度遠心分離し、上清を新しいプラスチックチューブに慎重に移します。PRPチューブ内の残りの容量は、マイクロリットルあたり10から6番目の血小板の2.5倍を達成するために必要な容量の約2/3である必要があります。

次に、ピペッティングで血小板ペレットを静かに再懸濁します。この濃縮された多血小板血漿の血小板数を測定し、必要に応じて適切な量の自家血小板小板血漿を再び追加して目標濃度に到達します。PRP1ミリリットルあたり50マイクロリットルの塩化カルシウムで血小板を室温で約1時間活性化します。.

次に、21ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器に血小板を装填し、各動物の縫合部位に直接50マイクロリットルの血小板を注入します。適切な実験エンドポイントで、麻酔をかけた実験動物の左後肢を剃り、示したようにラットを解剖顕微鏡下に置きます。指で足を持ち、手術部位に10ミリメートルの切開を行い、上腕三頭筋を露出させます。

アキレス腱を切除するには、踵骨を横方向、その付着部から5〜10ミリメートル遠位に切断し、クライオ顎に収まるのに十分な大きさの上腕三頭筋の一部を解剖します。鉗子を使用して、サンプルをクライオジョーの上顎にすぐに置き、装置を閉じます。クライオジョーを垂直に万能試験機に置き、下部クランプの間に踵骨を固定します。

断面積を計算するには、カメラを互いに垂直に配置します。両方の上顎の洗面器に液体窒素を加えて、筋肉を腱よりも一桁硬く凍結させ、引張試験中に筋肉が変形しないようにします。凍結ゾーンが金属クランプの境界に達したら、破裂するまで機械の変位速度を毎秒1ミリメートルの一定速度に設定し、コンピューターを使用して引張試験を開始し、ニュートンで究極の引張強度を記録します。

治癒腱の断面積の違いを考慮するには、組織の機械的応力を表す単位面積に極限引張強度を正規化します。その後、腱が断裂した場合は、断裂した腱サンプルを液体窒素でスナップ凍結し、RNA抽出とRTPCR分析まで摂氏マイナス80度で保存します。この代表的な実験では、PRPを注入した群では、対照生理食塩水処理群よりも腱の断裂を誘発するために、試験した各時点でより大きな力が必要でした。これは、PRP治療動物内でより堅牢な治癒過程またはより優れた機械的特性を示唆しています。

PRP群は生理食塩水群よりも高い群内散乱を示したが、病変誘発後15日目と30日目には、PRP注射群の方が腱の断面積が大きいことが分かった。さらに、Massonのトリクローム染色は、PRP処理動物において、5日目と15日目に、腱の形態と強度の重要な構成要素である線維性コラーゲンの存在が高いことを明らかにし、注射後30日目までに両群で同様の染色強度が観察されました。このビデオを見た後、ラットの標準的な病変を誘発する方法と、PRP注射後の治癒過程を評価するために腱をサンプリングする方法についてよく理解しているはずです。