バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術コレラ（Vibrio cholerae）臨床分離株

この技術の全体的な目標は、実施が簡単で、研究者がコレラ菌の特定の臨床的または環境的分離株を特徴付けるのに役立つプロトコルのコレクションを提供することです。この方法は、コレラ菌分離株の特定の遺伝子型および表現型の特徴、特に臨床的に関連性のある特性など、細菌学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、研究者がこのアッセイのコレクションを使用して、臨床的または環境的なコレラ菌分離株を確実に特徴付け、区別できることです。

これらのアッセイは、コストのかかる労働集約的な実験や、コレラ菌の臨床および環境分離物の特性評価の代替として、または追加として使用できる体系的なアプローチを提供します。この方法は、コレラ菌のバイオタイプの特性評価に関する洞察を得ることができますが、他の腸内細菌の生化学的および代謝能力を特徴付けるためにも適用できます。一般に、この方法を初めて使用する人は、最適な結果を得るために必要なインキュベーション時間が生化学的アッセイによって異なるため、時間管理に苦労します。

スプラッターはしばしば交差汚染につながる可能性があり、培養間の融合を防ぐために最大限の間隔が必要になるため、スポッティングとスタブのプロトコルの視覚的なデモンストレーションは重要です。プロトコールは、滅菌済みの2mL微量遠心チューブ内で最低8,600xGの遠心分離により、1.8mLの液体を一晩培養して2分間ペレット化することから始めます。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより細胞ペレットを900 mcLの新鮮なLuria-BertaniまたはLBブロスに再懸濁します。

次に、900 mcLの滅菌60%容量対体積グリセロールを培養物に加え、ボルテックスして混合します。混合物を滅菌済みの2 mL極低温チューブに移し、ストック培養物を摂氏80度で保存します。ストックを使用するには、滅菌接種ループを使用して、少量の凍結ストックを取り除き、細菌をスリークしてLB寒天プレート上に単一のコロニーを取得します。

凍結ストックは使用後すぐに80°Cに戻し、培養物が完全に解凍されるのを防ぎます。プレートの蓋を下にして、摂氏37度で12〜16時間インキュベートします。事前に準備したプレートを入手します。

単一コロニーの表面に触れ、コロニーを液体ブロスに移すことにより、単一コロニーの滅菌10 mL培養チューブに4 mLの液体LBブロスを接種します。次に、培養物をシェーカーインキュベーター内で225rpmの曝気により、摂氏37度で12〜16時間インキュベートします。液体LBブロスで一晩培養します。

翌日、培養物をペレット化し、細胞ペレットを1.8 mLの1倍リン酸緩衝生理食塩水またはPBSに再懸濁して細胞を洗浄します。洗濯手順を3回繰り返します。3回目の洗浄後、1x PBSの1.8 mLで最終再懸濁します。

次に、ピペットチップを使用して、それぞれの培地で1 mcLの洗浄済み培養物を見つけます。一晩培養して得られた細胞ペレットを洗浄します。洗浄した液体培養物に接種スタブを挿入し、培地に垂直に刺すことにより、運動性寒天プレートに接種します。

寒天を刺すときに接種刺し傷が曲がらないようにしてください。各接種の間に、ブンゼンバーナーを使用してワイヤースタブを滅菌します。プレートの蓋を上にして、摂氏37度で14〜24時間インキュベートします。

14時間後、培養物の異常増殖を防ぐために、運動プレートを綿密に監視します。滅菌培養チューブ内で、あらかじめ調製した一晩培養液10 mcLを4 mLのMR-VPブロスにピペッティングして、4 mLのMethyl Red Voges-ProskauerまたはMR-VPブロスに接種し、シェーカーインキュベーターで225 rpmで37°Cで12〜16時間エアレーションしてインキュベートします。次に、150 mcL の 5% 質量の Α-ナフトールと 50 mcL の 40% 重量 / 容量の水酸化カリウムを、MR-VP の 1 mL アリコートにそれぞれ無菌培養チューブで一晩加えます。

次に、チューブを短時間渦巻きにします。色の変化が発生するまで、チューブを室温で最大4時間放置します。バイオタイプ参照株および代表的なEl Tor変異体をPCRベースの遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイに含めて、V.Choleraeの臨床分離株と環境分離株のバイオタイプ背景を区別しました。

野生型の古典的O395は、古典的なctxBおよびtcpA配列を示した。逆に、野生型のEl Tor株N16961およびC6706は、El Tor ctxBおよびtcpA配列を示しました。MQ1795およびBAA-2163には、0395に匹敵する古典的なバイオタイプctxBサブユニットが含まれています。

しかし、両方のEl Tor変異体には、El Torのバイオタイプの背景を示すtcpAが含まれていました。ポリミキシンBを添加したLB寒天培地で増殖させたところ、野生型の古典的バイオタイプ株0395はポリミキシンBに対する感受性を示し、野生型のEl Torバイオタイプ株は耐性を示しました。代表的なEl Tor変異株は、抗生物質に対して同様の耐性を示しました。

このビデオを見れば、この原稿で概説されているマルチプルアッセイ同定システムを使用して、コレラ菌のバイオタイプを区別する方法について十分に理解できるはずです。BSL-2病原体の取り扱いは非常に危険であり、すべての材料と廃棄物の適切な取り扱いと廃棄は、機関、地方、州、および連邦の規制に従って実施する必要があることを忘れないでください。この原稿に記載されているプロトコルに加えて、バイオフィルム形成や自己凝集などの他の表現型特性を調査することにより、コレラ菌分離株のさらなる特性評価を達成できます。