Name: バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術コレラ（Vibrio cholerae）臨床分離株 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶVibrio choleraeのバイオタイプ識別法。臨床株と環境株を生化学的アッセイで迅速に区別し、コレラ菌の特性解析を効率的に行う実験技術です。

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New Hampshire-INBREの支援を受け、NIHの全米医科学研究所の施設開発賞（IDeA）、P20GM103506によって支援されました。

注：各アッセイの時間の考慮事項は、個々の培地調製が異なる時間を必要とするために行う必要があります。例えば、固体寒天プレート培地は、十分に冷やして乾燥させるべきである（1~2日）。追加の時間の考慮（ すなわち、単一コロニーおよび一晩の培養増殖）は、各プロトコルの下で特定され、 表2に見られる。 1.メディアの準備<ol><li> 1×リン酸緩衝食塩水（PBS） <ol><li> 4.0gのNaCl、0.1gのKCl、0.72gのNa 2 HPO 4 、および0.12gのKH 2 PO 4を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水で容量を500mLに調整し、pH計を用いてpHを7.2に調整し、HClを溶液に滴下し、0.22μmフィルターを用いてオートクレーブまたはフィルターで滅菌する。 1x PBSは室温で無期限に保存できます。 注意：HClは濃酸ですので、施設、地方、州、および連邦の規制に適用されます。適切な取り扱いガイドラインについては、製造元が提供する安全性データシートを参照してください。 </li></ol></li><li> Luria-Bertani（LB）ブロス <ol><li> 5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、および2.5gのNaClを計量する。構成成分を1Lボトルに混合し、脱イオン水、オートクレーブで容量を500mLに調整し、室温で最大6ヶ月間保存する。古典的なバイオタイプ毒性誘発条件については、オートクレーブする前にHClを用いてpHを6.5に調整する。 </li></ol></li><li> 0.03％（w / v）のNaHCO 3を含有するAKI培地 <ol><li>成分1（AKI培地）について：ペプトン7.5g、酵母エキス2.0g、NaCl 2.5gを計量する。構成成分を1Lボトルに混合し、脱イオン水およびオートクレーブで容量を450mLに調整する。 AKI培地は、室温で最大6ヶ月間保存することができます。 </li><li>成分2（NaHCO 3 ）の場合：1.5gのNaHCO 3を秤量し、滅菌ベシクル中の脱イオン水で50mLに希釈する。 0.22μmフィルターを使用してNaHCO 3を濾過滅菌する。 NaHCO 3は、使用直前に調製しなければならない。 </li><li>使用前にコンポーネント2をコンポーネント1にフィルタリングすることにより、1：10の比率を作成する2つのコンポーネントを無作為に組み合わせます。 </li></ol></li><li> Luria-Bertani（LB）寒天プレート <ol><li> 5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、2.5gのNaCl、および7.5gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水、オートクレーブで容量を500mLに調整し、標準サイズの100mm×15mm滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、最大6ヵ月間プラスチックで包まれ、4℃で蓋の上に保管されます。 </li></ol></li><li> ポリミキシンBを補充したLB寒天プレート <ol><li>成分1（LB寒天）の場合：5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、2.5gのNaCl、および7.5gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコに混合し、容量を500mLに調整する脱イオン水およびオートクレーブに入れた。 </li><li>成分2（ポリミキシンB）の場合：ポリミキシンBを脱イオン水に滅菌2 mL微量遠心チューブで50,000 IU /μLの濃度で溶解し、0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌する。 </li><li>成分1が触ってもまだ凝固していないが、凝固していない場合は、無菌的に成分2に500μLを加えて最終濃度50IU /μLとし、完全に混合する。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、標準サイズの100mm×15mmの滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、3ヵ月まではプラスチックで包まれ、4℃では蓋の上に保管されます。 </li></ol></li><li> 最小クエン酸培地寒天培地 <ol><li>成分1（ブロモチモールブルーを含む寒天）：7.5gの寒天と0.02gのブロモチモールブルーを計量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水で容量を450mLに調整し、混合物をオートクレーブする。 </li><li>コンポーネント2（10x VBMM）の場合：10.06gのMgSO 4・ 7H 2 O、10.0gのクエン酸H 2 O、50.0gの無水K 2 HPO 4 、および17.5gのNaNH 4 HPO 4・ 4H 2 Oを含む.1L三角フラスコ中の成分を合わせ、500mL 0.22μmのフィルターを用いて脱イオン水およびオートクレーブまたはフィルターで滅菌する。 10x VBMMは室温で6ヶ月まで保存できます。 </li><li>成分1に50mgの成分2を添加し、混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、標準サイズの100mm×15mm滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、最大6ヵ月間プラスチックで包まれ、4℃で蓋の上に保管されます。 </li></ol></li><li> ミルク寒天プレート <ol><li>構成成分1（ミルク）の場合：1リットル三角フラスコ中で脱脂粉乳8.0gを秤量し、脱イオン水およびオートクレーブで容量を200mLに調整する。 </li><li>成分2（脳心臓注入を伴う寒天）：脳心臓注入物3.68gおよび寒天6.0gを秤量する。コンバインド500 mLの三角フラスコに入れ、脱イオン水とオートクレーブで容量を200 mLに調整する。 </li><li>オートクレーブ後、成分2を成分1に注ぎ、2つの成分を混合し、完全に混合する。 150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。ミルクプレートは、プラスチックで包まれた1週間まで保存することができ、リッド側は4℃で保存することができます。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。 </li></ol></li><li> 運動性寒天プレート <ol><li>成分1（LB寒天）について：5.0gのトリプトン、2.5gの酵母抽出物、2.5gのNaCl、および2.0gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコに入れ、脱イオン水とオートクレーブで容量を500mLに調整する。 </li><li>成分2（1％（w / v）塩化トリフェニルテトラゾリウム; TTC）：0.25gのTTCを秤量する。滅菌ベシクル内の脱イオン水で25 mLに調整し、0.22μmフィルターを使用してフィルターを滅菌します。室温で6ヶ月間保管してください光の暴露を最小限にするために箔で覆われています。 </li><li> 2.5mLの1％（w / v）滅菌TTCをオートクレーブした培地に加える。 </li><li>大150 mm×15 mmの滅菌ペトリ皿に培地をできるだけ厚く（≧50 mL /プレート）注ぎます。メッキされた培地は、1週間までプラスチックに包まれ、4℃で蓋が上になるように保管することができます。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。 </li></ol></li><li> ヴォーグ・プロスカウアー（VP） <ol><li>成分1（Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP）：500mLの三角フラスコ中で1.7gのMR-VP培地を秤量し、脱イオン水およびオートクレーブで100mLに調整する。無菌MR-VPブイヨンは、室温で最大6ヶ月間保存することができます。 </li><li>成分2（5％（w / v）アルファ（α）ナフトール）：滅菌ベシクル中で1.0gのα-ナフトールを秤量し、95％エタノールで20mLに調整する。 α-ナフトールは、光を最小限に抑えるために、ホイルで包んだ最長1週間室温で保存することができますオスレ。 </li><li>成分3（40％（w / v）水酸化カリウム; KOH）：滅菌ベシクル中で20.0gのKOHを秤量し、滅菌脱イオン水で50mLに調整する。 KOHはプラスチック容器内で室温で6ヶ月まで保存することができます。 </li></ol></li></ol> 2. Vの維持と成長コレラ菌株<ol><li> 凍結ストック培養物の調製および使用 <ol><li>滅菌2 mL微量遠心管内で遠心分離（≧8,600 xg）により2分間、1.8 mLの液体一晩培養し、上清を除去し、新鮮なLBブロス900μLにピペットで再懸濁する。 </li><li>滅菌60％（v / v）グリセロール900μLを培養液に加え、ボルテックスで混合する。 </li><li>混合物を滅菌2 mL極低温チューブに移し、無期限に-80°Cで保存します。 </li><li>使用するには、滅菌接種ループを使用して少量の凍結ストックを除去し、LB agarプレート。培養物が完全に解凍するのを防ぐため、使用後は直ちに凍結保存液を-80℃に戻します。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li></ol></li><li> 液体培地中での一夜培養の増殖 <ol><li>凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニー（セクション2.1.4による）についてのストリーク。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li><li>無菌のアプリケータースティックで単一のコロニーの表面に触れ、コロニーを液体ブロスに移すことによって、単一のコロニーを有する滅菌10mL培養チューブ中に液体LBブロス4mLを接種する。 </li><li> 37℃で12〜16時間、225rpmでのシェーカーインキュベーター中での通気によりインキュベートする。 </li></ol></li><li> 成長曲線 <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。 </li><li> 250μLの一晩培養液を2に移すことによって一晩培養物を1：100に希釈する滅菌250mL三角フラスコ中の5mLの新鮮なLBブロス。 </li><li>接種時（T 0 ）に開始する毎時600nm （OD 600 ）の液体培養物の光学密度を測定する。 </li><li> 37℃で30時間まで225rpmのシェーカーインキュベーター中で、または培養物が最大密度に達するまで、1：100希釈の一晩培養物をインキュベートする。 </li><li> OD 600対時間をグラフ化し、線形回帰を使用して各株のおよそ2倍の時間を決定する。 </li></ol></li><li> El Tor Biotype毒性誘導条件 <ol><li>凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニーの連鎖。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li><li> 0.03％（w / v）のNaHCO 3を含む10mLのAKI培地に単一のコロニーを接種する。 </li><li>通気せずに37℃で3.5時間培養物をインキュベートする。 </li><li> 7 mLの培養液を除去し、残りの3 mLの培養液をインキュベートする。さらに4時間225rpmでシェーカーインキュベーター内で通気させる。 </li></ol></li><li> 古典的なバイオタイプの病原性誘導条件 <ol><li>凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニーの連鎖。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li><li>単一のコロニーを有する4mL液体LBブロス（pH6.5）を接種する。 </li><li> 30℃で12〜16時間225rpmでシェーカーインキュベーター中で通気してインキュベートする。 </li></ol></li><li> 1×PBS中で細胞ペレットを洗浄する <ol><li>滅菌2 mL微量遠心管内で遠心分離（≧8,600 xg）により2分間、1.8 mLの一晩培養し、ピペットを用いて上清を除去する。ピペッティングにより1.8mLの1×PBS中で細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>洗浄手順を3回繰り返した後、1.8mLの1×PBSで最終的に再懸濁する。 </li></ol></li></ol> 3. Vのキャラクタリゼーション。 コレラバイオタイプ<ol><li> PctxBおよびtcpAを用いたCRベースの遺伝的スクリーニング<ol><li> ctxBおよびtcpAの翻訳開始および停止部位の上流および下流にそれぞれ約50〜70bpをアニールするプライマーセットを設計する。 </li><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。 </li><li>グラム陰性細菌用に設計された市販のキットを用いて染色体DNAを単離する。精製された染色体DNAは、-20℃で無期限に保存することができます。市販のキットを用いた染色体DNA単離は、一般に約4時間かかる。 </li><li>微量分光光度計を使用して、染色体DNAサンプルが高品質であることを確認します（A 260/280 &gt; 1.8）。 </li><li>各染色体DNA単離物について、滅菌200μLPCRチューブ中で氷上でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、標準PCR成分を用いてctxBおよびtcpAの領域を増幅する： Taqポリメラーゼおよびbuffer（または等価物）、dNTP溶液、およびフォワード/リバースプライマーを含む。標準的なPCRパラメータを使用する（約3時間）。たとえば、次のプロトコルを使用します。 <ol><li> 95℃で120秒間の初期変性。 </li><li> 95℃で60秒間変性させる。 </li><li> 60℃で45秒間アニールプライマー。 </li><li> 72℃で90秒間伸長する。 </li><li>手順3.1.5.2〜3.1.5.4を34サイクル繰り返します。 </li><li>最終伸長は72℃で600秒。 </li><li> 4℃で無限に保持する。 </li></ol></li><li>標準的な6×DNAゲルローディング色素を用いて5μLのそれぞれのPCR産物を染色し、1×トリス - ボレート-EDTA（TBE）中の1％アガロースゲル上に約10μLの1kbラダーおよび10μLのPCR産物を負荷する。バッファ。 </li><li>染料フロントがゲルの末端に到達するまで（130分）、130Vでゲル電気泳動を行う（約90分）。一定の監視は電圧として推奨され、実行時間は機器によって異なります。 </li><li>確認時期待されるサイズでのPCR増幅が成功したら、市販のDNAクリーン＆コンセントレーターキットを使用して残りの45μLPCR産物を精製する。 </li><li> PCR増幅に使用したのと同じプライマーを用いてPCR産物を精製し、局所シーケンシング施設のガイドラインに従って調製する。 </li><li>各単離物からの遺伝子配列のFASTAフォーマットと、NCBIウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）で入手可能な公開配列とを、検索クエリーボックス内の以下の受託番号を検索することによって比較する。 </li><li> ctxB ：VC0395_A1059からVC0395_A1060（El Tor）までの（古典的な）領域VC_1456 </li><li> tcpA ：（古典的）VC0395_A0353（エル・トール）VC_0828 </li></ol></li><li> スポッティングによる生物型分類のための表現型アッセイ <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。 </li><li>プロトコル2.6で指定されているように細胞ペレットを洗浄する。 </li><li>ピペットを使用して洗浄した培養液1μLをそれぞれの培地にスポットする。培地の選択およびインキュベーションの仕様については、表2を参照してください。 </li></ol></li><li> 運動性アッセイ <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LBブロス中で一晩培養液を調製する。 </li><li>プロトコル2.6で指定されているように細胞ペレットを洗浄する。 </li><li>接種したスタブを洗浄した液体培養物に挿入し、培地中に垂直に「刺す」ことにより、運動性寒天プレートに接種する。各接種の間に、ブンゼンバーナーを用いてワイヤースタブを滅菌し、寒天を刺したら接種したスタブが曲がらないようにしてください。 </li><li> 37℃で14〜24時間、プレートの蓋を上にしてインキュベートする。 14時間後、運動性プレートを密接にモニターして、培養物の過剰増殖を防ぐ。 </li></ol></li><li> Voges-Proskauer（VP）アッセイ <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LBブロス中で一晩培養液を調製する。 </li><li>接種4前もって調製した一晩培養物10μLを滅菌培養チューブ中の4mLのMR-VPブロス中にピペッティングし、シェーカー・インキュベーター中で225rpmで12〜16日間曝気してインキュベートすることにより、メチルレッド・ボージュ・プロスカウアー、 hで37℃でインキュベートした。 </li><li>滅菌培養管中でMR-VP一晩培養の1mLアリコートに5％（w / v）α-ナフトール150μLおよび40％（w / v）KOH50μLをそれぞれ添加する。 </li><li>短時間ボルテックスして、色の変化が生じるまで室温で4時間まで放置する。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

200以上の識別されたVのうち、 コレラ血清型、O1およびO139のみが流行の可能性がある。 O1血清群は、古典的およびエル・トールという2つのバイオタイプに分類することができる。しかしながら、El Tor変異体13,17と呼ばれるハイブリッド株は、El Torバイオタイプの背景を有し、古典的な特徴8,9,10,11,12,13,14,15,16,17を有する。この原稿に記載されているプロトコルは、 V. choleraeの様々な臨床分離株および非臨床分離株の特性決定および/または区別に関心を持つ研究者に、信頼できるマルチアッセイ同定システム。代案として信頼できるマルチアッセイ同定システムを使用することは、以前に確立された単一アッセイ同定システムおよび労働集約的な遺伝子スクリーニングを上回る改善である。すべての遺伝子型および表現型アッセイは、比較のためにWT古典的株O395およびWT E1 Tor株C6706およびN16961を含むべきである（ 表1 ）。我々の研究に含まれているMQ1795やBAA-...

コレラ（Cholera）は、水生グラム陰性細菌であるコレラ菌（Vibrio cholerae）を含む汚染された食物または水の消費によって引き起こされる遠位小腸の病気である。 コレラの症状には、吐き気や制御不能な水様の下痢があり、重度の脱水症状につながり、適切に治療しなければ死に至る。 V。 コレラは、細胞表面リポ多糖O-抗原の構造に基づいて200を超える血清群に分けることができる。しかし、O1とO139の2つの血清群のみが、流行またはパンデミックの可能性1,2を示している。さらに、血清群O139は、主に東南アジア3、4に単離され、血清群O1は世界中に分布している。さらに、O1血清群は、2つの主なバイオタイプに分類することができる：クラシックおよびエル・トール。古典的なバイオタイプは、最初の6つのコレラパンデミック進行中の第七のパンデミックは、環境の古典的バイオタイプを世界的に置き換えたEl Torバイオタイプの結果である5,6,7 。最近、古典的およびエルトールバイオタイプ8,9,10,11,12,13,14,15,16,17の両方の顕著な特徴を含む株が生じており、以来、El Torバリアント13,17と呼ばれている。一部のEl Tor変異体は、以前に観察されたものよりも迅速かつ重度の疾患進行を伴って病原性能力の上昇を示しており、代理人の特定と疾病の予防と治療に対するより包括的なアプローチの必要性8,9,18。バイオタイプの同定は治療を即座に指示しないが、ワクチン開発および将来の治療剤のさらなる進歩は、バイオタイプの区別の恩恵を受ける可能性がある。 ここに記載された最初の一連のプロトコルは、研究者がVを適切に維持することを可能にする。実験室環境でのコレラ菌株。一貫性およびその後の分析には、バイオタイプに依存しない分離物のストック調製および増殖が必要である。しかし、病原性遺伝子発現を最適に誘導するためには、独立した生物型特異的培養技術が必要とされる19 。さらに、様々な遺伝的および生化学的アッセイのための準備がこの原稿に概説されている。 コレラトキシン（CT）と毒素が共存する（ V）の両方のバイオタイプにおいて、マスターレギュレーターToxTによって制御される2つの主要なビルレンス因子である。 コレラ O1血清群20 。 CTは、5つのCtxB 単一のCtxAサブユニットを取り囲むサブユニットであり、コレラに伴う急速な電解質損失を引き起こす。 TCPは、 tcpオペロン（ tcpABQCRDSTEF ）によってコードされるIV型線毛であり、遠位小腸の付着およびコロニー形成に関与する。 tcpAは、線毛8の構築に必須の個々のピリンサブユニットをコードするtcpオペロンの最初の遺伝子である。 ctxAの遺伝子配列は、古典型とEl Torのバイオタイプの間で完全に保存されていますが、 ctxBとtcpAは2つのバイオタイプで異なりますが、各バイオタイプ8内で保存されています。 ctxBは、2塩基posi以外のバイオタイプ間で完全に保存されている（115と203）。 El Torバイオタイプでは、チミンは塩基番号115および203に存在し、古典的なバイオタイプはこれらの塩基にシトシンを含む。 tcpAは、各バイオタイプ内で完全に保存されているが、バイオタイプ間の複数の塩基で異なる。これらの遺伝子の区別は、一次バイオタイプ同定マーカーとして役立ち、これらの部位を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物の配列決定後、野生型（WT）古典的O395またはWT El Tor N16961と比較して、 CTおよびTCPの、それぞれ、 V. cholerae分離株における。 古典的およびEl Torバイオタイプ21,22,23の間の表現型の特徴を特徴付けるために、多数のプロトコルが開発されている。ポリミキシンBは、グラム陰性菌の外細胞膜の完全性を危うくするペプチド抗生物質であるテリアおよびポリミキシンB耐性は、ポリミキシンB耐性アッセイ21を介して視覚化することができる。クエン酸塩はクレブスサイクルの主要な基質であり、唯一の炭素源としてクエン酸塩を代謝する能力は、クエン酸代謝アッセイ22を用いて決定することができる。 hapR は、様々なプロモーター領域に結合し、遺伝子およびオペロンの発現を調節する、 V. cholerae、 HapRのグローバルレギュレーターおよびマスタークオラムセンシングレギュレーターをコードする24 。 V. choleraeのいくつかの病原性株は、 病原性遺伝子発現のこの密度依存的調節を失わせたhapR遺伝子に天然に存在するフレームシフト突然変異を有する24,25 。乳寒天培地を用いてHapR調節プロテアーゼ活性を測定することにより、研究者は、特定の単離物が機能的HapR 23を含むかどうかを同定することができる。ザ赤血球を溶解する溶血酵素を分泌する株の能力についての溶血アッセイ試験;血液寒天プレート23上に溶血の程度を視覚化することができる。運動性はしばしばコレラ菌の病原性に関連し、運動性寒天プレート23を用いて分析することができる。 Voges-Proskauerアッセイは、唯一の炭素源としてグルコースを発酵させ、副産物アセトイン21を産生する株の能力を試験する。 El Tor変異体の出現により、広範な遺伝子型スクリーニングなしに、およびVのバイオタイプバックグラウンドを推定する前に、任意の表現型アッセイの結果を予測することは困難である。 コレラ菌単離物の場合、アッセイ23のこのアセンブリを実施し、その結果を表2のような参照株と比較することが推奨される。 ここでは、一連のプロトコルを進めており、これらのプロトコルをまとめて使用していますVを特徴付けるためのより包括的なアプローチのための遺伝子型および表現型アッセイを提供する。 コレラバイオタイプ。さらに、我々は既知のVの遺伝子型と表現型の区別を述べた。 （WT古典的なO395、WT El Tor C6706、およびWT El Tor N16961; 表1 ）と比較して、コレラエルEl Tor変異体（MQ1795およびBAA-2163）を使用した。 El Tor変異体の出現は、以前に採用された単一アッセイバイオタイプの特徴付けプロトコルの信頼性に対する課題を提示した。しかしながら、この複数のアッセイ同定システムは、臨床的および環境的Vのより信頼性の高い特徴付けを可能にする。 コレラ分離株。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60%グリセロール</td><td>カルバイオケム</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>寒天</td><td>ベクト、ディキンソンアンドカンパニー。</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>脳心注入を伴う寒天</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>無水 K2HPO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>4°Cで保管します。C;&nbsp;http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>ブロモチモールブルー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>サートリック酸 & ミドドット;H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド (dNTP) ソリューション キット</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N0446S</td><td>-20 °C で保管;C;&nbsp;https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean &コンセントレータ&トレード;-25キット</td><td>Zymo Research</td><td>D4007 http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen核酸染色ビ</td><td>オチウム</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr> <tr><td>Genesys 10SUV-VIS分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>腐食 性;&nbsp;https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td></td></tr> <tr><td>http://deconlabs.com/products/leloop/ ル・スタブ</td><td>・デコン研究所</td><td>MP186-5</td><td></td></tr> <tr><td>http://deconlabs.com/products/lestab/ MgSO4&middot;7H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>ミニサブセル GT 水平電気泳動システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>ラボ 1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP ブロス</td><td>ディフコ</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH4HPO4&middot;4H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>ネスレ カーネーション</td><td>N/A</td><td>N/</td></tr><tr><td>A ペプトン</td><td>ベクト、ディキンソン アンド カンパニー</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>シャーレ(100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>シャーレ(150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID Polymyxin B sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>2-4°Cで保管します。C;</td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=USTaq DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0273S</td><td>-20 >C;</td></tr><tr><td>https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-bufferTaq 反応バッファー</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0273S</td><td>-20 >C;&nbsp;https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー Bio-Rad C1000 Touch&trade;&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド・ラボ</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>塩化トリフェニルテトラゾリウム</td><td>アルファ エーザー</td><td>A10870</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ トリス ベース</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>ベクト、ディキンソン、共。</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>ベクト、ディキンソンアンドカンパニー</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術<em&gt;コレラ（vibrio cholerae）</em&gt;臨床分離株

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

水生グラム陰性菌であるビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）は、感染性胃腸疾患コレラの病原体である。この病気の世界的な有病率および重症度のために、 V 。 コレラは環境および実験室の環境の両方で広範に研究されており、適切な維持および培養技術が必要である。古典とエルトールは、 Vを構成する2つの主要なバイオタイプです。 コレラ菌 O1血清群であり、それぞれがバイオタイプの特徴付けのための信頼性のある機構を提供するユニークな遺伝子型および表現型特性を示し、培養条件を誘導する特異的ビルレンスを必要とする。所与の感染またはアウトブレイクの原因となる菌株のバイオタイプに関わらず、この疾患の標準的な治療には、抗生物質のレジメンを補充した再水和療法が含まれる。しかしながら、バイオタイプの分類は、実験室研究に必要であり、生物医学分野においてより広い影響を及ぼす可能性がある。2000年代初期には、古典的およびEl Torバイオタイプの両方からの遺伝子型および表現型形質を示す臨床分離株が同定された。 El Tor変異体と呼ばれる新しく同定されたハイブリッドは、従来の伝統的な単一アッセイ同定プロトコールよりも臨床的および環境的な分離生物型同定をより複雑にしている。 Vを記述することに加えて。 （ ctxBおよびtcpA ）PCRベースの遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイ（ポリミキシンB耐性、クエン酸代謝、タンパク質分解活性、溶血活性、運動性、およびグルコース代謝）を、Voges- Proskauerアッセイ）は、古典的なタイプとEl Torのバイオタイプを特徴付けるおよび/または区別するために集合的に使用された。一緒に、これらのアッセイは、代用品として、または加えて、特徴的な費用のかかる労働集約的実験に使用される効率的な体系的アプローチを提供するVの コレラ（臨床的および環境的）分離株。

任意の細菌株の適切な維持および使用のために、目的の株の倍加時間を知ることが推奨される。ここでは、一般に使用されるVの変化する成長速度が、 コレラ菌株は増殖曲線により示され、近似倍化時間は線形回帰を用いて計算された。 WT El Tor N16961およびEl Tor変異体MQ1795は、WT古典的O395（〜2時間）より短い倍加時間（それぞれ〜1時間および〜1時間）を示した（ 図1 ; 表2 ）。 V. choleraeの遺伝子操作およびその後の分析は、しばしばバイオタイプ間を適切に区別する能力に依存する。 PCRに基づく遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイは、 Vのバイオタイプ背景を区別するための信頼性の高いシステムとして集合的に実施された。臨床的および環境的コレラ</em...

この原稿は、一連の生化学的アッセイに加えて、適切なビブリオコレラ（Vibrio cholerae）の維持技術を説明し、臨床的および環境的V間の迅速かつ確実な区別のために集合的に利用される。 コレラバイオタイプは実験室環境で使用されます。

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術<em&gt;コレラ（Vibrio cholerae）</em&gt;臨床分離株

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

本手法の全体的な目的は、簡便に実施可能であり、あらゆる研究者が特定の臨床的または環境的なVibrio cholerae分離株を特性解析するのに役立つプロトコル集を提供することです。この手法は、特に臨床的な関連性を持つVibrio cholerae分離株の具体的な遺伝型および表現型特性など、細菌学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、一連のアッセイを用いることで、あらゆる研究者が臨床的または環境的なVibrio cholerae分離株を信頼性高く特性解析し、判別できる点にあります。これらのアッセイを組み合わせることで、コストと手間のかかる実験や、Vibrio choleraeの臨床および環境分離株の特性解析に代わる、あるいはそれを補完する体系的なアプローチが可能となります。本手法はVibrio choleraeのバイオタイプの特性解析に有用であるだけでなく、他の腸内細菌の生化学的および代謝的能力の解析にも適用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方は、最適な結果を得るために必要な培養時間が生化学アッセイごとに異なるため、タイムマネジメントに苦労することがあります。スポッティングおよびスタビングプロトコルの視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。飛散によってしばしば交差汚染が生じる可能性があり、また、菌株間の融合を防ぐために最大限の間隔を空ける必要があるためです。まず、滅菌済みの2 mLマイクロ遠心チューブを用いて、1.8 mLの液状オーバーナイト培養液を、最低8,600 xGで2分間遠心分離し、ペレット化します。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングによって細胞ペレットを900 µLの新鮮なLuria-BertaniまたはLBブロスに再懸濁します。次に、滅菌済みの60% (v/v) グリセロールを900 mcL培養液に加え、ボルテックスで混合します。この混合液を滅菌済みの2 mLクライオチューブに移し、ストック培養液を-80 °Cで保存します。ストックを使用する際は、滅菌済みの白金ループを用いて凍結ストックをごく少量採取し、LB寒天プレートにバクテリアを画線して単一コロニーを得ます。培養物が完全に融解するのを防ぐため、使用後は直ちに凍結ストックを-80 °Cに戻してください。プレートを逆さまにした状態で、37 °Cで12〜16時間インキュベートします。あらかじめ準備しておいたプレートを用意します。滅菌済みの10 mL培養チューブに入れた4 mLの液体LB培地に、滅菌済みのループで単一コロニーの表面に触れてコロニーを液体培地へと移し、接種します。その後、振盪インキュベーターを用いて、37 °C、225 rpmで12〜16時間、通気条件下で培養します。これにより、液体LB培地でのオーバーナイト培養液を調製します。翌日、培養液を遠心してペレットとし、細胞ペレットを1.8 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁して細胞を洗浄します。この洗浄手順を3回繰り返します。3回目の洗浄の後、最後に1.8 mLの1x PBSで再懸濁します。次に、ピペットチップを用いて、洗浄済みの培養液1 mcLをそれぞれの培地にスポットします。一晩培養して得られた細胞ペレットを洗浄してください。接種針を洗浄済みの液体培養液に浸し、培地に垂直に刺して、運動性寒天培地プレートに接種します。寒天に刺す際、接種針が曲がらないように注意してください。接種ごとに、ブンゼンバーナーを用いて白金線（接種針）を滅菌させます。プレートを蓋側を上にして、37 °Cで14-24時間培養します。14時間後、培養物の過増殖を防ぐため、運動性プレートを注意深く観察します。滅菌済みの培養管に入れた4 mLのMR-VP（Methyl Red Voges-Proskauer）ブロスに、あらかじめ調製したオーバーナイト培養液10 µLをピペッティングして接種し、振盪インキュベーターを用いて225 rpm、37 °Cで12〜16時間、通気条件下で培養します。次に、滅菌済みの培養管に入れたMR-VPオーバーナイト培養液の1 mL分注量に、5% (w/v) α-ナフトール150 µLと40% (w/v) 水酸化カリウム50 µLをそれぞれ加えます。その後、チューブを短時間ボルテックスします。室温で最大4時間、色調変化が現れるまで静置してください。V.Choleraeの臨床分離株および環境分離株のバイオタイプ背景を区別するため、PCRベースの遺伝学的スクリーニングおよび表現型アッセイに、バイオタイプ参照株および代表的なEl Tor変異株を含めました。野生型の古典的O395は、古典的なctxBおよびtcpA配列を示しました。対照的に、野生型のEl Tor株N16961およびC6706は、El Tor型のctxBおよびtcpA配列を示しました。MQ1795およびBAA-2163は、O395と同等の古典的バイオタイプのctxBサブユニットを有しています。しかし、どちらのEl Tor変異株にも、El Torバイオタイプ背景を示すtcpAが含まれていた。ポリミキシンBを添加したLB寒天培地で培養した際、野生型の古典的バイオタイプ株0395はポリミキシンBへの感受性を示したが、野生型のEl Torバイオタイプ株は耐性を示した。代表的なEl Tor変異株も、同様にこの抗生物質への耐性を示した。このビデオを視聴することで、本稿で概説する複合アッセイ同定システムを用いて、Vibrio choleraeのバイオタイプをどのように区別するかについて十分に理解できるはずです。BSL-2病原体を扱うことは非常に危険である可能性があるため、すべての材料および廃棄物の適切な取り扱いと廃棄を、機関、地域、州、および連邦の規制に従って徹底させることを忘れないでください。本稿に記載されたプロトコルに加えて、バイオフィルム形成や自己凝集などの他の表現型特性を調査することで、Vibrio cholerae分離株のさらなる特性評価を行うことができます。

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出典: Brumfield, K. D. ら、臨床および環境分離株のビ ブリオ・コレラ 菌バイオタイプの維持および鑑別に用いられる実験技術。 J. Vis. Exp. (2017年)。このビデオでは、 Vibrio cholerae の3つの生物型、古典型、野生型El Tor、El...

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バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術

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