Name: キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶアップコンバージョンナノ粒子を用いた光活性化による細胞内シグナル伝達のリモートトリガー法。近赤外光でケージ化PKAを活性化し、UV光毒性を回避して生細胞内の酵素反応を時空間制御する革新的ナノ技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

資金調達 (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) ありがとうナノ科学と技術学院プログラムと科学省台湾の技術。

注: プロトコル記述 photoactivation のアップコン バージョン アシストの詳細な計測修正、合成手順を生成するケージ PKA UCNP、シリカ被覆 UCNP の透過型電子顕微鏡 (TEM)やケージの PKA UCNP サンプル、UV ・近赤外の光分解セットアップ、セル準備、PKA UCNP マイクロインジェクション、photoactivation 研究、REF52 細胞のストレスの繊維染色します。
 1 蛍光アップコン バージョン スペクトル測定装置の <ol><li>レーザーは、キュベットの中に焦点を当てて、蛍光分光計のキュベット ホルダーの横に 4 X 対物レンズをインストールします。</li>。
	<li>対物レンズに対して 90 ° 0.5-8 W 980 nm レーザ ダイオードを配置します 。
	注意: オペレーターは、レーザー安全知識を持ち、近赤外レーザーのゴーグルを着用する必要があります</li>。
	<li>は、対物レンズとレーザーの光路交差点で完全反射ミラーをインストールします。分光法の励起ウィンドウをブロックし、内部パーツを保護するために黒アルマイト メタル プレートを配置します</li>。
	<li>キュベット ホルダーにシリカ被覆 UCNP 溶液 (0.2 - 0.6 mg/mL) のキュベットを置いて、明るいアップコン バージョン ビーム可視化することができます、ミラー インストールに対して最高の光の調整に使用することができます</li>。
	<li>は、分光学を PMT 電圧設定で最低発光モードに切り替える (信号が弱すぎる場合より高い設定を調整)。最高の配置、ここでビームはキュベットの中に、最も強力な信号を拾って、PMT にミラーを調整します</li>。
	<li>は後、所望の電力設定でアップコン バージョン スペクトルを測定します。熱杭のパワーメータを使用して、レーザ電源の電気の現在の読みに対するレーザー力の検量線を構築します。パフォーマンスが校正の範囲内にあるかどうかを確認するレーザーの性能を常に確認します</li>。
</ol> 2。顕微鏡のセットアップ 注: 次のセットアップは、2 層光パス搭載顕微鏡。ユーザーが近赤外レーザー、ハロゲン ランプは同じポートを共有する背面ポートの励起光源スイッチをインストールしようとすると場合、は、サンプルの発熱を低減するためのものですので、背面のポートにコリメータは大幅 NIR がブロックされます。ユーザーは、難しい選択を行う必要があります: コリメータをおいて、アップコン バージョンの非常に低い効率に苦しむ、コリメータを削除や励起、落射蛍光の光の強度を犠牲します。
 注: 変更された蛍光、アップコン バージョン発光と近赤外光分解モードおよび実験装置と UV 光分解モード、落射蛍光顕微鏡の光路方式を示す断面図の図この実験に使われて 図 2 に示します。
背面に監督 <ol><li>装備金属のハロゲン化物ライトと蛍光顕微鏡ガイド ポート 
	注: この上位層の光パスの 1 つのキューブの位置は低階層光パスから来る NIR ように空でなければなりませんキューブ砲塔がある</li>
	<li>は、オープン側ポートのコリメータで、右側のポートに可変 0.5 から 8.0 W 980 nm のレーザー ダイオードをインストールします 。
	注: これは 10 倍の対物レンズを使用するレーザー光スポット約 500 μ m の直径を拡大します。このコリメータを取り外し、マイクロ メートルの範囲のスポット ライトの結果し、NIR 細胞照射ができなくなります。このコリメータは近赤外透過的です</li>。
	<li>ダイクロイック ミラー (850 nm ショートパス) と低層の光パスの励起フィルター (950 nm 長いパス) をインストール</li>
	<li>では、UCNP ソリューションを使用して、近赤外光スポットを視覚化します。配置を完了するためのビューのフィールドで近赤外光ビームの中央にレーザーの位置を調整します</li>。
</ol> 3。調製とキャラクタリゼーションのケージ PKA UCNP 構築 <ol><li>加温組換え PKA (9 μ M) ケージング バッファー (20 mM トリス塩酸、10 mM と 100 mM の NaCl、MgCl 2; pH 8.5) 25 で 1-2 時間で 0.5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) と ° c. 焼入10 mM dthiothreitol (DTT) と過剰な NBB、4-(2-ヒドロキシエチル) dialyze、ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) バッファー (10 mM, pH 7.5) 余分な試薬と塩を削除する 。
	注: ケージの溶液の pH が下がる 8.5 7.5 HEPES pH 7.5 以降の固定化反応のための透析中です</li>。
	<li>ミックス、ランタノイド塩 Y(CH3CO2) 3 水和物 (99.9%、0.4527 g、1.38 ミリ モル)、Yb (CH 3 CO 2) 3 水和物 (99.9%、0.2533 g、0.60 モル)、および Tm (CH 3 CO 2) 3メタンハイド レート (99.9%、0.02 モル 0.0168 g)-octadecene (30 mL)、オレイン酸 (12 mL)、115 ° C、30 分の混合物を熱し、50 ° C にそれらを冷却次に、NaOH ペレット 0.2 g (5.0 m モル) とメタノール溶液 (20 mL) で反応混合物を溶解し、0.2964 g (8 モル) で 15 分間超音波処理によるフッ化アンモニウムの増加反応温度は 300 ° C まで (β NaYF 4 UCNP コアを取得するには: 1.0 %tm 3 +/30 %yb 3 +) ナノ粒子。</li>
	<li>は、シクロヘキサン (10 mL) 中の CO-520 (0.5 mL) のコア粒子 (25 mg) を溶解します。アンモニア (重量 30 %v/v、0.08 mL) とオルトケイ酸エチル (TEOS、0.04 mL) を追加し、シリカ被覆 β NaYF 4 を得るため室温で 12 時間一定の攪拌の適用: 1.0%Tm 3 +/30%Yb 3 + コア粒子</li>。
	<li>PKA を孵化させなさい (6 nmol) または PKA をケージ (6 nmol) HEPES 緩衝液 (pH 7.5、10 mM) 静電相互作用 経由 での UCNP のシリカ被覆の PKA を固定する 3 h の 4 ° c で UCNP (1 mg) 15 と</li>。
	<li>は、PVDF フィルター (0.45 μ m)、17,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心を使用して混合物をフィルター処理し、精製の PKA UCNP 複合体を取得する HEPES (pH 7.5、10 mM、50 μ L) 含む 0.1% 蛋白質安定剤でペレットを redisperse します。4 ° C で 10 分間 17,000 × g で遠心し、1.5 mL チューブのブラッドフォードの試金の上澄みを集めします</li>。
	<li>分析バック計算 UCNP 粒子の PKA 置換レベルに清のブラッドフォードの試金のステップ 3.5 から保存無制限の PKA の置換レベルが通常ある 〜 粒子の mg 当たり PKA の 4.5 nmol 。
	注: ブラッドフォードの試金を明らかに脱着することがなく高いレベルで安定したタンパク質固定化を示唆しているペレットに強く青い色、PKA UCNP ソリューションは HEPES バッファー (に似た色を表示の上清分画ケージ中 図 4c 4e).</li>
</ol> 4。特性 注: キナーゼ試金はピルビン酸キナーゼの特定の活動を定量化するために使用します。簡単に言えば、ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素に結合は、ペプチドのリン酸化は、NADH の酸化の結果します。340 NADH の吸光度の減少を測定することにより後者の形成を監視 nm。
<ol><li>60 μ L 総量がアッセイ混合 4 morpholinepropanesulfonic 酸 (モップ、100 ミリメートル、pH 7.5) の PKA と PKA UCNP の活動を決定する KCl (100 mM)、(PEP、1 mM) はホスホエノールピルビン酸、アデノシン三リン酸 (ATP、1 mM)、β-ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド形態 (NADH, 0.8 mM)、塩化マグネシウム (MgCl 2、1 mM)、kemptide (0.4 mM)、およびピルビン酸キナーゼ/乳酸脱水素酵素混合物 (PK/LDH の 30/40 単位) を削減します</li>。
	<li>は、アッセイ混合物に PKA ソリューション (2 μ L) の付加の後で時間をかけて NADH の吸光度の減少を測定します。直接測定対象キナーゼの活性を反映するように直線の傾きを計算します</li>。
	<li>PKA UCNP 15 の活動と PKA 固有のネイティブ アクティビティおよび計算される PKA 表面被覆量の乗算製品にもマッチする必要があります全体の活性を測定します</li>。
</ol> 5。光分解セットアップ <ol><li>測定ure 光のすべての電源熱杭センサーを用いた源そして電力密度を計算する (PD = 電力 (W)/(cm 2)) 光スポット エリアに基づいて 18</li>。
	<li>365 nm の LED (200 mW/cm 2) 15 の商業システム の in vitro UV 光分解実験を実行します</li>。
	<li>顕微鏡ステージ上の UV 光を照らす商業キューブ 15 によってフィルター処理された励起光による PKA UCNP ソリューションです 。
	注意: 電力密度は 〜 15 mW/cm 2、対物レンズ焦点なし</li>。
	<li>培養 顕微鏡段階の photoactivation、NIR の照らすダイクロイック ミラー (850 nm 短い-パス)、低階層光パスにインストールされているカスタマイズされたアップコン バージョン フィルター/ミラー設定で 980 nm のレーザーを使用して PKA UCNP ソリューションと励起フィルター (950 nm 長いパス). 
	注: 出力電力密度は 4 X 対物レンズ焦点を当て前に 5 W/cm 2 です。電力密度と推定される 〜 68 W/cm 2 X 対物レンズ焦点 4 後</li>。
</ol> 6。細胞試料調製と PKA UCNP 錯体のマイクロインジェクション <ol><li>PKA 固定 (ステップ 3.5) 後、0.45 μ m のフィルターを通してサンプルをプレフィルターします</li>。
	<li>インキュベート マイクロインジェクション インキュベーター外で安定した pH 制御期間 L-15 媒体を含む 10% 牛胎児血清 (FBS) にセルです 。
	注: 顕微注入完了を確認する共同注入ネイティブ PKA UCNP、ケージ PKA-UCNP、またはペグインターフェロン UCNP (7.5 mg/mL) 15 5 6-carboxytetramethylrhodamine (耽羅) (10 μ M) のセルに</li>。
	<li>は PKA UCNP 粒子の濃度を調整して、マイクロインジェクション後、ゾル性細胞質の濃度は 1-3 μ M PKA - 注入量は細胞容積の 1/10 であるという前提で、セルの PKA の生理的濃度範囲.</li>
	<li>実行 (ステップ 6.2) 細胞へのマイクロインジェクション一次元油圧マイクロマニピュレーター ( 図 3) と相まってマイクロインジェクター デバイスを使用します</li>。
	<li>ガラスシリンジによって適用される圧力を監視するデジタル圧力計が動作範囲内での使用 (50 〜 200 hPa) マイクロインジェクションの補正圧力を提供するためにカスタマイズされた加圧チャンバーにディスペンサー バルブのシール。引き手を使用して針を引いています</li>。
	<li>50 と 75 hPa、200-300 ms と毛管作用によって針に培養液の逆流を防ぐために 15 hpa 補正圧力の噴射時間の間注入圧力を維持します</li>。
	<li>外径 1.3 と 1.5 μ m、40 倍の対物レンズを用いて撮影によって確認することができます間があるように針の先端の開口部を確認します</li>。
	<li>10% を含む L-15 培地 2 mL でセルを洗浄して、インジェクション後 FBS。5 (6) - carboxytetramethyl - ローダミン (タムラ) マイクロインジェクション完了の確認をから細胞の蛍光イメージングを観察</li>。
</ol> 7。Photoactivation のケージ PKA UCNP を使用して紫外線や生体細胞の近赤外光 PKA UCNP マイクロインジェクション後 <ol><li>UV の photoactivation 3.5 μ m の皿 REF52 細胞を成長、顕微鏡ステージ上に配置、によってフィルター UV 光照射条件対物レンズの焦点なし 3 分キューブ 。
	注: セルが 10% を含む DMEM で維持された REF52 37 ° c 5% CO 2 インキュベーターとセルで FBS が継、confluency に 90% に達すると 2-3 日毎</li>。
	<li>PKA UCNP インジェクション後の近赤外光低層フィルター/ミラーの設定から 980 nm レーザーで細胞を照らすは、ステップ 5.4 で説明したようします 。
	注: 出力密度 10 × 対物レンズ焦点を当て前に 5 W/cm 2 は、対物レンズの中心 x 10 後 300 W/cm 2 と推定されています。アップコン バージョンは、大きな anti-Stoke シフトが必要な場合に特に高光子密度を必要とするプロセスです。Photoactivation の間に中心の必要したがって、.</li>
	<li>大きいスポット ライト (650 μ x 520 μ m) が必要な場合は、NIR 毎 5 分照射後 5 分暗い間隔 15 分許可コリメータと 10 倍の対物レンズで焦点を当てて加熱を避けるために、これらの細胞を照射します 。
	注: 高の分解能 (細胞内光スポット) が必要な場合使用 40 X 対物レンズとピンホールを導べ光の出口の端に取り付けられている細胞次元光スポット (5 μ x 4 μ m) を生成します。この場合は 1 照射の s は、光子の高フラックスによる近赤外光のために十分</li>。
	<li>後紫外線や近赤外の光分解は、細胞応答を生成するための完全な媒体で 1 h の 37 ° C で 5% CO 2 インキュベーターで回復する細胞を許可します。その後、さらに染色する前に 4% パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 分の 1 mL でそれらを修正します 。
	注意: パラホルムアルデヒドは猛毒です。皮膚、目、粘膜との接触を避けます。測定と準備の中に粉を吸い込まないようにします</li>。
</ol> 8。近赤外光活性化によって引き起こされるストレス繊維崩壊の可視化 <ol><li>固定後、使用 Alexa 594 ファロイジン (6.6 μ M 原液の 5 μ L 200 μ L の PBS を加える染色; 室温で 25 分間インキュベート) 染色して繊維の応力を視覚化します。フィルタ セットを使用 Alexa 594 ファロイジン (Ex 581 nm/Em 609 nm) のイメージを視覚化します</li>。
	<li>インキュベート 4 で 5 分間細胞 &#39;、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 室温で。染色後サンプルは PBS を洗浄し、ストレスファイバーと核の蛍光画像を別々 に取ます</li>。
</ol>

<ol><li>Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Controlled+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Light-Controlled Tools.</a> Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).</li>
<li>Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+Chemistry+of+Life%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Applications+of+%22Caged%22+and+Related+Photoresponsive+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds.</a> ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).</li>
<li>Pavlovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Delivery+and+Photochemical+Release+of+a+Caged+Inositol-pyrophosphate+Induces+PH-domain+Translocation+in+Cellulo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo.</a> Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).</li>
<li>Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Wavelength+Photoactivation+of+cAMP-+and+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways.</a> ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).</li>
<li>Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+One-+and+Two-Photon+Uncaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA.</a> ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).</li>
<li>Warther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Uncaging%3A+New+Prospects+in+Neuroscience+and+Cellular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology.</a> Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).</li>
<li>Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+of+Confocal+and+Caging+Technologies%3A+Selective+Three-Color+Communication+with+Profluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters.</a> Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).</li>
<li>Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-selective+cleavage+of+photoprotecting+groups%3A+strategies+and+applications+in+dynamic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems.</a> Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).</li>
<li>Chien, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light+Photocontrolled+Targeting%2C+Bioimaging%2C+and+Chemotherapy+with+Caged+Upconversion+Nanoparticles+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).</li>
<li>Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light-Mediated+Photoactivation+of+a+Platinum+Antitumor+Prodrug+and+Simultaneous+Cellular+Apoptosis+Imaging+by+Upconversion-Luminescent+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).</li>
<li>Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR+Light+Controlled+Photorelease+of+siRNA+and+Its+Targeted+Intracellular+Delivery+Based+on+Upconversion+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).</li>
<li>Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+UV-Blocking+Polymer+Shell+Prevents+One-Photon+Photoreactions+while+Allowing+Multi-Photon+Processes+in+Encapsulated+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).</li>
<li>Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+Construction+of+Hollow+Upconversion+Nanoparticles+for+Protein+Harvesting+and+Near-Infrared+Light+Triggered+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release.</a> Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).</li>
<li>Gao, H. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Near-Infrared-Activatable+Enzyme+Platform+To+Remotely+Trigger+Intracellular+Signal+Transduction+Using+an+Upconversion+Nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle.</a> ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).</li>
<li>Wehbi, V. L., Taskén, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+for+cAMP-Mediated+Immunoregulation+in+T+cells+-+Role+of+Anchored+Protein+Kinase+A+Signaling+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Fluorescence+Approaches+Shed+Light+on+Intracellular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs.</a> Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).</li>
<li>Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep22433">Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect.</a> Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).</li>
<li>Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0014579388807816">Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells.</a> FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).</li>
<li>Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).</li>
<li>Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote-control+Photorelease+of+Caged+Compounds+Using+Near-infrared+Light+and+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).</li>
<li>Garcia, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR-triggered+Release+of+Caged+Nitric+Oxide+Using+Upconverting+Nanostructured+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials.</a> Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).</li>
<li>Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NIR-responsive+and+sugar-targeted+polypeptide+composite+nanomedicine+for+intracellular+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy.</a> Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

以前は、ホフマンと同僚が見つかりました無料 PKA19のマイクロインジェクション後 REF52 細胞における劇的な形態学的変化を認めたこと。別の研究では、ローレンス グループは、ケージ PKA 活性化使用される体内形態学的変化とストレスファイバー UV 光分解20に服従させたときの崩壊につながるを示した。以前のいくつかの UCNP シスト、ケージ、小さな分子 bioeffectors21,22,23活性化を示した photoactivation のためアップ コンバートされる紫外線を利用するについて報告します。ただし、bioeffector、酵素の最も重要なクラスの UCNP シストの photoactivation を使用するプロトコルでは、開発する必要があります。したがって、本研究では UCNPs を使用してケージの PKA の近赤外光...

センサー (PKA ケージ蛋白質など) をすることができます化学修飾されたタンパク質は細胞の生化学的なプロセス1,2 を非侵襲的操作する化学生物学の新たな分野として開発されています。、3。タンパク質をケージ使用光刺激はこれらの活性化と優れた時空間解像度を提供します。ただし、紫外線は、望ましくない形態学的変化、アポトーシスおよび細胞4,5への DNA 損傷を引き起こす可能性が。それ故に、photocaging グループの設計の最近の動向は、深部組織浸透6,7を増大させるため、同様の光毒性を軽減する長波長または 2 光子励起による電子スピンダイナミクスの有効化に焦点を当てます。私たちは適切な uncaging 神経波長 (すなわちチャンネル) を選択できるようにする選択的に波長が長く対応ケージのグループは bioeffectors 2 つをアクティブにしますより多くのケージ グループは、現在7。これらの便利な機能を与え、細胞活動8を制御するための反応のメカニズムを調査に至る生物学研究光化学的方法論で非常に重要な上流作業は、赤色光 photocaging の新しいグループを開発します。しかし、2 光子ケージ グループは縮合芳香環構造のためあまりにも疎水性通常、可視光ケージ グループは通常有機金属、芳香族配位子を。この疎水性/芳香族プロパティは適していません、bioeffector は蛋白質や酵素、酵素/タンパク質の活性化サイトを変化し、たとえ抱合と光分解はまだ2 の化学のレベルで動作、機能の損失が発生するとき ,9。
UCNPs は、近赤外励起光を UV に変換効果的なトランスデューサーです。UCNPs のこのユニークで魅力的なプロパティは、課題に対応する現実的な解像度 photoactivation に関連付けられているし、小分子、葉酸10シスプラチン誘導体11 の制御放出をトリガーに提供しています。、DNA/siRNA12、共重合体膜小胞13、および中空粒子14。ただし、我々 の知識の限り、酵素やタンパク質の UCNP シスト photoactivation 未テストところ。シリカ コーティングと化学修飾されたケージの酵素複合体から成るタンパク質/酵素コンストラクトの NIR トリガー活性化を実行する求められる私達を使って赤い光や近赤外光活性酵素の成功例がないので希土類をドープした UCNP の15。本研究では、UCNP は、ケージの PKA の形で急速に反応シグナル伝達キナーゼと共役だった。PKA は、グリコーゲン合成と細胞質16環状アデノシン リン酸 (キャンプ) 調節することによる外部からの刺激に応答する細胞骨格の調節をコントロールします。近赤外照射後の細胞実験で時空のマナーで酵素活性化の可能性を検討した.この光の UCNP 支援プラットフォーム NIR を使用して酵素 photoactivate する新しい方法であるし、従来 UV 照射2,4による細胞から不要な信号伝達応答を回避できます。
若し大 bioeffectors に非常に困難だ(例えば、蛋白質) 細胞の活動を制御する細胞膜を挟んだ。粒子を固定化したタンパク質は細胞質にエンドサイトーシスを介して若しやすくもありますが、エンドサイトーシスを破損やエンドソームわなに掛ける事とそれに伴うライソゾームの分解2,4を介して低下可能性があります。ケージのタンパク質が膜後まだ機能している場合でも転量が細胞応答2,17をトリガーするため十分ではないです。対照的に、マイクロインジェクションは細胞の細胞質に大規模な bioeffectors を提供する直接および定量的アプローチです。また、UCNP 固定化 bioeffector は、アクティブにするアップ コンバートされる光を必要とします。したがって、光学機器用はさらに変更を計測、可視化、およびアップコン バージョン光を利用する必要があります。この作品は、近赤外光用マイクロインジェクションと次の必須の分光法と顕微鏡の変更を使用してセルにケージ PKA UCNP 複合体の配信詳細に表示されます。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>Σ</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Σ</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td></td><td>Σ M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>酢酸イットリウム&nbsp;ハイドレート</td><td>シグマ</td><td>326046</td><td>Y(C2H3CO2)3 & middot; xH2O</td></tr><tr><td>酢酸ツリウム(III)</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH3CO2)3</サブ> & ミッドドット;xH2O</td></tr><tr><td>イッテルビウム(III) アセテート四水和物</td><td>Σ</td><td>326011</td><td>Yb(C2H3O2)3 & middot; 4H2O</td></tr><tr><td>1-Octadecene</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸</td><td>Σ</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>マクロン</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>30620</td><td></td></tr>フ<tr><td>ッ化アンモニウム</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&nbsp;CO-520</td><td>シクロ</td><td></td>ヘキサン 238643 <td></td></tr><tr><td></td><td>J.T.Baker</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム (28% - 30%)</td><td>J.T.Baker</td><td>972101</td><td>アンモニア</td></tr><tr><td>テトラエチル オルトケイ酸 (TEOS)</td><td>Sigma</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Σ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシマレイミド (NHM)</td><td>Σ</td><td>226351</td><td>PKA活性ブロッキング試薬</td></tr><tr><td>豚コラーゲンからのPrionexタンパク質安定剤溶液</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>タンパク質安定剤溶液</td></tr><tr><td>2-臭化ニトロベンジル(NBB)</td><td>Sigma</td><td>107794</td><td>PKAケージ試薬</td></tr><tr><td>8-(4-クロロフェニルチオ)アデノシン 3&prime;,5&prime;-環状一リン酸ナトリウム塩</td><td>ΣC3912</td><td>8-CPT-cAMP</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼウサギの筋肉由来の酵素</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸二ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td>ATP</td></tr><tr><td>&β;-NADH は二カリウムから還元</td><td></td><td>Sigma N4505</td><td></td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Coomassie Protein Assay 試薬、950 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Bradford Assay 試薬</td></tr><tr><td>cAMP-dependent protein kinase</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>PKA activity control</td></tr><tr><td>pET15b-PKACAT プラスミド</td><td>Addgene</td><td>#14921</td><td></td></tr><tr><td>pKaede-MC1 plasmid</td><td>CoralHue</td><td>AM-V0012</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Cell培養液</td></tr><tr><td>リーボビッツ L-15 培地</td><td>生物産業</td><td>01-115-1A</td><td>細胞培養液</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>生物産業</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>アクロス</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>核染色色素</td></tr><tr><td>Alexa 594-ファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>F-アクチン染色色素</td></tr><tr><td>5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン&nbsp;</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 チューブ/公称フィルター定格 MWCO 12,000 - 14,000 Da</td><td>Membrane Filtration Products, Inc.</td><td>1430-33</td><td>透析膜</td></tr><tr><td>Millex-HVシリンジフィルターユニット、0.45 & マイクロ;m, PVDF, 13 mm, γ 滅菌</td><td>EMD Milipore</td><td>SLHVX13NL</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>蛍光分光光度計</td><td>Agilent Technologies</td><td>10075200</td><td>ケーリー・エクリプス&nbsp;</td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>Agilent Technologies</td><td>10068900</td><td>Cary 50&nbsp;</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm ロングパスフィルター&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>850 nm ダイクロイック ミラー ショートパス</td><td>クロマ</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>RT3 カラー CCD システム</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>蛍光照明</td><td>PRIOR</td><td>ルーメン 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm 赤外線ダイオード レーザー</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED スポット光源</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>UPH-056-365 nm LED付き 200 mW/cm2</td></tr><tr><td>サーマルパイルセンサー</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>ピコスプリッツァーIII</td><td>パーカー ハネフィン</td><td>052-0500-900</td><td>細胞内マイクロインジェクション ディスペンス</td></tr><tr><td>システム PC-10 ニードルプーラー</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>MANOMETER デジタル圧力計</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>一軸油圧マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>ヘレウスフレスコ 17 遠心分離機、冷蔵</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

アップコン バージョン ナノ粒子 (UCNP)-仲介された光はリモート コントロール bioeffectors はるかに少ない光毒性とより深いティッシュの浸透への新しいアプローチ。ただし、市場で既存のインストルメンテーションは容易にアップコン バージョンのアプリケーションとの互換性ではありません。したがって、市販の計測器を変更することは本研究のために不可欠です。この稿では、まず従来の蛍光の蛍光顕微鏡光子アップコン バージョン実験の互換性のために変更を示します。その後、近赤外線 (NIR) の合成について述べる-トリガー ケージ蛋白質キナーゼの触媒サブユニット (PKA) UCNP 複合体に固定化しました。マイクロインジェクションおよび近赤外光プロシージャのパラメーターも報告されています。ケージの PKA UCNP REF52 線維芽細胞に microinjected が、した後従来の UV 照射によりかなり優秀で、近赤外照射は効率的に細胞 PKA シグナル伝達経路をトリガーします。さらに、正と負の制御実験は、ストレスファイバーの崩壊につながる PKA 誘導経路が特に近赤外照射によってトリガーされることを確認します。したがって、蛋白質変更 UCNP の使用は、リモート光変調細胞実験、紫外線への直接露出を回避する必要がありますを制御する革新的なアプローチを提供します。

ケージ酵素 UCNP の構造の設計は、図 1に示すです。PKA 酵素は、まず、使用頻度の低いケージの PKA を生成する 2-ニトロベンジル ブロマイドと反応したし、UCNP の表面に静電固定だったし。UCNPs は、アップ コンバートの発光し、その結果 photolytically o-ニトロベンジル基 Cys 199 と生成活性化 PKA システイン 343 を切断します。TEM 像とブラッドフォードの試金は、PKA とケージの PKA は UCNPs の表面に固定した、ケージの PKA UCNP ソリューション後 UV 光のキナーゼ活性アッセイ (図 4) を確認しました。PKA 固定後動的光散乱計測器はサイズと 120 に PKA 粒子複合体のゼータ電位を明らかにした nm と-16.0 mV、それぞれ。PKA UCNP ソリューションのブラッドフォードの試金は、高レベルで安定したタンパク質固定化を示唆している、粒子に強力な紫の色を示した。</p...

このプロトコルではケージ プロテインキナーゼ A (PKA)、細胞信号伝達 bioeffector ナノ粒子表面に固定化した細胞質に microinjected、アップ コンバートされる紫外線近赤外線 (NIR) 照射からによって活性化を誘導します。細胞質の下流圧力繊維崩壊。

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

この実験の目的は、近赤外線照射を用いて酵素を光活性化できることを実証することである。ケージドプロテインキナーゼAを、細胞内にマイクロインジェクションしたアップコンバージョンナノ粒子の表面に固定化し、近赤外線照射後の生細胞におけるキナーゼ誘導応答を観察する。従来の光活性化には光毒性のあるUV光が必要であり、不可避的に望ましくない化学反応や同様の応答を共誘導するが、我々が提案する近赤外線照射のような手法では、エネルギーが低いためそのような反応を誘発することはない。アップコンバージョンナノ粒子は、生物への影響が少ない低エネルギーの近赤外光フォトンを、高エネルギーのUVフォトンへ効果的にアップコンバージョンさせることができ、直接的なUV照射を行うことなく粒子表面付近で化学反応を誘発させることが可能です。キナーゼは腫瘍形成において重要な役割を果たしており、本手法を用いることで、UV光毒性とそれに伴う副反応による干渉ノイズを大幅に低減し、より多くのシグナル伝達情報を解析することが可能になります。一般的に、この分野に不慣れな方は、アップコンバージョンへの応用に向けた装置の改造や光学系のセットアップに困難を感じる場合があります。まず、レーザーをキュベットの中央に集光できるよう、フルオロスぺクトロメーターのキュベットホルダーの横に4倍の対物レンズを取り付けます。対物レンズに対して90度の方向に、波長可変980 nanometerレーザーダイオードを配置します。全反射ミラーを設置し、対物レンズとレーザーの光路を交差させます。内部部品を保護するため、分光光度計の励起窓を塞ぐアノダイズド金属プレートを設置することを忘れないでください。次に、シリカコーティングしたアップコンバージョンナノ粒子溶液が入ったキュベットをホルダーにセットします。レーザーをオンにすると、明るいアップコンバージョン光を確認することができます。分光光度計をルミネッセンスモードに切り替え、アライメント中はPMT電圧を最低に設定します。PMTで最大の信号を検出できるよう、ビームがキュベットの中央を通るようにミラーとレーザーステージを調整します。ダイクロイックミラーと励起フィルターを取り付けた後、下段の光路に980 nanometerレーザーダイオードを設置します。レーザーとミラーの間にコリメータを設置し、焦点面におけるNIR照射領域の拡散および拡大を図ります。次に、アップコンバージョンナノ粒子溶液を用いて近赤外光ビームを可視化します。レーザーステージの位置を調整して近赤外光ビームを中央に合わせ、アライメントを完了させます。テキストプロトコルに記載されている通り、ケージドPKAの合成およびケージドPKA/UCNPの固定化を行い、ケージドPKA/UCNPを作製します。UV光分解前の両方のコンストラクトの活性を測定するため、アッセイ混合液に2 µLのPKA溶液を添加した後、時間の経過に伴うNADH吸光度の減少を測定します。PKA/UCNPについても同様に測定を繰り返します。次に、PKAが活性化されることを確認するため、氷水浴中で、caged-PKAおよびcaged-PKA/UCNPに対して200 mW/cm²の強度でUV光分解を行います。PKAの活性は、ピルビン酸キナーゼ・乳酸脱水素酵素共役アッセイによって測定します。PKA溶液の添加後、NADHの吸光度の減少を時間経過とともに測定します。インキュベーター外でpHを安定して制御するため、マイクロインジェクション期間中は、10%胎児牛血清を含むL15培地で細胞をインキュベートします。後にチップを開口させるため、ニードルプラーを調整し、直径約1.5 µmの円錐形のチップを作成します。チップを開口させるには、マイクロインジェクターにニードルを装着し、ニードル先端をスライドの端に接触させた後、顕微鏡ステージのノブを緩やかに回してください。この振動力により、チップの先端がわずかに破壊され、開口部が拡大します。針の開口部を確認し、外径が1.3から1.5 µmであることを確認してください。これは40倍の対物レンズを用いた顕微鏡像で確認可能です。次に、注入圧を50から75 hPaに、加圧時間を200から300 msに設定し、さらに媒体が針内に逆流するのを防ぐため、一定の補償圧を15から30 hPaに設定します。caged-PKA/UCNP複合体をTAMRA染料と共に、ニードルの後方にロードします。ロードしたニードルを単軸油圧マイクロマニピュレーターにセットし、角度を30度から45度に調整します。サンプルロード後に気泡が発生していないことを顕微鏡で確認してください。ニードルを培地に浸した後、蛍光モードに切り替え、注入圧をかけた時に染料がバースト的に放出され、補正圧を一定にかけた時に染料が徐々に放出されることを確認します。次に、位相差明視野モードに切り替え、細胞へのマイクロインジェクションを開始します。注入に成功した場合は、膜のショックウェーブが観察されます。細胞を2回洗浄し、注入された細胞に共注入されたTAMRA蛍光があるかを確認して、マイクロインジェクションに成功した細胞を特定します。UCNPは導入されているが共注入染料のシグナルがない細胞は、注入中に細胞膜が破裂したことを示しており、以降の実験から除外する必要があります。下層光路にある980 nmレーザーダイオードを用い、10倍対物レンズで集光して、細胞に15分間照射します。加熱を避けるため、5分間の照射ごとに5分間の暗所でのインターバルを設けてください。数秒または1秒未満など、より短い活性化時間が必要な場合は、40倍の対物レンズに切り替えて焦点光密度を高めてください。光分解と細胞の回復後、細胞を1 mLのPBS調製4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、その後Alexa 594を用いて染色を行います。最後に、NIR誘導によるストレスファイバーの分解を可視化します。NIR照射後、白矢印で示されたcaged-PKA/UCNPを微小注入した細胞がアップコンバージョン発光を示します。PKAのNIR光活性化が成功し、ストレスファイバーが分解されると、より多くのf actinが露出するため、結果としてUCNP近傍で強い緑色の染色が見られます。細胞にマイクロインジェクションを施したが暗所に保持した陰性対照では、ストレスファイバーの崩壊は見られません。NIR光活性化後のf actinの露出レベルは、alexa 594で染色し、ImageJを用いて定量化できます。赤色の矢印に沿ったf actin染色の強度曲線をプロットすることで、NIR誘起のPKA活性と相関させることができるストレスファイバー崩壊の定量的な情報を得ることができます。マイクロインジェクションに習熟すれば、準備およびcaged-PKA/UCNPの品質管理を含め、この手法を1日で完了させることが可能です。装置の改造および実験に関する当社の手順に従うことで、従来の滴定法で用いられるUV（紫外線）のように、高い時空間分解能で、かつ光毒性のない近赤外線によって目的の反応を誘発することが可能です。このビデオを視聴することで、細胞適合性のある近赤外線を用い、マイクロインジェクションによって酵素ナノ粒子複合体を細胞内に導入し、酵素を光活性化する方法について十分に理解していただけることを期待しています。この技術は、細胞がUV光毒性に耐えられない場合に、時空間分解能を持って生細胞内で目的の酵素反応を誘発するために光を利用する必要がある、ケミカルバイオロジー分野の研究者に道を開くものです。この手順に従い、空間的な時間的分解能を持つ光活性化が必要なさらなる疑問を解決するために、他の生物学的エフェクターをアップコンバージョンナノ粒子に関連付けることができます。生物学的エフェクターが細胞外で作用する場合、マイクロインジェクションを行う必要さえありません。近赤外光活性化プラットフォームは、組織におけるより深い浸透深さを提供できるため、小型動物に適用して、指定した時間と場所で目的の反応を誘発させることが可能です。

an-integrated-system-to-remotely-trigger-intracellular-signal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

多光子顕微鏡は深く、光浸透と低光毒性を持つ低エネルギーの光子の制御が可能になります。我々は、ゼブラフィッシュ胚における生細胞標識のためのこの技術の使用について説明します。このプロトコルは、容易に様々な光反応性分子の光誘導に適合させることができる。...

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

有機色素分子とオレイン酸でコーティングされたアップコンバーティングナノ粒子は水溶性ではありません。このプロトコルは、有機色素分子の移動と、粒子を最初の疎水性溶媒から水へのアップコンバートを可能にする「プラグアンドプレイ」方法を説明しています。...

「プラグアンドプレイ」両親媒性ポリマー、有機染料及びアップコンバーティングナノ粒子を含む水分散性Nanoassembliesを作成する方法を

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング...

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング...

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

タンパク質キナーゼAの活動を可視化する手順を提示し、マウスの頭部固定、振る舞いをする。改良されたA-キナーゼ活性レポーターtAKARαは皮質ニューロンで発現され、頭蓋の窓を通してイメージングのためにアクセス可能にされる。2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡は、強制移動中の生体内でのPKA活性を可視化するために使用されます。...

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

緊密に焦点を合わせたフェムト秒レーザーは、共焦点顕微鏡に結合することにより、細胞に正確な刺激を提供し、リアルタイムの観察と光刺激を可能にします。光刺激は、ERKシグナル伝達経路および活性酸素種のミトコンドリアフラッシュを含む細胞分子イベントを活性化することができる。...

フェムトセカンドレーザーによる光刺激は、標的細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達またはミトコンドリアイベントを活性化する

小分子基質であるルシフェリンを酸化するルシフェラーゼ酵素によって放出される生物発光光は、光感覚タンパク質を活性化するために利用することができ、それによって光刺激に別の次元を加え、時間的および空間的スケールにわたって細胞内の多数の光媒介機能の操作を可能にする。...

生物発光光遺伝学2.0:生体内および生体内で光感覚タンパク質を活性化するための生物発光の利用

このプロトコルでは、cAMPセンサーと光遺伝学的タンパク質であるbPAC-nLucをトランスフェクションして、その細胞内分布と光刺激に対する応答を正確に追跡します。ポイントスキャンシステムを使用してcAMP応答マップを作成する革新的なアプローチは、さまざまな分野の光遺伝学的タンパク質の研究を前進させる可能性を秘めています。...

光刺激グリッドを用いた光遺伝学的タンパク質の細胞分布のマッピング

学ぶアップコンバージョンナノ粒子を用いた光活性化による細胞内シグナル伝達のリモートトリガー法。近赤外光でケージ化PKAを活性化し、UV光毒性を回避して生細胞内の酵素反応を時空間制御する革新的ナノ技術です。

キナーゼのアップコンバージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

さらに動画を探す

キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

さらに動画を探す

キナーゼのアップコンバージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム