キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

この実験の目的は、近赤外線照射による酵素の光活性化の実現可能性を実証することです。この表面にマイクロインジェクションされたアップコンバージョンナノ粒子を細胞内に固定化したケージドプロテインキナーゼAは、近赤外照射後に生細胞内でのキナーゼ誘導応答が観察されます。従来の光活性化は、光毒性のある紫外線を必要とし、必然的に、望ましくない化学反応や同様の応答を共誘発しますが、近赤外線照射のような私たちの友好的な選択肢では、その低エネルギーのために反応を引き起こすことはできません。

アップコンバージョンナノ粒子は、バイオフレンドリーな低エネルギーの近赤外光子を高エネルギーのUV光子に効果的にアップコンバートして、直接UVを照射することなく粒子表面近くの化学反応を引き起こす可能性があります。キナーゼは発がんにおいて重要な役割を果たしており、この技術は、UV光毒性とその副反応による干渉ノイズを大幅に低減して、より多くのシグナル伝達情報を調べるのに役立ちます。一般に、この分野に不慣れな個人は、アップコンバージョンアプリケーションのための機器や光学セットアップの変更に困難に直面するでしょう。

まず、蛍光分光計のキュベットホルダーの隣に4倍の対物レンズを取り付けて、レーザーをキュベットの中央に集束できるようにします。調整可能な980ナノメートルレーザーダイオードを対物レンズに対して90度配置します。全反射ミラーと対物レンズとレーザーの光路の交点を取り付けます。

内部部品を保護するために、分光器の励起窓を塞ぐために陽極酸化金属板を配置することを忘れないでください。次に、シリカコーティングされたアップコンバージョンナノ粒子溶液のキュベットをホルダーに入れます。レーザーがオンになると、明るいアップコンバージョンビームを視覚化できます。

分光法を発光モードに切り替え、アライメント中のPMT電圧を最も低くします。ミラーステージとレーザーステージを調整して、ビームがキュベットの中央を通過し、PMTが最も強い信号を拾うようにします。ダイクロイックミラーと励起フィルターを取り付けた後、下段の光路に980ナノメートルのレーザーダイオードを取り付けます。

レーザーとミラーの間にコリメータを追加して、焦点面のNIR照射領域を拡散および拡大します。次に、アップコンバージョンナノ粒子溶液を使用して、近赤外ビームを視覚化します。レーザーステージの位置を調整して、近赤外光ビームを中央に配置して位置合わせを終了します。

ケージドPKA合成を行い、ケージドPKA/UCNPを動員解除して、テキストプロトコルに記述されているようにケージドPKA/UCNPを生成します。UV光分解前に両方のコンストラクトの活性を測定するには、アッセイ混合物に2マイクロリットルのPKA溶液を添加した後の経時的なアッセイ混合物中のNADH吸収剤の減少を測定します。PKA/UCNP についても測定を繰り返します。

次に、氷水浴中でケージドPKAとケージドPKA/UCNPを1平方センチメートルあたり200ミリワットでUV光分解し、PKAが活性化できることを確認します。PKA活性は、ピルビン酸キナーゼ乳酸デヒドロゲナーゼ酵素結合アッセイによって決定されます。NADH吸収剤の減少に伴い、PKA溶液の添加後に経時的に測定されます。

マイクロインジェクション期間中に、L15培地を含む10%ウシ胎児血清で細胞をインキュベートし、インキュベーター外で安定したpH制御を実現します。ニードルプーラーは、後でチップを開くために直径が約1.5ミクロンの円錐形のチップに構成します。チップを開くには、マイクロインジェクターに針を取り付け、スライドの端に接触するように針先を動かし、顕微鏡ステージのマイルドノブでフォローします。

この振動力は、先端をわずかに折って開口部を大きくするのに十分です。針の開口部を調べて、外径が1.3〜1.5ミクロンであり、40倍の対物レンズを使用した顕微鏡画像で確認できることを確認します。次に、注入圧力を50〜75ヘクトパスカルに200〜300ミリ秒の加圧間隔で設定し、一定の補償圧力を15〜30ヘクトパスカルに設定して、針への中程度の逆流を防ぎます。

ケージ型PKA/UCNP複合体にTAMRA色素を針の後ろの位置にロードします。次に、ロードされたニードルを30度から45度の角度で1軸油圧マイクロマニピュレーターにセットアップします。顕微鏡で針をチェックし、サンプルのロード後に気泡が発生していないことを確認します。

針を培地に浸した後、蛍光モードに切り替えて、注入圧力が加えられたときの色素のバースト放出と、補償圧力が絶えず加えられたときの色素のゆっくりとした放出を確認します。その後、位相コントラスト明視野モードに切り替えて、細胞マイクロインジェクションを開始します。膜の衝撃波は、成功した注入で観察できます。

細胞を2回洗浄し、注入した細胞に同時注入されたTAMRA蛍光がないか確認して、正常にマイクロ注入された細胞を見つけます。UCNPが入院しているが、同時注入された色素シグナルがない細胞は、注入中に細胞膜が破裂したことを示しており、さらなる実験から除外する必要があります。10倍対物レンズで焦点を合わせた下層の光路に980ナノメートルのレーザーダイオードを細胞に15分間照射します。

加熱を避けるために、5分間の照射ごとに5分間の暗所間隔を空けてください。秒数やサブ秒など、より短いアクティベーション時間が必要な場合は、40倍の対物レンズに切り替えるだけで、焦点光子密度を高めることができます。光分解と細胞回収後、細胞をPBS中の1ミリリットルまたは4%パラホルムアルデヒドに20分間固定してから、さらにalexa 594を染色します。

最後に、NIR誘起応力繊維崩壊を可視化します。NIR照射後、白矢印で示されているように、ケージドPKA/UCNPをマイクロインジェクションした細胞はアップコンバージョン発光を示します。PKA NIR光活性化の成功によって引き起こされるストレスファイバー崩壊は、より多くのfアクチンを露出し、その結果、UCNPの近くで強い緑色染色をもたらします。

細胞をマイクロインジェクションするが、暗闇に留まるネガティブコントロールでは、ストレス線維の崩壊は見られません。近赤外光活性化後のfアクチン曝露レベルは、alexa 594で染色でき、画像J.赤矢印に沿ったfアクチン染色の強度曲線をプロットし、近赤外光誘発性PKA活性と相関させることができるストレス繊維崩壊の定量的情報を提供しました。マイクロインジェクションに慣れれば、ケージドPKA/UCNPの調製と品質管理を含め、この技術は1日で完了します。

私たちの装置の改造と実験の指示により、所望の反応は、従来の滴定方法のためのUVのような高い空間時間分解能で、近赤外によって引き起こすことができますが、光毒性がなければ、それは伝染しません。このビデオを見た後、マイクロインジェクションによって酵素ナノ粒子複合体を細胞に送達し、ベル互換の近赤外光を使用して酵素を光活性化する方法をよく理解していただければ幸いです。この技術は、細胞が紫外線光毒性に耐えられない場合に、光を使用して生細胞で目的の酵素反応を引き起こし、空間的な時間分解能を得る必要があるケミカルバイオロジーの分野の研究者に道を開きました。

この手順に従うと、他のバイオアフェクターをアップコンバージョンナノ粒子に関連付けて、空間的な時間的光活性化を必要とする追加の質問に答えることができます。バイオアフェクターが細胞外に作用するのであれば、マイクロインジェクションも必要ありません。近赤外光活性化プラットフォームは、組織への浸透深さも向上させることができるため、小動物に適用して、特定の時間と場所で目的の反応を引き起こすことができます。