マウス乳腺のギャップ、タイトおよびアデュランス接合部の成分間のタンパク質 - タンパク質相互作用および共局在の分析

この方法の全体的な目標は、2つ以上の細胞間接合タンパク質が細胞内で共局在するかどうかを判断し、共免疫沈降を介してそれらの物理的相互作用をさらに評価することです。この方法は、正常な発生や乳がんなどの疾患において接合部が果たす役割など、乳腺分野の生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生体内のタンパク質間相互作用に関する重要な情報を比較的低コストで提供できることです。

コイムノ蛍光染色を行うには、フリーザーから適切な顕微鏡スライドを取り出します。切片を4%ホルムアルデヒドに室温で15分間浸して、すぐに固定します。次に、スライドを室温でリン酸緩衝生理食塩水に浸します。

スライドは、次のステップに進むまでそのままにしておきます。スライドの各セクションを、市販の疎水性バリアまたは撥水ラボペンを使用して丸で囲みます。すぐにPBSの滴を組織に加え、残りの手順でスライドをヒト組織学チャンバーに入れます。

各組織切片を100〜200マイクロリットルの3%ウシ血清アルブミン-トリス緩衝生理食塩水、0.1%ポリソルベート-20で室温で30分間ブロックします。.サンプルがブロッキングしている間に、抗体をTBS 0.1%polysorbate-20で希釈して、一次抗体溶液と二次抗体溶液を調製します。吸引によりブロッキング溶液を除去した後、希釈した一次抗体の100〜200μLで切片を室温で60分間インキュベー

次に、一次抗体溶液を吸引して除去し、切片を250〜500マイクロリットルのTBS 0.1%polysorbate-20で5分間洗浄します。洗浄を2回繰り返す前に、吸引して洗浄液を取り除きます。洗浄液を吸引し、切片を100〜200μLの適切なFluoro-4標識二次抗体と室温で60分間インキュベー

二次抗体溶液を吸引して除去した後、切片を250〜500マイクロリットルのTBS 0.1%ポリソルベート-20で5分間洗浄します。洗浄液を取り出し、2回繰り返します。一次体と二次体の適切な組み合わせを使用して、後続の目的のタンパク質についてこれらの手順を繰り返します。

最終洗浄液を取り出した後、切片を1ミリグラムあたり1ミリグラムのDAPIおよびTBS 0.1%polysorbate-20の100〜200マイクロリットルと室温で5分間インキュベートすることにより、核染色を行います。DAPI溶液を吸引し、水溶性の非蛍光封入剤とカバースリップを使用してスライドをマウントします。スライドを4°Cの冷蔵庫に平らに置き、少なくとも8時間置きます。

テキストプロトコルに記載されているように、蛍光顕微鏡イメージングに進みます。500〜1000マイクログラムのライセートを収集し、PBSで各1.5ミリリットルチューブにそれぞれ最終容量200マイクロリットルに希釈します。目的の抗原に対する抗体をライセートの最初のチューブに加え、氷上に保ちます。

チューブローラーミキサーで4°Cでチューブを低速で一晩インキュベートします。翌日、新しい1.5ミリリットルのチューブに50マイクロリットルの磁気ビーズを追加して、予備洗浄します。ビーズの入ったチューブをマグネットスタンドに置き、ビーズが磁石に向かって移動するのを待ちます。

200マイクロリットルのピペットを使用して、ビーズから保存バッファーを取り出します。500マイクロリットルのPBS 0.1%polysorbate-20を加えてビーズを洗浄し、チューブを10秒間激しくボルテックスします。次に、チューブを磁気スタンドに戻し、ビーズが磁石に向かって移動するのを待ちます。

200マイクロリットルのピペットでピペッティングして、余分な洗浄バッファーを取り除きます。ライセート抗体反応複合体をビーズに加え、ローラーミキサーで室温で90分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを磁気スタンドに置き、ビーズが磁石に向かって移動するのを待ちます。

200マイクロリットルのピペットを使用して、ライセートを吸引して廃棄し、チューブを氷の上に置きます。500マイクロリットルのPBSを加えてビーズを2回洗い、チューブを磁気スタンドに置き、前と同じように液体を取り除きます。洗浄ステップ中は、渦巻きを避け、サンプルを氷の上に保ちます。

ビーズをPBS 0.1%polysorbate-20でボルテックスせずに一度洗浄し、最後の洗浄バッファーを200マイクロリットルのピペットチップを使用して廃棄します。溶出するには、20マイクロリットルの0.2モル酸性グリシンをチューブに加え、ローラーミキサーで7分間振とうします。高速で数秒間遠心分離した後、上清を氷のように冷たい新鮮なチューブに集めます。

各チューブについて、洗浄と溶出のステップを繰り返します。次に、溶出した40マイクロリットルのサンプルに10マイクロリットルの4xバッファーを加えます。溶出したサンプルにすぐに1モルトリスを一度に1滴ずつ加え、色が青くなるまで追加し、次のチューブに進みます。

溶出したサンプルを70〜90°Cで10分間煮沸します。調製したライセートと沈殿したサンプルをSDS-PAGEアクリルアミドゲルに並べてロードします。ゲルを100ボルトの流動緩衝液中で約95分間、または移動するタンパク質の端がゲルの底に達するまで泳が

その後、標準的なプロトコルを用いてゲルをニトロセルロースまたはPVDFメンブレンに移します。次に、5%粉ミルクTTBSで低速のロッカーでメンブレンを1時間ブロックします。沈殿が成功したかどうかを確認するには、沈殿したタンパク質に対する最初の抗体を使用してメンブレンをプローブします。

メーカーが推奨する濃度で5%の粉ミルクTTBSで希釈します。メンブレンを摂氏4度で一晩、ゆっくりと攪拌しながらロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。翌日、メンブレンを5分間ずつ3回、TTBSで高攪拌のロッキングプラットフォームで洗浄します。

次に、西洋ワサビペルオキシダーゼをTTBSで希釈した適切な二次抗体にメンブレンをインキュベートし、室温で1時間、ゆっくりと攪拌しながらロッキングプラットホームでインキュベートします。攪拌力の高いロッキングプラットフォーム上でTTBSを使用して、それぞれ5分間、3〜6回の洗浄を行います。市販のルミノール溶液とメンブレンをインキュベートして二次抗体のシグナルを解析し、製造元の指示に従ってください。

化学発光イメージングシステムを使用して信号を検出します。相互作用するタンパク質を同定するには、同じブロットで適切な抗体を使用してこれらの手順を繰り返します。ギャップ結合、接着結合、およびタイトジャンクションの成分が乳腺で相互作用できるかどうかを調べるために、共免疫蛍光アッセイを実施しました。

共免疫蛍光アッセイは、接着結合の不可欠なタンパク質であるβ-カテニンとギャップ結合タンパク質であるコネキシン26が、授乳7日目にマウス乳腺の細胞膜に共局在することを示しています。細胞核は青色DAPI染色で可視化されます。妊娠18日目の乳腺からの凍結切片を切断し、Claudin 7(緑)、E-Cadherin(赤)、Connexin 26(コーラルブルー)のギャップジャンクションタンパク質

核は青色DAPIで染色しました。E-CadherinおよびClaudin 7の共局在は黄色から淡いオレンジ色で示され、Connexin 26とE-CadherinおよびClaudin 7の共局在は白く紐打たれた染色をもたらしました。どの結合タンパク質が細胞膜で混ざり合い、物理的につながれているかを調べるために、授乳マウスの乳腺組織を用いて共免疫沈降を行いました。

その結果、ギャップ結合の成分であるConnexin 43は、E-CadherinおよびClaudin 7と相互作用するが、Claudin 3とは相互作用しないことが示されました。これらの結果は、相互免疫沈降法によって確認されました。E-カドヘリンを免疫沈降させると、コネキシン43およびクローディン7と相互作用しました。

この手法を習得すると、4〜8枚のスライドの共免疫蛍光法を2日で行うことができ、適切に実行すれば翌日にスライドを画像化できます。共免疫蛍光法を試行する際には、波長が重複しない異なる空間で産生された異なるFluoro 4標識抗体を選択すること、および共免疫沈降に使用される抗体に適合する適切なプロテインAまたはG磁気ビーズを選択することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、細胞生物学の分野の研究者がマウスの乳腺における細胞間接合の相互作用を探求する道を開きました。

作業は非常に危険であり、この手順を実行するときは常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。