Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

次のビデオでは、C-Brick 標準を使用して、CRISPR 関連タンパク質である Cpf1 を使用して DNA パーツを組み立てる手順について詳しく説明します。この方法は、合成生物学の分野におけるDNA集合体の開発を促進することができます。例えば、複雑な遺伝的回路の構築を容易にするなど。

この方法の主な利点は、配列に依存せず、DNAコンストラクトの反復的な組み立てを可能にすることです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、Cpf1が単一のsiRNAと触媒DNAが積み重なっていることに気付いたときでした。したがって、DKNを生成します。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるShi-Yuan Liです。crRNAテンプレートを修復するには、個々のオリゴヌクレオチドをRNase遊離水に再懸濁し、10マイクロモルの濃度にします。0.2ミリリットルのPCRチューブに、添付のドキュメントに詳述されているように、上鎖オリゴヌクレオチド、下鎖オリゴヌクレオチド、および10倍アニーリングバッファーを追加します。

総容量が50マイクロリットルであることを確認してください。この表は、6つの異なるボトムストランドオリゴヌクレオチドを示しており、それぞれをトップストランドであるT7-Fと個別にペアにする必要があります。小文字は、crRNAのガイド配列に転写される配列を表しています。

PCRチューブをサーモサイクラーに入れます。アニーリングプログラムを最初の脱硝を摂氏95度で5分間行い、その後、摂氏95度から摂氏20度まで冷却し、1分間に摂氏1度減少させます。アニーリング後、アニールした生成物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内でRNaseフリー水、T-7転写バッファー、NTP混合物、組換えRNase阻害剤、T-7 RNaseポリメラーゼと組み合わせ、直ちに転写を行います。

反応を摂氏37度の水浴で一晩インキュベートします。翌日、RNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用して、転写されたRNAを精製します。UV-Vis分光光度計を使用して、RNAを定量します。

次に、RNAを10マイクロモルの濃度に希釈します。サンプルをすぐに使用しない場合は、摂氏80度で保管してください。C-Brick部品の構築は、いくつかの方法で行うことができます。

ビデオのこのセクションでは、3つのクロモプロテインカセット、cjBlue、eforRed、およびamilGFPをシームレスアセンブリ法を使用して組み立てます。まず、色素タンパク質カセットのPCR増幅用のオリゴヌクレオチドを設計し、注文します。オリゴヌクレオチドが到着したら、超純水に10マイクロモルの濃度で再懸濁します。

次に、PCR反応をセットアップするために、0.2ミリリットルのPCRチューブを氷の上に置きます。超純水、2つのXPCRバッファー、DNTP、フォワードプライマーとリバースプライマー、クロモタンパク質テンプレート、およびハイフィデリティDNAポリメラーゼを添加します。チューブを直接サーモサイクラーに配置し、プログラムを実行します。

サンプルはすぐに使用するか、凍結して摂氏20度で保管してください。増幅後、キットを使用してPCR産物を精製します。次に、C-Brick標準ベクターをBamH1で消化するために、超純水、プラスミド、10倍バッファー、およびBamH1をチューブに加えます。

水浴中で摂氏37度で最大2時間インキュベートします。ゲルクリーンアップキットを使用して直鎖状化ベクターを精製します。クリーンアップに続いて、直鎖状ベクター、PCR産物、5xシームレスアセンブリバッファー、およびシームレスアセンブリキットからのシームレスアセンブリ酵素を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに組み合わせます。

総容量が10マイクロリットルであることを確認してください。これを摂氏37度のウォーターバスに30分間入れます。インキュベーション後、サンプルをすぐに使用するか、氷の上で凍結して摂氏20度で保存します。

90マイクロリットルの大腸菌DH10Bに、10マイクロリットルのコンストラクトを加えます。化学変換を実行します。次に、形質転換した細胞をLBプレートに広げ、摂氏37度でインキュベートします。

翌日、数種類のクローンを選抜し、5ミリリットルの液体LBチューブで培養し、220rpmのシェーカーで摂氏37度で一晩インキュベートします。プラスミド調製キットを使用してプラスミドを抽出します。次に、サンガーシーケンシングにより正しいクローンを同定します。

C-Brickパスの構築は、反応性PCIアプリケーションによって、またはT4 DNAリガーゼ培地の即時消化からライゲーションへの制限によっても達成できることを知っておいてください。次に、C-BrickベクターをCpf1で消化するために、RNase遊離水、10x Cpf1バッファー、プラスミド、組換えRNase阻害剤、およびCpf1を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに組み合わせます。外来DNA断片をT1およびT2部位に挿入するには、1マイクロリットルのcrRNA T2を追加し、チューブを摂氏37度の水浴で30分間インキュベートします。

次に、チューブを水浴に入れたまま、1マイクロリットルのcrRNA T1、1マイクロリットルのCpf1を加え、さらに30分間インキュベートします。crRNA T2が最初に追加されるのは、2つの認識部位がベクターDNA上でより近いためです。T1部位に結合するCpf1は、T2部位の寝床に影響を与える可能性があります。

また、T2'siteがT2部位を置換する場合、crRNA T1が最初に追加されるとT2'siteは破壊されます。1マイクロリットルの感熱性アルカリホスファターゼを加え、チューブを摂氏37度の水浴でさらに1時間インキュベートします。アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを使用してベクターを精製します。

サンプルはすぐに使用するか、凍結して摂氏20度で保管してください。目的のDNA断片をCpf1で消化するには、RNaseフリーウォーター、10x Cpf1バッファー、プラスミド、組換えRNase阻害剤、およびCpf1を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに組み合わせます。T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、チューブにcrRNA T1111マイクロリットルとcrRNA T31マイクロリットル1マイクロリットルを加え、摂氏37度の水浴で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップキットを用いてフラグメントを精製します。サンプルはすぐに使用するか、凍結して摂氏20度で保管してください。次に、C-Brickベクターで外来DNAフラグメントをライゲーションするために、直鎖状ベクターとDNAフラグメントを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに組み合わせます。

10x T4 DNAリガーゼバッファーとT4 DNAリガーゼを添加します。その後、摂氏22度で2時間インキュベートします。サンプルはすぐに使用するか、凍結して摂氏20度で保管してください。

10マイクロリットルのライゲーション産物を大腸菌DH10Bコンピテントセルに添加し、化学形質転換を行います。次に、形質転換した大腸菌をLBプレートに広げ、摂氏37度でインキュベートします。翌日、5ミリリットルの液体LBチューブに数個のクローンを加え、220rpm、37°Cのシェーカーで一晩インキュベートします。

プラスミド調製キットを使用してプラスミドを抽出します。次に、サンガーシーケンシングにより正しいクローンを同定します。C-Brickアセンブリの新しいラウンドを実行します。

このサンプルを使用して、いわゆるクラッククローンを新しいC-BrickベクターまたはDNAピースとして使用して、さらにC-Brickの反復アセンブリを行うことができます。このビデオで説明されているように、3つの染色タンパク質カセット、cjBlue、eforRed、およびamilGFPを組み立てました。3つの色素タンパク質をプレート上に成長させた大腸菌で発現させました。

色素タンパク質を含まないネガティブコントロール細菌は、4枚目のプレートに示されています。その後、2つの色表現カセットをさらにC-Brick規格で組み立て、より多くの色を作り出しました。3つの染色タンパク質と3つのアセンブルされた二重染色タンパク質を、液体LB培地で増殖させた大腸菌で発現させた。

1から6まで、表される構成体は、eforRed、1、amilGFP、2、cjBlue、3、amilGFPとeforRed、4、eforRedとcjBlue、5、およびamilGFPとcjBlue、6である。1枚のプレート上、または1本の微量遠心チューブ内のカラフルな細菌は、1つの配列検証済みクローンから培養されました。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、1週間で行うことができます。

この手順を試行する際は、siRNAの調製とCpf1のクリアランスのために、すべての材料がRNaseを含まない必要があることを覚えておくことが重要です。私は今でも、この戦術が合成生物学の研究者が代謝経路の遺伝的ショーケースを構築する方法として役立っていることを推奨しています。このビデオを見れば、C-Brick標準を使用してDNAパスを組み立てる方法について十分に理解できるはずです。