フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

この実験の全体的な目標は、中枢神経系またはCNS内のマクロファージ亜集団によって発現されるさまざまなマーカーを評価することです。この方法は、中枢神経系がめまいを起こすようなデュペリーマクロファージや、マクロファージにおける中枢神経系の表現型など、神経免疫学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、高度に精製された多数のマクロファージ亜集団の単離、ならびにマクロファージ亜集団細胞マーカーの連続化です。

まず、細いハサミを使用して剣状突起のすぐ下の腹側皮膚を切断し、胸腔を露出させます。横隔膜を切開し、胸郭の外側を尾側から吻側方向に切開して心臓を露出させます。左心室と右心房を特定した後、25ゲージ針を備えたバタフライカテーテルを左心室に挿入します。

右心房を切開し、血液が流れ始めるとすぐに、カテーテルを通して毎分10ミリリットルの割合で20ミリリットルのPBSを大量に使用し始めます。成功した滲出は、血液が置換されるときに肺と肝臓が白くなることによって示されます。次に、細いハサミを使って脊柱を解剖します。

脊柱の腹側にある腹壁の筋肉組織を切除し、尾の付け根にある脊柱を切断して、採取した背骨を取り除きます。200マイクロリットルのピペットチップを改造したPBSの10ミリリットルシリンジを脊柱の腰椎側に挿入します。次に、頸部側の脊髄を洗い流します。

頭蓋骨の上の皮膚を取り除き、ハサミの先端を頭蓋骨の付け根に一本挿入します。矢状縫合糸に従って頭蓋骨を切断します。次に、小さな鉗子を切り口に挿入し、頭蓋骨の上部をそっと取り外します。

マウスの頭部から脳を解剖し、嗅球と小脳を切除します。次に、脳と脊髄を1ポイント5ミリリットルのチューブに入れ、1ポイント1、2、8ミリリットルの消化カクテルを入れます。細胞を解離するには、小さなハサミを使用して脳と脊髄を1〜2立方ミリメートルに細かく切り、摂氏37度と二酸化炭素5%に30分間置きます。

インキュベーションの終わりに、20マイクロリットルのゼロポイント5モルEDTAで消化を停止し、続いて5ミリリットルのピペットで穏やかなトリチュレーションを行います。得られた細胞懸濁液を70ミクロンのメッシュストレーナーで50ミリリットルの円錐管にろ過し、10ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、残りの脳または脊髄組織を穏やかに浸軟させます。ストレーナーを5%のFBSとPBSの20ミリリットルですすいでください。

そして、ろ過された細胞を遠心分離によって収集します。次に、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。細胞の密度勾配分離のために、ペレットを4ミリリットルの30%密度勾配培地で懸濁し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。

37%の密度勾配媒体の下に4ミリリットルの密度勾配媒体を優しく敷設し、続いて37%の密度勾配媒体の下に70%の密度勾配媒体を4ミリリットル下敷きにします。チューブをベンチトップ遠心分離機に移し、細胞を分離します。ミクログリア細胞とマクロファージ細胞は、70%と37%の密度勾配層の界面にあります。

チューブは層状に見えます。ミエリンの上層を慎重に取り除いた後、ミクログリアマクロファージ間期層の3〜4ミリリットルを新しい15ミリリットルのチューブに移します。次に、15ミリリットルのPBSで3つの遠心分離機で免疫細胞を洗浄し、最終洗浄後にペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。

マクロファージ亜集団マーカーの発現を評価するには、細胞を5ミリリットルのフローサイトメトリー分析チューブに移し、続いて1マイクロリットルの固定可能な死細胞染色試薬を添加します。氷上で30分間光から保護した後、サンプルを2ミリリットルのPBSで洗浄し、実験分析チューブごとに400マイクロリットルのファックスバッファーにペレットを再懸濁します。細胞を適切な数の5ミリリットルフローサイトメトリー分析チューブに分割します。

次に、細胞100マイクロリットルあたり1マイクログラムのCD 16 CD 32ブロッキング抗体カクテルで非特異的FC受容体の結合をブロックし、光から保護された氷上で10〜15分間インキュベーションします。次に、100マイクロリットルの適切な一次抗体で細胞を標識し、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、細胞を2ミリリットルのPBSで4回洗浄します。

次に、光から保護された氷上で100マイクロリットルの適切な二次抗体を30分間加え、その後、示したようにPBSで4回洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを100マイクロリットルの1パーセントパラホルムアルデヒドに室温で15分間静かに再懸濁し、光から保護します。次に、PBSで細胞を4回洗浄します。

最終ペレットを200マイクロリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで細胞を分析します。脳および脊髄由来のミクログリアおよび単球由来のマクロファージは、それらのCD 11、B、およびCD 45の発現に基づいて同定されます。CD11B陽性CD45中性ミクログリア細胞によるCX3CR1およびTmem119の発現により、この細胞集団は、これらのマーカーのいずれも発現しないがCCR2を発現するCD11C陽性CD45高単球由来マクロファージとさらに区別することができる。

密度勾配分離後も、細胞の85〜95%はまだ生存しています。密度勾配の単離がない場合、マクロファージ亜集団は、非マクロファージ細胞およびミエリン破片が存在するため、前方両側散布図で識別できない。抗Tmem119抗体によって認識されるエピトープは細胞内であるため、この重要なミクログリア細胞マーカーの標識には透過化が必要です。

ただし、透過化は細胞の縮小を誘発し、前方散乱と側方散乱の解析によりマクロファージ亜集団が小さく見えることに注意してください。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了することができます。この手順を試みましたが、密度グラデーションを非常に慎重に設定することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、定量的rt-PCRなどの他の方法を実行して、マクロファージ亜集団シグナル伝達経路に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、神経科学分野の研究者が神経疾患のマウスモデルにおけるマクロファージ亜集団の活性化を探求する道を開きました。このビデオを見た後、テストを実施するか、フローサイトメトリーによるマクロファージ亜集団としてこの伝統に従う必要があります。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常にフードの使用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。