Name: フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによるマウス中枢神経系マクロファージサブ集団の解析手法。ミクログリアと単球由来マクロファージを分離し、CD11bやCD45などのマーカー発現を評価することで、神経免疫学における細胞表現型の理解を深めます。

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この研究は、Agence Nationale Pour la Recherche（ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD）、Association France AlzheimerおよびBpifranceからの助成金によって支援された。私たちの研究室は、Inserm、CNRS、Pierre et Marie-CurieUniversidéと「Investissements d&#39;avenir」ANR-10-IAIHU-06（IHU-A-ICM）の支援を受けています。 CELIS細胞培養コア施設の支援に感謝したいと思います。

ここに記載されている全ての方法は、ICM研究所の機関動物管理利用委員会とダーウィンフランス倫理委員会によって承認されており、プロトコル01407.02の適用を受けています。 1.準備<ol><li>各マウスのために以下のものを組み合わせることにより、1.5mLチューブで消化カクテルを調製する：1mLリン酸緩衝食塩水（PBS）; 13 wunsch / mL（ストック溶液）、最終濃度1.6 wunsch / mLで123μLの消化酵素（材料の表参照）。 100mg / mL（ストック溶液）、最終濃度0.5mg / mLで5μLのDNase I（材料の表参照）を添加する。 </li></ol> 2.灌流および切開<ol><li>致死量のペントバルビタール（400mg / mLで100μL）でマウスを安楽死させる。 </li><li>動物を仰臥位に置き、70％エタノールで体を濡らします。 </li><li>胸骨の窩を露出させるために、腸骨棘のちょうど下の細かいはさみで腹部の皮膚を切るy。 </li><li>横隔膜に切開を入れ、心臓を露出させるために（そして他の器官を切断することを避けるために）尾側から吻側への細かいはさみで胸郭の側面を切断する。左心室（LV）と右心房（RA）を特定する。 </li><li> LVの内側に25Gの針を入れたバタフライカテーテルを挿入します。細かいはさみでRAを切開し、血流の開始時に、20mLのPBSを用いて10mL /分の流速で灌流を開始し、血管から細胞および血液を除去する。正常な灌流は、血液が移動するにつれて肺と肝臓との間のブランチングによって示される。 </li><li>中位のはさみで動物を断頭してください。脊柱の腹側にある腹壁筋肉を切除し、尾根の根元で脊柱を切断することにより、脊柱を細かいハサミで解剖し、体から分離する。 </li><li> PBSと腰椎側に200μLピペットチップを搭載している10mLシリンジを挿入脊柱を洗浄し、頚椎側の脊髄を洗い流す。 注：200μLのピペットチップは、最も広い端部（約1cm）ではさみで切断し、PBSであらかじめ充填した10mLのシリンジにしっかりと挿入します。 </li><li>頭蓋骨の上の肌を除去し、脳を暴露するために鉗子を使用してください。頭蓋骨の基部にはさみ刃を挿入し、矢状縫合に続いて頭蓋を切断する。小さな鉗子をカットに挿入し、頭蓋骨を静かに持ち上げます。マウスの頭部から脳を解剖し、嗅球と小脳を除去する。 </li><li> 1.128 mLの消化カクテルを含むPBS（ステップ1.1から）を含む1.5 mLチューブに脳と脊髄を集める。 </li></ol> 3.細胞の解離<ol><li> 1.5 mLチューブ（ステップ2.9）の脳と脊髄を細かいはさみで1〜2 mm 3に細かく切断します （ 図1 ）。 </li><li>細かくした組織を入れた1.5mLのチューブを30分間インキュベートする37℃、5％CO 2でインキュベートする。 注：このステップで密度勾配を準備します。 </li><li>酵素反応を停止するために1.5 mLチューブに0.5μMEDTA（ストック溶液）20μL、最終濃度10 mMを加えます。 </li><li> 5mLのピペットでピペットで上下に静かに細胞懸濁液を作る。 </li><li> 10mLシリンジのプランジャーを使用して、50mLチューブ内のナイロンメッシュ（70μm孔径）に細胞懸濁液を通過させます。 </li><li> 20mLの5％ウシ胎仔血清（FBS）-PBSでナイロンメッシュを洗浄する。 </li><li>室温（18℃）で7分間遠心分離する（300×g）。上清を吸引して捨て、次のステップに進む。上清を取り除くときは十分に注意してください。ペレットを邪魔しないでください。ペレットは吸引ピペットで簡単に吸引できます。 </li></ol> 4.密度勾配<ol><li>適切な量​​の10×PBSを密度勾配媒体に添加することによって、密度勾配媒体の保存溶液を調製する。 注：1部の10X PBSを9部の密度勾配媒体に加えます。 </li><li> 表1に記載されているように、 1 ％PBSでストック密度勾配媒体を異なる割合で希釈する。 </li><li>ペレット（ステップ3.7から）を4mLの30％密度勾配媒体で再懸濁し、15mLチューブに移す。 </li><li>パスツールピペットを15mLチューブの底に置き、37mLの密度勾配培地4mLをゆっくりと下ろす。 </li><li>上記のように、4mLの70％密度勾配媒体を添加する。 </li><li>勾配を室温（18℃）で40分間（800xg）遠心分離する。中間相が妨げられないように、遠心分離機が最小限のブレーキなしで停止することを確認する。 注：チューブは層状に表示されます。 70％〜37％の密度勾配界面で層化された細胞は、単核免疫細胞（小膠細胞およびマクロファージ小集団）である。上位レベルは細胞破片およびミエリンである（ 図2 ）。 </li><li&gt;転送ピペットを使用して、穏やかにミエリンの層を除去する。 </li><li>清潔な15mLのチューブに、マクロファージ亜集団細胞を含む70〜37％密度勾配間期の​​3-4mLを集める。 </li><li>細胞をPBSで3回洗浄し、全量を15mLとする。細胞を含む密度勾配培地をPBSで少なくとも3回希釈し、ブレーキを「オン」にして7分間遠心する（500 xg、4℃）ことを確認します。 </li><li>細胞ラベリングまたは他の機能アッセイのために1mL PBSで細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol>フローサイトメトリー用細胞標識<ol><li>フローサイトメトリーチューブに細胞を移す（ステップ4.10）。 </li><li>ステップ4.10で得られた各細胞サンプルに1μLの固定可能な死細胞染色試薬を加えます。氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。 </li><li>細胞を2 mLのPBSで1回洗浄し、5分間遠心（300 xg、4℃）します。 </li><li>上清を除去し、細胞ペレットを400μLのPBS1％BSA、0.1％アジド。 </li><li> 1μgのCD16 / CD32抗体を100μLの細胞に加えて、Fcレセプターをブロックする。氷上で10-15分間インキュベートし、光から保護する。 </li><li>細胞内染色のための細胞浸透化のために、PBS 1％BSA、0.1％アジドまたはPBS 1％BSA、0.1％アジド、0.25％サポニン中の一次抗体混合物を調製する。 </li><li> 100μLの一次抗体ミックス（2×）を添加し、氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。 注：最適な結果を得るためには、実験を行う前にすべての抗体を滴定する必要があります。 </li><li> 2mLのPBSで細胞を洗浄し、5分間遠心分離する（300×g、4℃）。この手順を3回繰り返します。 </li><li>一次抗体がフルオロフォアに直接コンジュゲートしていない場合は、100μLの二次抗体を添加し、氷上で30分間インキュベートし、光から保護する。 </li><li> 4℃で300xgで5分間遠心分離して2mLのPBSで細胞を洗浄する。この手順を3回繰り返します。 </li><li>修正する100μLの1％PFAを含む細胞に、光から保護された室温で15分間インキュベートする。 注意：注意：PFAは有毒です。ヒュームフードで使用し、個人用保護具を着用する。 </li><li> 4℃で300 xgで5分間遠心分離して2 mL PBSで細胞を洗浄する。この手順を3回繰り返します。 </li><li> 200μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーの取得と分析に進みます。 図3のゲーティング戦略に従います 。 </li></ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない

ミクログリアおよびMDMは、CNSにおいて異なる機能および表現型を有することが実証されており、したがって、これらのマクロファージ亜集団の同定および分析は、神経疾患9,18,25をよりよく理解するために不可欠である。 2つのマーカー（CD11bおよびCD45）を使用するフローサイトメトリー分析は、各亜集団の間の区別を可能にする（ 図3C ）。この戦略は、MDMについてはCCR2、ミクログリアについてはCX3CR1などの他の特異的マーカーを用いて以前に検証されており、Tmem119に対する抗体を用いた近年開発されたアプローチ（ 図 3E〜3G）が行われている。我々は、以前に18を公​​表したように、 CCR2およびCX3CR1抗体（ 図3F 、3G ）を用いて実験を行った。 CD11b + CD45CD11...

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）の実質組織に存在するマクロファージである。それらは2つの重要な機能的役割を果たします：免疫防御およびCNSホメオスタシスの維持。骨髄の造血幹細胞から絶えず更新されているMDMとは対照的に、ミクログリア細胞は、胚発生の間に脳に定着した卵黄嚢（YS）に由来する原始造血前駆細胞から分化する1,2,3 。げっ歯類では、転写因子Mybは、骨髄由来の単球およびマクロファージのすべての発生に重要な役割を果たすが、YS由来のミクログリアについては、この因子は不可欠であり、分化は転写因子PU.14に依存する。 健康な中枢神経系において、ミクログリアは、絶えず彼らの環境をスクリーニングする動的細胞である侵入する病原体または組織の損傷のための巣作りおよび調査5 。そのようなシグナルの検出は、傷害を解決するための経路を開始する。ミクログリアは、急速に形態を変化させてアメイボイドに転換し、続いて食作用および炎症性サイトカインなどの様々なメディエーターの貪食および放出が起こる。したがって、それらの微小環境に依存して、活性化ミクログリアは、異なるプライミング状態のスペクトルを獲得することができる6 。 ミクログリアは、多くの神経障害の発症および進行に深く影響する。アルツハイマー病（AD） 7 、筋萎縮性側索硬化症（ALS） 8 、多発性硬化症（MS） 9またはパーキンソン病（PD） 10のげっ歯類モデルにおいて、ミクログリアは有害な神経毒性を誘発するか、神経保護的な様式で、これは依存性である特定の疾患、病期、およびその病気が全身性免疫コンパートメント7,8,9,10,11の影響を受けているかどうかを判定した。上記の疾患において観察されるCNS病変の大部分は、実質性小膠細胞だけでなく、血管周囲および髄膜マクロファージならびにCNS浸潤性MDMを含む骨髄系細胞の異種集団を含む。これらの細胞型は、傷害および修復に関連する病態生理学的機構に示差的に寄与する可能性がある7,12,13,14,15。これらの疾患モデルを研究している研究者の現在の課題は、末梢単球およびマクロファージがCNSに浸潤するかどうかを確かめることであり、そうであれば、distこれらの細胞から常在性小膠細胞を摘出する。実際、小膠細胞は非常に塑性である。それらが活性化されると、ミクログリアは、通常、末梢単球およびマクロファージによって発現されるマーカーを再発現する。従って、この問題は、常在ミクログリアを浸潤単球およびマクロファージから区別することができるマーカーを同定することに依存する。 免疫組織学的適用による脳切片上のこれらの集団の識別は、特異的抗体の欠如のために制限される。しかし、フローサイトメトリー分析は、いくつかのマーカーの発現を評価し、細胞集団（例えば、リンパ球、マクロファージ/ MDM CD11b + CD45 high 、およびミクログリアCD11b + CD45 med ）ならびに細胞亜集団16 、 17,18 。このプロトコルは、最適化された酵素組織解離および密度勾配遠心分離を用いることによって神経疾患モデルにおいてマウスCNS由来の単核細胞を単離すること;ならびにフローサイトメトリーを用いてCNS中のミクログリアおよびMDM集団を識別するための方法を提供する。 別のアプローチは、特定の抗体19,20,21にコンジュゲートした磁気ビーズを使用することによってミエリンを除去し、細胞を精製することである。抗ミエリン磁気ビーズを使用するミエリン除去は、より高価であり、単離された細胞22の生存率および収量に影響を及ぼす。この段階およびミクログリアの以下の免疫磁気分離は、特定の免疫細胞集団のさらなる研究を制限する21,22 。 これらの手順は、疾患発症におけるマクロファージ亜集団を研究する簡単な方法を提供し、マクロファージの表現型および活性化状態における薬物効果または遺伝子修飾を決定する。

<table><tbody><tr><td>生後5ヶ月マウス</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼTL 研究グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来の消化酵素デオキシリボヌクレアーゼ I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>密度勾配培地</td></tr><tr><td>細胞ストレーナー サイズ 70 & マイクロ;m ナイロン</td><td>コーニング</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>ピストンシリンジ 10 mL</td><td>テルモ</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット 230 mm</td><td>ダッチャー</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブ</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mLポリスチレン丸底チューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(1x)、Ca2+/Mg2+</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(10x)、Ca2+/Mg2+</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14200-067</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>サーモなしフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン溶液 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 32% 溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714-S</td><td>注意 -有毒</td></tr><tr><td>なサポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 ラット抗マウス CD11b (クローン M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2b K アイソタイプ制御 PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 ラット抗マウス CD45 (クローン 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 ラット IgG2b, & カッパ;アイソタイプコントロール RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life</td><td>Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Mouse Fc Block</td></tr><tr><td>Fixable Dead Cell Stain Kits</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>マウスCCR2 APC標識抗体</td><td>R&D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2B APC 標識アイソタイプコントロール</td><td>R&D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>マウス CX3CR1 PE-conjugated Antibody</td><td>R&D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ IgG PE 標識抗体</td><td>R&D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>セルアナライザー</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>データ解析ソフトウェア</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>メイヨーハサミ</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 フォーセプス</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

数多くの研究が、中枢神経系（CNS）病変における免疫細胞、特にマクロファージの役割を実証している。 CNSには、（i）CNSの常在マクロファージであり、胚形成中に卵黄嚢前駆体に由来するミクログリア、および（ii）浸潤し得る単球由来マクロファージ（MDM）の2つの主要なマクロファージ集団が、疾患中のCNSは骨髄前駆細胞に由来する。各マクロファージ亜集団の役割は、研究されている病理によって異なる。さらに、これらのマクロファージ亜集団に使用される組織学的マーカーまたは識別基準にコンセンサスはない。しかし、フローサイトメトリーによるCD11bおよびCD45マーカーの発現プロファイルの分析は、我々がミクログリア（CD11b + CD45 med ）をMDM（CD11b + CD45 high ）から区別することを可能にする。このプロトコルでは、密度勾配遠心分離フローサイトメトリー分析を用いて、これらのCNSマクロファージ亜集団を特徴づけ、最近発表されたこれらの細胞によって発現されるいくつかの興味深いマーカーを研究することができる。従って、この技術は、神経疾患のマウスモデルにおけるマクロファージの役割をさらに理解することができ、これらの細胞に対する薬物効果を評価するためにも使用することができる。

密度勾配遠心分離および抗体染色の後、細胞をフローサイトメーターで取得し、以下のような形態学的ゲーティング戦略を用いて分析した。単一の細胞を二重線から区別するために、ドットプロット前方散乱領域（FSC-A） 対前方散乱高（FSC-H）で第1ゲートを定義した（ 図3A ）。次いで、相対細胞サイズおよび細胞粒度に基づいて、細胞破片および角化細胞を排除するために、単一細胞をFSC-A 対側方散乱面積（SSC-A）ドットプロットでゲートした（ 図3B ）。 MDMは、CD11bおよびCD45マーカーの発現レベルに基づいて同定された（ 図3C 、3D ）。最後に、各マクロファージ亜集団について他の発現マーカーを分析した（ 図 3E〜3G ）。マイ...

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

この実験の全体的な目的は、中枢神経系（CNS）内のマクロファージサブポピュレーションによって発現するさまざまなマーカーを評価することです。この手法は、神経免疫学分野における重要な疑問、例えばCNSにおけるマクロファージの挙動や、CNSマクロファージの表現型はどのようなものであるか、といった問いへの回答に役立ちます。本手法の主な利点は、高度に精製された大量のマクロファージサブポピュレーションを単離できること、およびマクロファージサブポピュレーションの細胞マーカーを定量化できることです。まず、細い鋏を用いて剣状突起の直下の腹側皮膚を切開し、胸腔を露出させます。横隔膜を切開し、肋骨の側方を尾側から頭側に向かって切断して心臓を露出させます。左心室と右心房を確認した後、25ゲージの針が付いたバタフライカテーテルを左心室に挿入します。右心房を切開し、血液が流れ始めたらすぐに、カテーテルを通じて20 mLのPBSを10 mL/minの速度で灌流し始めます。血液が置換され、肺と肝臓が白くなることで、灌流が成功したことがわかります。次に、精細剪刀を用いて脊柱を解剖します。脊柱の腹側にある腹壁筋肉を切り出し、尾の付け根で脊柱を切断して、脊髄を採取します。200 µLのピペットチップを装着して改造した10 mLのPBS入りシリンジを、脊柱の腰椎側に挿入します。その後、頸椎側から脊髄をフラッシュします。頭蓋骨上の皮膚を取り除き、ハサミの先端の一方を頭蓋底に挿入します。正中縫合に沿って頭蓋骨を切断します。次に、切開部に小型のピンセットを挿入し、頭蓋骨の上部を慎重に取り除きます。マウスの頭部から脳を摘出し、嗅球と小脳を除去します。次に、脳と脊髄を1.128 mLの消化カクテルを含む1.5 mLチューブに入れます。細胞を解離させるため、小手術用ハサミを用いて脳と脊髄を1～2 mm³の細片に細かく切り刻み、37 °C、5% CO₂の条件下で30分間置きます。インキュベーション終了後、0.5 M EDTAを20 µL加えて消化を停止させ、5 mLピペットで穏やかにトリチュレーション（pipetting）を行います。得られた細胞懸濁液を70 µmのメッシュストレーナーでろ過し、10 mLシリンジのプランジャーを用いて、残っている脳または脊髄組織を穏やかにすり潰しながら、50 mLコニカルチューブに回収します。ストレーナーを5% FBSおよびPBS 20 mLで洗浄します。そして、遠心分離によりフィルター後の細胞を回収します。次に、ペレットを乱さないように注意して上清を吸引します。細胞の密度勾配分離を行うため、ペレットを4 mLの30%密度勾配培地で懸濁し、細胞を15 mLコニカルチューブに移します。37%密度勾配培地を4 mL静かに重層させ、続いてその上に70%密度勾配培地を4 mL重層させます。チューブを卓上遠心機に移し、細胞を分離します。ミクログリアおよびマクロファージは、70%と37%の密度勾配層の界面に回収されます。チューブ内は層状に分かれます。上層の髄鞘を注意深く取り除いた後、ミクログリア・マクロファージの間相層を3〜4 mL、新しい15 mLチューブに移します。次に、免疫細胞を15 mLのPBSで3回遠心洗浄し、最後の洗浄後にペレットを1 mLのPBSで再懸濁します。マクロファージのサブポピュレーションマーカーの発現を評価するため、細胞を5 mLのフローサイトメトリー分析チューブに移し、1 µLの固定可能死細胞染色試薬を添加します。遮光した状態で氷上で30分間置いた後、サンプルを2 mLのPBSで洗浄し、実験分析チューブ1本あたり400 µLのfaxバッファーでペレットを再懸濁します。細胞を適切な数の5 mLフローサイトメトリー分析チューブに分注します。次に、細胞100 µLあたり1 µgのCD16/CD32ブロッキング抗体カクテルを用い、遮光条件下で氷上で10〜15分間インキュベートして、非特異的なFcレセプター結合をブロックします。続いて、適切な一次抗体100 µLで細胞を標識し、遮光条件下で氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、2 mLのPBSで細胞を4回洗浄します。次に、適切な二次抗体100 µLを加え、遮光して氷上で30分間反応させた後、先ほど示した通りPBSで4回洗浄します。最後の洗浄後、1%パラホルムアルデヒド100 µLにペレットを穏やかに再懸濁し、遮光して室温で15分間静置します。その後、細胞をPBSで4回洗浄します。最終ペレットを200 µLの新鮮なPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで細胞を解析します。脳および脊髄由来のミクログリアと単球由来マクロファージは、CD 11 BおよびCD 45の発現に基づいて識別されます。CD 11 B陽性かつCD 45 mediumのミクログリア細胞におけるCX3CR1およびTmem119の発現により、この細胞集団をCD 11 C陽性かつCD 45 highの単球由来マクロファージからさらに区別できます。後者はこれらのマーカーのいずれも発現せず、代わりにCCR2を発現しています。密度勾配分離後、85%から95%の細胞が依然として生存しています。密度勾配による単離を行わない場合、非マクロファージ細胞や髄鞘（ミエリン）のデブリが存在するため、前方散乱光・側方散乱光（FSC/SSC）プロットにおいてマクロファージのサブポピュレーションを識別することはできません。anti-Tmem119抗体が認識するエピトープは細胞内にあるため、この重要なミクログリア細胞マーカーを標識するには透過処理が必要です。透過処理によって細胞の収縮が誘導されるため、前方散乱光および側方散乱光による解析では、マクロファージのサブポピュレーションがより小さく見えることに注意してください。この手法に習熟し、適切に実施すれば、5時間で完了させることができます。私がこの手順を試みた際、密度勾配を非常に慎重に設定することが重要であると感じました。本手順に続いて、定量的rt-PCRなどの他の手法を用いて、マクロファージ亜集団のシグナル伝達経路に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。本技術の開発により、神経科学分野の研究者が神経疾患のマウスモデルにおけるマクロファージ亜集団の活性化を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴した後は、実際に試験を行うか、フローサイトメトリーによるマクロファージ亜集団の解析というこの手法に従ってください。パラホルムアルデヒドの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は常にドラフトチャンバーの使用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ミクログリアは中枢神経系の防衛と免疫監視の最初の行を提供するマクロファージを常駐しています。...

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

このビデオは、マウスの眼に硝子体内送達後の蛍光バイオ粒子のミクログリア取り込みを測定するためのフローサイトメトリーを示しています。フローサイトメトリーは、CD11bを発現する生細胞を検出し、緑色蛍光を示す食作用性ミクログリア細胞を、Ly6C発現単球やLy6G発現好中球などの他の骨髄系細胞と区別します。...

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。...

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々...

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。...

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

ここでは、フローサイトメトリーを使用してvGLUT1陽性シナプスとpHRodo...

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

損傷した脊髄のミクログリア(MG)と末梢浸潤マクロファージ(Mø)の同定は困難です。このプロトコールでは、フローサイトメトリー(FCM)を使用して、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møを同定しました。この技術は、MGとMøの役割を理解するために、他の中枢神経系疾患にも適用できます。...

フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

ここでは、ミニ脳卒中モデルでのフローサイトメトリー分析を使用して、虚血性脳卒中後の免疫細胞機能を評価するためのプロトコルを紹介します。この方法は、神経免疫相互作用の詳細な調査を可能にし、他の神経変性疾患の研究にも適応できるため、脳卒中病理における免疫応答の理解を深めることができます。...

ミニ脳卒中マウスモデルにおける神経免疫相互作用の単離とフローサイトメトリー評価

このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。...

出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

学ぶフローサイトメトリーによるマウス中枢神経系マクロファージサブ集団の解析手法。ミクログリアと単球由来マクロファージを分離し、CD11bやCD45などのマーカー発現を評価することで、神経免疫学における細胞表現型の理解を深めます。

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

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