Name: フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離法。高速で再現性の高い標準化プロトコルにより、網膜変性疾患の視力低下メカニズム研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者はテクニカルビデオアシスタンスのための免疫学および生化学の微生物学部門のシニアイラストレーター、ティムヒギンズ氏に感謝したい。 Matthew W. Wilson博士とJablonskiとMorales-Tiradoラボのメンバーの皆さんにお話を伺いました。この研究は、アルコン研究所の若手研究者賞（VMM-T）、テネシー大学研究財団（VMM-T）、国立眼科研究所EY021200（MMJ）、ゲーウィンフェローシップ（VMM-T） Gerwin Pre-doctoral Fellowship（ZKG）、国防総省陸軍医学研究院（VMM-T）、および無防備失調症研究のための無制限助成金などが含まれます。

<ol><li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li>
<li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li>
<li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head%3A+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li>
<li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li>
<li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li>
<li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+number%2C+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li>
<li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li>
<li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li>
<li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li>
<li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li>
<li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li>
<li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional%2C+cellular%2C+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li>
<li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%3A+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li>
<li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li>
<li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li>
<li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).</li>
<li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Ophthalmol+Strabismus%22%5BJournal%5D)">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li>
<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936(2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62(2016).</li>
<li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5%2Fbrn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li>
<li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+%28RGC%29+loss+in+aging+DBA%2F2NNia+glaucomatous+mice%3A+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57%2FBL6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li>
<li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li>
<li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li>
<li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads%3A+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li>
<li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold%3A+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li>
<li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen%3A+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
</ol>

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

FACSは、細胞集団を精製するために選択される技術である。他の単離方法には、免疫パンニング、磁気ビーズ、および補体固定枯渇が含まれる。これらの他の方法に対するFACSの利点は、様々な程度の強度を有する細胞表面マーカーの同時同定に基づく。分子の蛍光強度はタンパク質発現量に比例する。今まで、RGCの単離は、使用した単離方法にかかわらず、 Thy1（CD90）陽性およびCD48陰性15,16,22,34にのみ基づいていた。 Thy1 + CD48 neg表現型は、RGC細胞内マーカーを発現する細胞の均質な集団を単離するのに十分ではないことが最近示されている23 。 RGC集団の同定は、それらの単離に必須であり、具体的には、彼らは網膜細胞7,8,9の小さなパーセンテージを構成しているからです。大部分のRGCは網膜の最内層に位置し、少数は内網状層に位置する（置換されたRGC 35 ）。したがって、定位注射およびヒドロキシスチルバミジン（ニューロンを概説するための逆行性トレーサー）による...

RGCは最終的に分化したニューロンであるため、実験には一次細胞が必要である。原発性ネズミ網膜神経節細胞（RGC）の単離および濃縮のためのプロトコールの開発は、 インビトロでのRGCの健康および変性の機序を明らかにする上で基本的なものである。これは、RGC機能を促進し、その死を最小限に抑えるための潜在的な治療法を生み出そうとする研究にとって特に重要です。 RGCの変性は、緑内障、糖尿病性網膜症および正常な老化などの網膜変性疾患に関連する。 RGC喪失の根底にある特定の細胞機構は不明であるが、一連の危険因子が同定されている。視神経乳頭1、2、3での酸素供給の欠如は、 RGC死を引き起こし、興奮性物質とiの活性化との間のホメオスタシスの障害として作用する個々のRGC内の阻害性受容体5,6 。一連の課題は、詳細な研究のためにこれらの細胞の使用への進展を妨げる。第1に、ネズミ網膜に存在するRGCの数は少ない。 RGCは全網膜細胞の7 ％ 、 8,9 ％未満を占める。第二に、ほとんどのRGC特異的マーカーは細胞内タンパク質10,11,12である。これらのマーカーに基づく選択は、細胞を生存不能にし、下流の機能的分析を排除する。最後に、現在利用可能なプロトコルは長く、標準化が不十分である 13,14 。初期のRGC単離プロトコールはイムノパニング法に基づいていた。 Barres et al。 15 古典的なイムノープを適応させた細胞表面マーカーである抗胸腺細胞抗原（別名Thy1）に対する免疫陽性に基づくポジティブ選択の前に網膜細胞の大部分から単球および内皮細胞を除外した第2段階を加えた。数年後、香港らは、純度の高いRGCを分離するためのセルソーティング戦略と組み合わせた磁気ビーズ分離技術16磁気ビーズの使用は、多くの科学的用途において依然として使用されている。一緒に、磁気ビーズおよびフローサイトメトリープロトコルは、単離された細胞の純度を改善した。しかし、これらの精製システムは、解離した網膜からのネズミRGCの単離のためにまだ標準化されていない。 フローサイトメトリーは、細胞懸濁液の光学特性および蛍光特性を測定する強力な分析方法です。細胞を高レベルの感度で定量的および定性的に分析して、細胞集団の多次元分析を提供するation。細胞の識別は、細胞の大きさまたは表面積、粒状性または内部の複雑さの2つの主要な物理的特性に基づいています。類似の励起波長および異なる放出を有する蛍光色素で標識された抗体を組み合わせることによって、多次元分析を行うことができる。フローサイトメトリーは、迅速で、再現性があり、感度が高い。マルチタイプレーザーは、フローサイトメトリーによる単一細胞のより大きな多次元分析を可能にする。したがって、それは細胞学的標本の研究のための魅力的な方法論である。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、フローサイトメトリーによって同定された多次元表現型の差異を用いて、個々の細胞を異なる亜集団に分類する。 過去10年間に、複数の表面タンパク質および細胞内タンパク質が、ニューロンを含む細胞の選択のための潜在的なバイオマーカーとして同定されている。ラットからRGCを単離することを試みた最初の研究は、Th1を神経節細胞として使用したlマーカー。残念ながら、Thy1、 別名 CD90は、他のげっ歯類種18,19,20に複数のアイソフォームを有し、RGCの非特異的マーカーとなる複数の網膜細胞タイプ19,20によって発現される。別の表面マーカー、CD48は、マクロファージおよびミクログリアを含む網膜の単球集団に見出される。これらの2つの表面マーカーを用いて、改変RGCシグネチャー-Thy1 +およびCD48ネガティブ細胞が開発された（15,16,21,22）。残念なことに、これらの2つの選択基準は、高度に濃縮されたRGC集団を選択するのに十分ではない。この満たされていないニーズに対処するために、フローサイトメトリープロトコルが、多層陽性選択基準および陰性選択基準に基づいて開発された一次ネズミRGCを富化および精製するための既知の細胞表面マーカーを提供する。

<table><tbody><tr><td>抗マウスCD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>クローン MC-480</td></tr><tr><td>抗マウスCD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>クローン HM48-1</td></tr><tr><td>抗マウスCD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>クローンVC1.1</td></tr><tr><td>抗マウスCD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>クローン30-H12</td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット 421 ヤギ抗マウスIgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Clone Poly4053</td></tr><tr><td>Purified Anti-mouse CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III block, Clone 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>生細胞/死細胞の識別</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>米国起源</td></tr><tr><td>AbC Total Antibody Compensation ビーズキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A10497</td><td>多種</td></tr><tr><td>Ig 神経基礎培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21103049</td><td>培養前に培地に血清を添加します。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010049</td><td>生理食塩水</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ-PTモデル</td><td>実体顕微鏡</td></tr><tr><td>Sorvall遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>すべての遠心分離が実施されました&nbsp; RT</td></tr><tr><td>ベースプレート&ndash;解剖パン</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>SB15233FIM</td><td>ワックスプレートも使用できます</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &frac12;インチ</td></tr><tr><td>Iris Scissors, Straight</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &frac12; インチ</td></tr><tr><td>ファルコン 15 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>352097</td><td>ポリプロピレンチューブ</td></tr><tr><td>ファルコン50mLコニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352098</td><td>ポリプロピレンチューブ</td></tr><tr><td>BD FACS チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>352003</td><td>ポリプロピレンチューブ</td></tr><tr><td>40 mm ディッシュ</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>組織培養処理</td></tr><tr><td>70 &mu;mナイロン製ストレーナー</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>sterile</td></tr><tr><td>40 &mu;m ナイロン製ストレーナー</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>sterile</td></tr><tr><td>&nbsp;BD 10 mLシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>301604</td><td>針なし使い捨てシリンジ</td></tr><tr><td>乳棒</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ウィートンバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>986734</td><td>ライナーなし</td></tr><tr><td>BD 30 G ニードル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>305128</td><td>1インチ</td></tr><tr><td>ハウサーサイエンティフィック ブライトライン ガラス計数チャンバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック 0267151B</td><td></td><td>血球計算盤</td></tr><tr><td>Gibco トリパンブルー 0.4% 溶液</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15250061</td><td>生存率 染料</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-402-25</td><td>1.5mL</td></tr><tr><td>EVOS フロイド細胞イメージング</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>447113</td><td>20倍対物レンズによる蛍光イメージング</td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>04-355-452</td><td>70%エタノールの製造に使用</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS ピペット L-1000XLS+</td><td>レイニン</td><td>17014282</td><td>LTS ピペット</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS ピペット L-200XLS+</td><td>レイニン</td><td>17014391</td><td>LTS ピペット</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS ピペット L-20XLS+</td><td>レイニン</td><td>17014392</td><td>LTS ピペット</td></tr><tr><td>ラック LTS 1000 mL &ndash;GPS-L1000S</td><td>レイニン</td><td>17005088</td><td>ブルーラック 滅菌チップ</td></tr><tr><td>ラック LTS 250 mL &ndash;GPS-L250S</td><td>レイニン</td><td>17005092</td><td>グリーンラック 滅菌チップ</td></tr><tr><td>ラック LTS 20 mL &ndash;GPS-L10S</td><td>レイニン</td><td>17005090</td><td>レッドラック 滅菌チップ</td></tr><tr><td>FACSAria II Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>LSR II サイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml;ller cells</td></tr><tr><td>Aldh1al</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml;ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>Calb2</em</td><td>>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>Amacrine, Horizontal</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Retinal Pigment Epithelial Cells</td></tr><tr><td>Gad2</em</td><td>>Thermo Fisher科学</td><td>Mm00484623_m1</td><td>アマクリン</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm01545399_m1</td><td>ハウスキーピング 遺伝子</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>Mm01297482_m1</td><td>水平</td></tr><tr><td>Lim2Lim2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00624623_m1</td><td>水平</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Photoreceptors</td></tr><tr><td>Ntrk1</em</td><td>>Thermo Fisher Scientific</td><td>Scientific Mm01219406_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pcp4</em</td><td>>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>Bipolar, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Retinal Ganglion Cells(英語</td></tr><tr>)<td>Prdx6</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00725435_s1</td><td>アストロサイト</td></tr><tr><td>Prkcaサーモ</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエンティフィック サイエンティフィック サイMm00440858_m1</td><td>バイポーラ</td></tr><tr><td><>Prox1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>Mm00435969_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Pvalb</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00443100_m1ア</td><td>マクリン</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Retinal Ganglion Cells</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Photoreceptors</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Retinal Pigment Epithelial cells</td></tr><tr><td>Slc1a3</em</td><td>>Thermo Fisher科学</td><td>Mm00600697_m1</td><td>アストロサイト</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00433662_m1</td><td>アマクリン</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00488345_m1</td><td>網膜神経節細胞</td></tr><tr><td>Tubb3</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Mm00727586_s1</td><td>網膜神経節細胞</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml;ller 細胞</td></tr><tr><td>Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR Reagent</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA Isolation</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>Pre-Amplification step</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>固定/ 透過化バッファー</td></tr><tr><td>BD パーマ/ ウォッシュ</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>透過化ソリューション</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>細胞内抗体</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>細胞内抗体</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8429</td><td>細胞内抗体</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>細胞内抗体</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（rgcs）の単離

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

神経変性疾患は、しばしば影響を受ける人々に壊滅的な影響を与える。網膜神経節細胞（RGC）の喪失は、正常な老化に加えて、糖尿病性網膜症および緑内障を含む一連の疾患に関係している。彼らの重要性にもかかわらず、RGCは網膜内の多種多様な細胞のわずかな割合しか占めないという事実のために今まで研究することは極めて困難であった。さらに、現在の単離方法は、細胞内マーカーを使用して、非生存細胞を産生するRGCを同定する。これらの手法には長時間の分離プロトコルも含まれるため、RGCを取得して分離するための実用的で標準化された信頼できる方法が欠けています。この研究は、ポジティブおよびネガティブ選択基準に基づくプロトコールを用いて、マウス網膜から一次RGCを単離するための、効率的で包括的で信頼できる方法を記載する。提示された方法は、RGCの将来の研究を可能にし、主要な神経変性疾患における機能性RGCの喪失に起因する視力の低下。

<html> RGCの徹底的な研究は、頻度が低く、分離のための堅牢で標準化された方法論の欠如を含む多くの要因によって妨げられています。 図1は、網膜の隔離のために使用される方法論を示す。除核処置のバリエーションは、除核が生体内実験の一部である場合など、分析のタイプに基づいて存在する（ 27） 。安楽死させたマウスでこのプロトコールにおける核除去を行う。 図1A〜図1Bに示すように、鉗子を眼の下に置き、引っ張って出血を最小限に抑え、完全な視神経を有する眼球を除去する。 異なるマウス系統、特に遺伝子改変マウスにおけるRGCの数に差異が存在する23,28,29 、これらの違いを認識することは、使用するマウスの数を決定する上で重要である。古いC57BL /...

何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

本手順の全般的目的は、濃縮された均質な一次マウス網膜神経節細胞集団を単離することです。この手法は、高齢者集団や網膜変性疾患集団における視力低下の根底にあるメカニズムなど、網膜神経節細胞分野における疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、濃縮された一次マウス網膜神経節細胞の単離について、迅速で視認性が高く、再現性のある標準化されたプロトコルを提供できることです。この手法のアイデアは、当時私の研究室の大学院生であり本研究の筆頭著者であったSumana Chintalapudiが、ジャーナルクラブでKrishna Murtheadolによる2013年の論文を発表した際に得られました。その研究では、元々は不死化したラット網膜神経節細胞株として作製されたRGC five細胞株が、もはやラット由来ではなく、RGCの表現型も保持していないことが明確に示されていました。この問題により、私たちの研究室を含む視覚研究コミュニティで利用可能なリソースに大きな欠落があることが明らかになりました。そこでSumanaと私はDr. Morales-Tiradoに連絡を取り、3人で協力して、生存しており高度に濃縮されたRGCを単離するための新しい手法を開発しました。一般的に、この手法に不慣れな方は苦労することがあります。というのも、本手法の目的は、初代細胞として培養するか、あるいは細胞株として不死化させることが可能な、生存した高純度の細胞集団を単離することにあるためです。そのため、単離しようとしている細胞を損傷させないよう細心の注意を払う必要があります。さらに、細胞ソート法のパラメータは、単離しようとする特定の細胞に合わせて調整しなければなりません。どちらの手法においても特別な技術が必要です。手順の実演は、Jablonski博士の研究室のリサーチアソシエイトであるXiang Di Wang博士と、私の研究室の博士候補生であるZach Goldsmith氏が行います。眼球を摘出するには、まず眼球の下にピンセットを挿入します。視神経をつかんで上に引き上げます。これにより、視神経を保持したまま眼球を摘出できます。摘出した眼を氷上のPBSが入ったバイアルに入れ、もう片方の眼も同様に摘出します。すべての眼球を採取した後、解剖顕微鏡下で新鮮なPBSを入れたペトリ皿に眼球を1つ置き、ピンセットを用いて視神経の基部で眼球を慎重に把持します。鋭い30ゲージの針を用いて角膜を穿刺し、房水を排出させることで、ピンセットでの眼球の保持を容易にします。ピンセットで角膜を保持したまま、ハサミで角膜組織に小さな切開を加え、ピンセットを用いて角膜と強膜を慎重に剥離します。眼球を半分まで剥離させた後、ピンセットを使用して網膜と水晶体をロールアウトさせます。バイオセーフティキャビネット内で、PBSおよび1% FBSを含む小型の40 mmペトリ皿に網膜を移し、新鮮なPBSおよびFBSで網膜を3回洗浄します。すべての眼球の洗浄が完了したら、PBSとFBSで湿らせた滅菌済みの70 µmナイロンストレーナーに最大12枚の網膜を載せ、10 mLシリンジプランジャーの後端を用いて、円を描くように網膜を穏やかにすり潰します。すべての細胞を解離させた後、ストレーナーをポリプロピレン製回収チューブの上に置き、P1000ピペットを用いて細胞をストレーナーから回収チューブへとろ過します。ストレーナーをPBSおよびFBSで洗浄し、洗浄液を回収チューブにまとめます。網膜1枚あたり最終容量が1 mLになるまでPBSとFBSを加え、遠心分離によって細胞を回収します。すぐに免疫ラベル化を行う場合は、ペレットをPBSおよびFBS（5枚の網膜あたり1 mLの培地濃度）で再懸濁します。あるいは、神経細胞用培地で再懸濁した細胞を、4°Cで水平の状態のまま一晩インキュベートします。網膜細胞を免疫ラベル化するには、網膜細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットをFAXチューブ内で50 µLの新鮮なPBSおよびFBSに再懸濁します。ラベルなしのネガティブコントロール用に、5 × 10⁶個の細胞を取り分けておきます。次に、各チューブの1 × 10⁶個の細胞に対して1 µLの抗マウスCD16/32抗体を加え、室温で10分間インキュベートし、非特異的なFc受容体結合をブロックします。ブロッキング後のインキュベーションが終了したら、目的の抗体カクテルを細胞に添加し、穏やかにピペッティングして、遮光条件下で氷上にて30分間インキュベートします。その後、PBSとFBSの混合液で細胞を2回洗浄します。適切な二次抗体を用いて、遮光し氷上でさらに30分間細胞を標識し、続いて先ほど示した方法でPBSとFBSを用いて2回洗浄します。細胞数を測定するため、ペレットを新鮮なPBSとFBSに再懸濁します。補正を行うため、Floraforごとに1本の滅菌済みファルコンチューブにポリスチレン微小球を3滴加え、さらに各チューブにそれぞれのFloraforを1 µg加えます。光を遮断した室温で15分間、微小球をインキュベートします。その後、3 mLのPBSおよびFBSで微小球を洗浄し、上清を慎重に取り除きます。マイクロスフィアのペレットを250 µLのPBSおよびFBSで再懸濁し、ラベルなしのサンプルチューブをフローサイトメーターにセットします。フローサイトメーターのソフトウェアで、「experiment」、「compensation set up」を選択し、「create compensation controls」を作成します。表示されたリストからFlorafor専用のコントロールを追加し、「OK」をクリックします。前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）を確認し、初期集団をゲートします。次に、ネガティブコントロールチューブをサイトメーターにセットし、ロードをクリックします。目的の集団であるP1が表示されていることを確認し、その集団を選択してください。P1ゲートを右クリックし、コンペンセーション計算（calculate compensation）を選択します。次に、「record data」をクリックします。記録が完了したら、「unload」をクリックしてチューブを取り出し、次のコントロールチューブをロードしてコンペンセーションコントロールを調整します。すべてのコントロールサンプルの記録が完了したら、最初の実験用チューブの前方散乱光対側方散乱光プロットを作成し、P1集団をゲートします。次に、サイドスキャッター高さ（SSC-H）対サイドスキャッター幅（SSC-W）の擬似カラープロットを開き、シングルセルをゲートします。シングルセルを用いて、フォワードスキャッター高さ（FSC-H）対フォワードスキャッター幅（FSC-W）のプロットを作成し、ダブレットを除外するようにゲートします。続いて、CD48対CD90.2の擬似カラープロットを作成し、CD90.2陽性かつCD48陰性の細胞をゲートして単球を除去し、さらにCD57対CD15の擬似カラープロットを用いてアマクリン細胞の混入を除去します。次に、ソートレイアウトシートでサンプルとして回収するポピュレーションを定義し、細胞をソートします。ソート終了後、分離した細胞ポピュレーションの純度を確認するために、2.5 × 10⁴ 個の細胞分注量を使用します。細胞ストレーナーで網膜をメッシュした後、細胞分離の手順中の軸索切断により、網膜神経節細胞は特有の形態を失っていますが、多くの網膜内層細胞を可視化することが可能です。従来のdye 1陽性かつCD48陰性の表面フェノタイプだけでは、マウス網膜神経節細胞を同定および単離するには不十分であり、これらの細胞はアマクリン細胞、ミュラー細胞、双極細胞、水平細胞、光受容細胞、および網膜色素上皮細胞に関連する遺伝子を発現しているためである。分取された細胞は、synuclein gamma、BRN3A、TUJ1、RBPMSなどの網膜神経節細胞に関連する細胞内マーカーも発現しており、これらのマーカーの細胞内局在はイメージングフローサイトメトリーによってさらに確認された。分取された細胞の一部は、in vitro細胞培養後に網膜神経節細胞の形態を示し始めることさえある。さらに、高度に濃縮されたソート済み細胞集団の定量PCR解析により、網膜神経節細胞特異的な細胞内マーカーをコードする遺伝子が数倍に増加していることが明らかになります。この手法に習熟すれば、適切に実施することで6時間以内に完了させることが可能です。本手順を行う際は、細胞懸濁液の無菌状態を維持すること、抗体の非特異的結合を避けるために細胞懸濁液のFc受容体をブロックすること、そしてセルソーターのオペレーターとソートの詳細や戦略について十分に打ち合わせを行うことが重要です。この手順に従った後、遺伝子発現プロファイリングに関するさらなる疑問を解消するために、QPCRなどの他の手法を実施することができます。セルソーターのような特殊な装置の操作には、高度に専門的なオペレーターが必要であることに留意してください。この技術の開発により、視覚研究分野の研究者が網膜神経節細胞における生存および死滅のメカニズムを理解し、視覚保存のための新規治療法の開発に寄与する道が開かれました。このビデオを視聴することで、濃縮された均一なマウス一次網膜神経節細胞群を分離する方法を十分に理解することができます。

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この記事では、細かく分析し、マウスで分離された網膜の準備から記録する方法の説明を提供します。特に、我々は、蛍光標識神経節細胞集団からの光の応答を記録し、続いてその形態を特定し分析する方法について説明します。...

遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用してマウスの初代網膜神経節細胞(RGC)を単離する手順を示しています。この方法は、神経変性疾患における機能的なRGCの喪失に起因する視力の大幅な低下をよりよく理解することを目標に、RGCの将来の研究を可能にします。...

蛍光活性化細胞選別を用いたマウス網膜神経節細胞の単離

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere,  et. al.網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。...

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

ここでは、単離の前、およびその後の単一細胞転写物の特徴付けのために、ニューロン細胞タイプを分類するためのコンビナトリアルアプローチを提示する。このプロトコルは、RNAシーケンシング（RNA-Seq）のためのサンプルの調製を最適化し、細胞多様性の強化された理解のために特別に設計された方法論を記載する。...

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。...

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率に最適化されたマウス生後網膜内皮細胞の単離方法について説明しています。これらの細胞は、次世代シーケンシングアプローチに適しています。...

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。...

初代マウス網膜グリアミュラー細胞の単離

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

このプロトコルは、ホールマウントマウス網膜を単離し、免疫染色を実施してすべての網膜神経節細胞(RGC)を標識する手順を説明しています。このプロセスに続いて、AIベースのソフトウェアを使用してRGCをイメージングし、自動的にカウントし、マウス網膜全体のRGCを定量するためのシンプルで高速かつ正確な方法を提供します。...

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

この記事では、新生児Sprague-Dawley(SD)ラットから初代Retinal...

Sprague-Dawley(SD)ラットからの初代Retinal Müller細胞の単離と培養

学ぶフローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離法。高速で再現性の高い標準化プロトコルにより、網膜変性疾患の視力低下メカニズム研究に貢献します。

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

さらに動画を探す