ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

このコンピュータ支援手法の全体的な目的は、乳腺のホールマウント画像に修正Sholl解析を適用することで、げっ歯類における重要な発達指標である乳腺の分枝密度と分枝減衰を客観的に定量化することです。本手法は、化学物質への曝露が乳腺の発達にどのような影響を与えるかなど、乳腺生物学分野における疑問の解決に寄与します。この技術の主な利点は、オープンソースソフトウェアを利用して、乳腺発達の基本的特性を客観的に定量化できる点にあります。

この手順では、一定の倍率で腺上皮を示したホールマウント画像を用意してください。まず、ImageJで画像を開きます。次に、フリーハンド選択ツールを選択します。

腺上皮の周囲をトレースし、周囲の領域をクリアします。次に、リンパ節の周囲をトレースし、カットコマンドで画像からこの部分を削除します。画像の背景が黒い場合は、白に変換する必要があります。

「編集」をクリックし、「オプション」から「色」を選択します。ダイアログボックスの背景オプションのドロップダウンメニューから「白」を選択してください。背景は黒いままに見える場合がありますが、画像処理時には白として扱われます。

次に、カラーチャンネルを3つの8ビットグレースケール画像に分離します。その後、通常はブルーチャンネルとなる、最もコントラストの良いチャンネルを選択します。そして、選択したカラーチャンネルから背景を減算します。

次に、希望のパラメータを選択し、変更内容をプレビューします。ダイアログボックスで「明るい背景」にチェックを入れてプレビューを確認し、希望のコントラストが得られるまでピクセル数を調整してください。さらにコントラストを高める必要がある場合は、「アンシャープマスク」オプションを使用してください。

ダイアログボックスの「プレビュー」を確認し、希望のコントラストが得られるまでピクセル半径とマスクウェイトを調整します。アンシャープマスクフィルターを適用した後、フィルターによって作成された境界線を除去します。ツールバーにある赤い二重矢印ボタンをクリックし、「描画ツール」を選択してください。

次に、消しゴムツールを選択します。消しゴムツールボタンを右クリックして直径を調整し、マウスの左ボタンを押しながら境界線を消去します。消去中の「元に戻す（Undo）」操作は1回のみ可能ですので、注意して作業してください。

いずれかのフィルターを適用した後、残りのノイズを手動で除去します。元の画像のコピーを参照し、ツールバーにある赤い二重矢印ボタンをクリックして描画ツールを選択した後、消しゴムツールを選択して、特定したノイズを除去します。

消しゴムツールのボタンを右クリックして、直径を調整します。次に、マウスの左ボタンを押しながらノイズを消去します。消去中の取り消し（undo）は1回分しかできないため、注意して操作してください。

次に、画像のしきい値を調整します。スライダーを動かして最小および最大しきい値を調整し、腺の画像を最適化します。その後、[Apply]をクリックします。

2つの方法のいずれかを使用して、追加のノイズを自動的に除去します。1つ目のオプションはdespeckleコマンドを使用することです。2つ目のオプションはremove outliersコマンドを使用することです。

このプロセスでは、画素の値がユーザー定義のしきい値を上回って中央値から逸脱している場合にのみ、その画素を周辺の画素の中央値で置換します。次に、元の画像と比較しながら、しきい値処理およびノイズ除去によって消失した腺上皮の部分を再構築します。画像を再構築する際は、画像の完全性を維持するため、慎重に、かつ必要最小限の範囲で行ってください。

描画ツールからスプレー缶ツールを選択します。スプレー缶ツールのボタンを右クリックしてツールサイズを調整し、マウスの左ボタンを使用して腺の欠損部分を慎重に塗りつぶします。次に、Sholl解析のために、腺のスケルトン画像を作成します。

まず、画像をバイナリ形式に変換します。次に、画像のスケルトン化（細線化）を行います。これにより、バイナリ画像の端からピクセルが繰り返し除去され、最終的に幅1ピクセルの形状にまで縮小されます。

次に、しきい値処理とスケルトン化によって生じた隙間を埋めるため、画像を1回膨張させます。その後、「名前を付けて保存」コマンドを使用して、画像を新しいファイルとして保存してください。最後に、2つの画像を重ね合わせて、スケルトン画像の正確性を原本と照らし合わせて確認します。

画像の追加ダイアログボックスで骨格画像を選択し、不透明度を30%に設定します。次に、今後の参照のためにオーバーレイを新しい画像として保存します。まず、骨格画像を開き、画像をバイナリ形式に変換します。続いて、画像のスケールを定義します。

1ミリメートルあたりのピクセル数を入力し、既知の距離とピクセルアスペクト比をともに1に設定します。次に、長さの単位にミリメートルを入力し、グローバルオプションを切り替えてすべての画像にスケールを適用します。続いて、直線描画ツールを使用して、Sholl解析の終了半径を決定します。主管の開始点から腺上皮の最遠点まで線を引きます。

次にMキーを押すと、線の距離が表示されます。ここで、Sholl解析の設定を入力します。まず、「definition of shells」セクションでオプションを選択し、開始半径（starting radius）を0.00 millimetersに、半径ステップサイズ（radius step size）を0.1 millimetersに設定します。

サンプル数を1に設定します。直前に描いた線の長さが、終了半径フィールドに自動的に入力されます。半径あたりの複数サンプルオプションでは、積分に平均値を選択します。

記述子および曲線フィッティングのオプションにおいて、包含半径カットオフを1に設定します。一次分岐数には「開始半径から推測」を選択し、線形および最適フィッティング次数のオプションを選択してください。次に、「正規化なしのプロファイル」の下で、「最も情報量が多い」を選択します。

次に、Sholl解析メソッドのセクションで、正規化プロファイルに使用する領域を選択します。最後に、出力セクションで「交差マスクを作成」を選択し、交差箇所のヒートマップを作成します。ここで、リングが表示された画像のプレビューウィンドウを開き、解析領域を確認してください。

すべてに問題がなければ、「okay」をクリックして解析を実行します。解析を実行すると、Shollプロファイルの線形ウィンドウ、Shollプロファイルの片対数ウィンドウ、およびすべてのSholl出力値を含むSholl結果ウィンドウと、多項式によって決定された各半径における交点数を示すファイル名Shollプロファイルウィンドウが作成されます。MEAを測定するには、ImageJで腺のスケルトン画像を用いて作業を行います。

ポリゴンツールを開き、腺の周囲を囲むようにポリゴンを描画します。マウスでクリックして線分を追加してください。上皮領域全体を囲み終えたら、ダブルクリックしてポリゴンを閉じます。

次に、Mキーを押して結果ウィンドウを開きます。「area」列の値がMEAに対応します。腺上皮がリンパ節を超えて伸展している場合は、分枝密度を計算する際に、MEAからリンパ節の面積を差し引いてください。

リンパ節領域は、MEAと同様の方法で測定できます。上述した方法を用いて、年齢を一致させた2群のラットを解析しました。グループBの動物には、乳腺の早熟な発達を引き起こすことが知られている化学物質を投与しました。

腺からの半径に沿った分枝交差点数をプロットすることで、結果のばらつきを視覚化します。ショル解析（sholl analysis）の結果から、群間で平均交差点数に明確な差があることが明らかになりました。ただし、結論を導き出すには、交差点データを乳腺の面積で正規化する必要があります。

ショル解析および乳腺上皮領域の測定により、比較解析に有用な2つの生理学的パラメータが得られます。明らかに、処理群では腺のサイズが大幅に大きくなっていました。ショル解析ではSum Nの値が得られ、これを用いて分枝密度およびkの値を算出します。

処置群において、平均分岐密度が高く、分岐減衰率の低さを反映する平均値kが低いことは、処置した動物が未処置の動物よりも腺が十分に発達していたことを示しています。この手順を行う際は、ノイズの除去が最も重要なステップであることを忘れないでください。除去しすぎても少なすぎても、腺の完全性が損なわれ、結果に偏りが生じる可能性があります。

本手法を利用する際は、汚れのない乳腺全体の組織標本から開始することが重要です。破れや折り畳みなどの不備がある場合、正確なスケルトン化画像を得ることはできません。正確なスケルトン化画像を作成するには、忍耐と練習が必要です。

適切に実施すれば、この手法を習得した後、解析する腺1つにつき15〜20分で完了させることができます。