Name: ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶ ショール分析法を用いたラット乳腺全身マウント画像の分枝密度と分枝減衰の定量的評価法。ImageJを活用し、乳腺発達の客観的な指標を測定する信頼性の高い手法を習得できます。

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著者らは、この方法とTiago Ferreira博士（McGill University、カナダ、ケベック州モントリオール）の継続的な成功のために、Michael Islingling博士（ノースカロライナ州ダーラム）を認めたいと思っています。 Shollアプリケーションのサポート。

<ol><li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+of+the+neurons+in+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+receptor+1A+modulates+actin+dynamics+and+restricts+dendritic+growth+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).</li>
<li>Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Sholl+analysis+to+quantify+changes+in+growth+and+development+in+rat+mammary+gland+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts.</a> Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).</li>
<li>Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Mammary+Gland+Morphology+and+Breast+Cancer+Risk+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats.</a> J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Sholl_Analysis">http://imagej.net/Sholl_Analysis</a> (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2012).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+High-quality+Hematoxylin+and+Eosin-stained+Sections+from+Rodent+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Histopathologic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+abnormalities+in+the+rat+mammary+gland+following+gestational+and+lactational+exposure+to+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+%28TCDD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD).</a> Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).</li>
<li>Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+gland+ductal+hyperplasias+and+carcinoma+in+situ+following+fetal+bisphenol+A+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure.</a> Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).</li>
<li>Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+exposure+to+butyl+benzyl+phthalate+induces+modifications+in+the+morphology+and+the+gene+expression+profile+of+the+mammary+gland%3A+an+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats.</a> Environ Health. 10 (1), 5(2011).</li>
<li>Johnson, M. D., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+multiphoton+imaging+of+fresh+and+whole+mount+developing+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands.</a> BMC Cancer. 13, 373(2013).</li>
<li>Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development+as+a+sensitive+end+point+after+acute+prenatal+exposure+to+an+atrazine+metabolite+mixture+in+female+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats.</a> Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).</li>
<li>Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+mammary+gland+development+in+female+Long+Evans+rats+following+in+utero+exposure+to+atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine.</a> Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).</li>
<li>Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+ethinyl+oestradiol+alters+mammary+gland+development+in+male+and+female+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Inter+J+of+Androl%22%5BJournal%5D)">Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats.</a> Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

出産から思春期まで、乳腺の成長はアロマティックである。思春期後、乳腺は、乳腺上皮が脂肪パッド全体を占有するまで、広範な管分岐および伸長を経て発達する。分枝特性は乳腺発達の重要な側面であり、これらの特性を客観的に定量化する能力は、乳房の正常な発育を評価し、乳房毒性物質への早期曝露後の異常な発達を同定するために非常に有用であり得る。 形態学的特徴の採点、基本的な寸法測定の定量化、および乳房構造の計数は、乳腺発達を評価するための典型的な方法である。しかしながら、これらの方法は、げっ歯類の乳腺の大きさおよび形状のかなりの変動のために特に敏感ではなく、経験の浅い評価者にとっては発生の解釈が困難であり得る。さらに、適切に盲検されていない研究に偏見が存在する。 Sholl分析法は、乳腺上皮の分枝密度および分枝の複雑さ、乳腺発達の離散形態学的特徴を正確に定量化するための効率的なプロトコルを提供し、研究および実験室間で容易に比較することができる。 このプロトコルのいくつかのセクションには重要なステップがあります。最初の最も重要なのは、乳腺全身の...

乳腺分枝は、一般に腺発生の指標として評価される特性であるが、客観的に定量化することは困難である。 1953年にSholl 1は、猫の視覚および運動皮質におけるニューロンの樹状突起形成を測定する方法を記載し、この技術のためのプラグインはFerriera らによって開発された2 。ニューロンと乳腺の両方が類似の樹状構造を示すため、このプラグインを用いて、周辺期ラット乳腺の2D画像における乳房上皮分岐密度を定量化した。周産期は、離乳は生涯の段階であるため、分析のために選択されました。これは、多くの場合、学術機関や試験ガイドラインの研究で評価されています。 Sholl分析は、FIJIと共に配布されているプラ​​グインです。これはオープンソースの画像処理パッケージImageJで、追加のプラグインが含まれています。プラグインはpredefを囲む一連の同心リングを作成します（典型的には、ニューロンの体細胞または乳腺の主ダクトの起源）を対象とし、対象物の最遠位部分（包囲半径）まで伸びる。次に、各リング上に発生する交差点の数（N）を数えます。また、プラグインはSholl回帰係数（ k ）を返します。これは上皮分岐の減衰率の測定値です。 ImageJを使用して、乳腺全身の骨格化画像が作成され、乳房上皮領域（MEA）が測定される。 Sholl分析プラグインを使用して画像が分析され、ここでは利用されない他の値のうちNとkの値が返されます。乳腺上皮分枝密度は、N / MEAを計算することによって決定される。腺上皮の外側領域で分枝が継続する程度は分枝の複雑さであり、均一な遠位上皮成長の指標である。 kはエピソードにおける遠位減少の尺度であるのでこれは分枝の複雑さと乳房発達の信頼できる指標の有効な尺度である。 このプロトコルは、乳腺全身マウントの骨格化画像を作成し、周辺性雄性および雌性ラットにおける乳房分枝特性を定量的に評価するコンピュータ支援法を記載する。この方法は比較的迅速であり、特別な顕微鏡検査装置の使用を必要としない。この方法の開発および検証はStanko et al。 （2015） 3 。この報告書はまた、ラット乳腺全体=マウントの調製を記載している。同様の哺乳類全体マウント手順が、アシス（Assis） らに記載されている。 （2010） 4およびPlante et al。 （2011） 5 。

<table><tbody><tr><td>解剖ボード</td><td>NA</td><td>NA</td><td>発泡スチロール片は、およそ10インチx12インチが適しています。</td></tr>T-Pins Daigger EF7419A <tr>Spray bottle with ethanol <td>NA</td><td></td><td>NA 70% ethanol is suitly.</td> T-Pins Daigger Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suit.(T-Pins Daigger I<td></td> Spray Bottle with ethanol NA NA 70% ethanol.)</tr>の<tr><td>解剖</td><td></td><td></td>に適しています。<td></td></tr><tr><td>湾曲解剖ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14569-09</td><td></td></tr><tr><td>ストレート解剖ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11003-12</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス 24 x 75 x 1 mm 顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4951PLUS-001</td><td>Thermo Scientific Superfrost Plus &Colorfrost Plusスライドは、IHCおよび解剖学的病理学アプリケーションで高価なコーティングを必要とせずに、組織切片を永久に保持します。この処理により、染色中やスライド調製に要する時間間の組織損失が減少します。スライドは、凍結組織切片や細胞診調製物を静電的に引き付け、シランと同様の化学的性質を特徴としていますが、アプリケーションのパフォーマンスを向上させるために最適化されています。 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherfinestプレミアムカバーガラス24 x 60 x 1 mm</td><td>フィッシャー科学</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>ビーミスパラフィルムM実験室ラッピングフィルム</td><td>フィッシャー科学</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対、&ge;99.8% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>カーマイン製ミョウバン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アルミニウムカリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6435</td><td></td></tr><tr><td>パーマウント封入剤</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15</td><td></td></tr><tr><td>Macroscope</td><td>Leica</td><td>Z16 APO&nbsp;</td><td>これが、この研究室で使用している画像キャプチャハードウェアとソフトウェアです。&nbsp;さまざまな選択肢があるため、方法や用途は研究室によって異なる場合があります。</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>Leica</td><td>DFC295</td><td></td></tr><tr><td>カメラソフトウェア</td><td>Leica</td><td>Leica Application Suite v3.1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>オープンソース</td><td>http://imagej.net/Welcome</td><td></td></tr><tr><td>Sholl analysis&nbsp;</td><td>オープンソース</td><td>http://imagej.net/Sholl_Analysis</td><td></td></tr></tbody></table>

ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

げっ歯類の乳腺を化学暴露の発生毒性を評価するためのエンドポイントとして利用する研究が増えています。これらの曝露が乳腺発達に及ぼす影響は、典型的には、基本的な寸法測定または形態学的特徴の採点によって評価される。しかし、発達の変化を解釈するための幅広い方法は、研究所間で一貫性のない翻訳につながる可能性があります。研究を通して比較されるデータから適切な解釈が形成されるように、一般的な評価方法が必要です。本研究は、乳腺の分岐特性を定量化するSholl分析法の応用を記載している。 Sholl法はもともとニューロンの樹状パターンの定量化に使用するために開発されました。オープンソースの画像解析ソフトウェアパッケージであるImageJと、この解析用に開発されたプラグインを使用することにより、乳腺分枝密度とam周産期の雌ラットの臍帯腺を決定した。ここに記載されている方法は、Sholl分析を乳腺発達の重要な特徴を定量化するための有効なツールとして使用することを可能にする。

このプロトコールで分析した乳腺の測定された封入半径、MEA、N、 kおよび計算された分枝密度の値を表1に報告する。 Sholl解析では、各半径（ 図9 ）および交差点のヒートマップ（選択されている場合）の交点数の線形および半対数プロットが生成されます（ 図10 ）。あまり発達していない腺は、同じMEA内でより少ない交叉を示し、したがってより低い分岐密度を有する。十分に発達した腺は、特に遠位領域において、腺上皮全体に均一に分枝し続けるであろう。これらの領域で分岐が継続する程度は、分岐の複雑さと複雑さの減少が減衰率（またはSholl回帰係数、 k ）として伝達されるために説明できます。崩壊の速度は、遠位上皮ブラの変化を反映する狭窄し、包囲半径（ すなわち、上皮の縦方向成長）に対してプロットされた交差点の数の線の傾きとして測定される。したがって、Sholl回帰係数は、対数（...

げっ歯類における乳腺発達は、典型的には、記述的評価または基本的物理的属性の測定によって評価されている。分枝密度は、客観的に定量することが困難な哺乳類の発達の指標である。このプロトコールは、乳腺分枝特性の定量的評価のための信頼できる方法を記載している。

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

このコンピュータ支援手法の全体的な目的は、乳腺のホールマウント画像に修正Sholl解析を適用することで、げっ歯類における重要な発達指標である乳腺の分枝密度と分枝減衰を客観的に定量化することです。本手法は、化学物質への曝露が乳腺の発達にどのような影響を与えるかなど、乳腺生物学分野における疑問の解決に寄与します。この技術の主な利点は、オープンソースソフトウェアを利用して、乳腺発達の基本的特性を客観的に定量化できる点にあります。この手順では、一定の倍率で腺上皮を示したホールマウント画像を用意してください。まず、ImageJで画像を開きます。次に、フリーハンド選択ツールを選択します。腺上皮の周囲をトレースし、周囲の領域をクリアします。次に、リンパ節の周囲をトレースし、カットコマンドで画像からこの部分を削除します。画像の背景が黒い場合は、白に変換する必要があります。「編集」をクリックし、「オプション」から「色」を選択します。ダイアログボックスの背景オプションのドロップダウンメニューから「白」を選択してください。背景は黒いままに見える場合がありますが、画像処理時には白として扱われます。次に、カラーチャンネルを3つの8ビットグレースケール画像に分離します。その後、通常はブルーチャンネルとなる、最もコントラストの良いチャンネルを選択します。そして、選択したカラーチャンネルから背景を減算します。次に、希望のパラメータを選択し、変更内容をプレビューします。ダイアログボックスで「明るい背景」にチェックを入れてプレビューを確認し、希望のコントラストが得られるまでピクセル数を調整してください。さらにコントラストを高める必要がある場合は、「アンシャープマスク」オプションを使用してください。ダイアログボックスの「プレビュー」を確認し、希望のコントラストが得られるまでピクセル半径とマスクウェイトを調整します。アンシャープマスクフィルターを適用した後、フィルターによって作成された境界線を除去します。ツールバーにある赤い二重矢印ボタンをクリックし、「描画ツール」を選択してください。次に、消しゴムツールを選択します。消しゴムツールボタンを右クリックして直径を調整し、マウスの左ボタンを押しながら境界線を消去します。消去中の「元に戻す（Undo）」操作は1回のみ可能ですので、注意して作業してください。いずれかのフィルターを適用した後、残りのノイズを手動で除去します。元の画像のコピーを参照し、ツールバーにある赤い二重矢印ボタンをクリックして描画ツールを選択した後、消しゴムツールを選択して、特定したノイズを除去します。消しゴムツールのボタンを右クリックして、直径を調整します。次に、マウスの左ボタンを押しながらノイズを消去します。消去中の取り消し（undo）は1回分しかできないため、注意して操作してください。次に、画像のしきい値を調整します。スライダーを動かして最小および最大しきい値を調整し、腺の画像を最適化します。その後、[Apply]をクリックします。2つの方法のいずれかを使用して、追加のノイズを自動的に除去します。1つ目のオプションはdespeckleコマンドを使用することです。2つ目のオプションはremove outliersコマンドを使用することです。このプロセスでは、画素の値がユーザー定義のしきい値を上回って中央値から逸脱している場合にのみ、その画素を周辺の画素の中央値で置換します。次に、元の画像と比較しながら、しきい値処理およびノイズ除去によって消失した腺上皮の部分を再構築します。画像を再構築する際は、画像の完全性を維持するため、慎重に、かつ必要最小限の範囲で行ってください。描画ツールからスプレー缶ツールを選択します。スプレー缶ツールのボタンを右クリックしてツールサイズを調整し、マウスの左ボタンを使用して腺の欠損部分を慎重に塗りつぶします。次に、Sholl解析のために、腺のスケルトン画像を作成します。まず、画像をバイナリ形式に変換します。次に、画像のスケルトン化（細線化）を行います。これにより、バイナリ画像の端からピクセルが繰り返し除去され、最終的に幅1ピクセルの形状にまで縮小されます。次に、しきい値処理とスケルトン化によって生じた隙間を埋めるため、画像を1回膨張させます。その後、「名前を付けて保存」コマンドを使用して、画像を新しいファイルとして保存してください。最後に、2つの画像を重ね合わせて、スケルトン画像の正確性を原本と照らし合わせて確認します。画像の追加ダイアログボックスで骨格画像を選択し、不透明度を30%に設定します。次に、今後の参照のためにオーバーレイを新しい画像として保存します。まず、骨格画像を開き、画像をバイナリ形式に変換します。続いて、画像のスケールを定義します。1ミリメートルあたりのピクセル数を入力し、既知の距離とピクセルアスペクト比をともに1に設定します。次に、長さの単位にミリメートルを入力し、グローバルオプションを切り替えてすべての画像にスケールを適用します。続いて、直線描画ツールを使用して、Sholl解析の終了半径を決定します。主管の開始点から腺上皮の最遠点まで線を引きます。次にMキーを押すと、線の距離が表示されます。ここで、Sholl解析の設定を入力します。まず、「definition of shells」セクションでオプションを選択し、開始半径（starting radius）を0.00 millimetersに、半径ステップサイズ（radius step size）を0.1 millimetersに設定します。サンプル数を1に設定します。直前に描いた線の長さが、終了半径フィールドに自動的に入力されます。半径あたりの複数サンプルオプションでは、積分に平均値を選択します。記述子および曲線フィッティングのオプションにおいて、包含半径カットオフを1に設定します。一次分岐数には「開始半径から推測」を選択し、線形および最適フィッティング次数のオプションを選択してください。次に、「正規化なしのプロファイル」の下で、「最も情報量が多い」を選択します。次に、Sholl解析メソッドのセクションで、正規化プロファイルに使用する領域を選択します。最後に、出力セクションで「交差マスクを作成」を選択し、交差箇所のヒートマップを作成します。ここで、リングが表示された画像のプレビューウィンドウを開き、解析領域を確認してください。すべてに問題がなければ、「okay」をクリックして解析を実行します。解析を実行すると、Shollプロファイルの線形ウィンドウ、Shollプロファイルの片対数ウィンドウ、およびすべてのSholl出力値を含むSholl結果ウィンドウと、多項式によって決定された各半径における交点数を示すファイル名Shollプロファイルウィンドウが作成されます。MEAを測定するには、ImageJで腺のスケルトン画像を用いて作業を行います。ポリゴンツールを開き、腺の周囲を囲むようにポリゴンを描画します。マウスでクリックして線分を追加してください。上皮領域全体を囲み終えたら、ダブルクリックしてポリゴンを閉じます。次に、Mキーを押して結果ウィンドウを開きます。「area」列の値がMEAに対応します。腺上皮がリンパ節を超えて伸展している場合は、分枝密度を計算する際に、MEAからリンパ節の面積を差し引いてください。リンパ節領域は、MEAと同様の方法で測定できます。上述した方法を用いて、年齢を一致させた2群のラットを解析しました。グループBの動物には、乳腺の早熟な発達を引き起こすことが知られている化学物質を投与しました。腺からの半径に沿った分枝交差点数をプロットすることで、結果のばらつきを視覚化します。ショル解析（sholl analysis）の結果から、群間で平均交差点数に明確な差があることが明らかになりました。ただし、結論を導き出すには、交差点データを乳腺の面積で正規化する必要があります。ショル解析および乳腺上皮領域の測定により、比較解析に有用な2つの生理学的パラメータが得られます。明らかに、処理群では腺のサイズが大幅に大きくなっていました。ショル解析ではSum Nの値が得られ、これを用いて分枝密度およびkの値を算出します。処置群において、平均分岐密度が高く、分岐減衰率の低さを反映する平均値kが低いことは、処置した動物が未処置の動物よりも腺が十分に発達していたことを示しています。この手順を行う際は、ノイズの除去が最も重要なステップであることを忘れないでください。除去しすぎても少なすぎても、腺の完全性が損なわれ、結果に偏りが生じる可能性があります。本手法を利用する際は、汚れのない乳腺全体の組織標本から開始することが重要です。破れや折り畳みなどの不備がある場合、正確なスケルトン化画像を得ることはできません。正確なスケルトン化画像を作成するには、忍耐と練習が必要です。適切に実施すれば、この手法を習得した後、解析する腺1つにつき15〜20分で完了させることができます。

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Developmental Biology

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