MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

この手順の全体的な目標は、初期の結晶化スクリーニング条件から高品質の結晶を生成することです。結晶は、タンパク質、DNA、RNA、およびそれらの複合体の構造を研究するために使用できます。高分子構造に関する何かがますます困難になっています。

また、さまざまな初期条件を提供することで、有用な結晶の収率を向上させると同時に、サンプルと結晶の最適化の必要性を減らすことができます。2つの完全自動化システム、LMBは、ナノリットルの液滴で最大1, 920の蒸気拡散実験の準備を容易にします。簡潔にするために、ユーザーはすでにナノリットルディスペンサー、インクジェットプリンター、および粘着プレートシーラーの基本機能とメンテナンスに精通していることを前提としています。

手順を実行する前に、システムのロボットが初期化され、その制御ソフトウェアが開いていることを確認してください。メインプログラムが開始される約30分前に、チューブ冷却キャリアのチラーをオンにします。プレートシーラーの電動SBSキャリアにテストプレートを置きます。

プレートシーラーを実行し、フィルムが正しく塗布されていることを確認します。このテストをさらに2回繰り返して、プレートシーラーの準備ができていることを確認します。次に、20リットルの脱イオン水をリキッドハンドラーのメインコンテナに追加します。

カップリングインサートを20%エタノールリンス溶液の小さい方の容器から切り離し、インサートをメインコンテナに接続します。インクジェットプリンターのタッチスクリーンに適切な画面名を入力します。次に、カルーセルのドアを開閉して、カルーセルの回転をトリガーします。

最初のスタックが表示されたらドアを開けます。最初のスタックに22枚の晶析プレートをフルロードし、各カラム1を外側に向けています。同じ方法で、次の 2 つのスタックを完全にロードします。

残りの6枚のプレートを4番目のスタックの最も高い位置にセットし、カルーセルドアを閉じます。チラーディスプレイが摂氏14度を示していることを確認します。選択したスクリーニングキットを1分間、穏やかに繰り返し反転させます。

次に、リキッドハンドラーのフロントパネルを開きます。チューブを開き、標準の96ウェルレイアウトで冷却キャリアに入れます。各チューブをキャリアに置いたら、蓋を同じ96ウェルレイアウトでトレイに置きます。

システム1を使用する場合、ラベルリードは96ウェルレイアウトのトレイに配置され、チューブが正しく配置されていることをクロスチェックできます。チューブの位置をクロスチェックし、すべてのチューブが水平でキャリアに落ち着いていることを確認します。次に、フロントパネルを閉じます。

リキッドハンドラーソフトウェアのスタートアップウィンドウで、[メンテナンスの実行]を選択し、フラッシングプログラムを開きます。プログラムを実行して、システムから20%のエタノールを洗い流し、液体ディスペンシングチップの外側を洗浄します。フラッシュが完了したら、[キャンセル] をクリックして [スタートアップ] に戻ります。

「既存のプロセスを実行」を選択し、「選択を開始」をクリックします。MRCキットディスペンスプログラムを開きます。構成画面のインスタンスに18インチを記入し、プログラムを実行し、最初の4つのプレートがラベル付けされ、充填され、密封されているときにシステムを監視します。

最初の4枚のプレートの準備が完了するまで、システムを放置しないでください。72枚のプレートがすべて準備され、カルーセルに戻ったら、カップリングインサートを脱イオン水容器から20%エタノール容器に交換します。スタートアップフラッシュプログラムは、以前と同じプロセスで実行します。

チラーの電源を切り、空のスクリーニングキットチューブを廃棄します。準備した72枚のプレートをカルーセルから慎重に取り外します。誤って充填されたプレートまたは密封が不十分なプレートを廃棄します。

すぐに使用できるプレートは摂氏10度で保管してください。まず、システムのロボットがオンになっていること、ナノリットルディスペンサーがソフトウェアを開いた状態で初期化されていること、およびリキッドハンドラーのメソッドマネージャーが開いていることを確認します。メインプログラムが開始される約15分前に、マイクロチューブ冷却キャリアの電源を入れます。

プレートシーラーの電動SBSキャリアにテストプレートを置きます。プレートシーラーを実行し、プレートが適切にシールされていることを確認します。プレートシーラーを3回テストします。

次に、ナノリットルディスペンサーを実行して、テストプレートに100ナノリットルの試験液滴をセットします。ここに示されているのは、ナノリットルディスペンサーによって生成された100ナノリットルの液滴の光顕微鏡写真であり、赤色の染料で作られた試験溶液です。ナノリットルディスペンサーソフトウェアを閉じ、ストリップホルダーブロックをデッキから取り外します。

次に、カスタム設計のプレートホルダーにセットし、その条件で揮発性試薬の相対量が最も多い充填済みの96ウェル結晶化プレートをセットします。プレートから粘着フィルムをはがします。リキッドハンドラーのフロントパネルを開き、密封されていないプレートを最初のスライドキャリアの背面にあるデッキに置きます。

プレートをSBSアルミニウム製の蓋で覆います。蓋の反対側の角に穏やかな圧力を加えて、蓋をキャリアの左後隅に向かって固定します。System 2 を使用する場合は、揮発性試薬を大量に含むスクリーニングキットを最初に処理する必要があります。

これにより、SBSリード線に結露が発生し、リード線の自動ハンドリングやプレートシールに影響を与える可能性があります。シールを開封し、スライド式キャリアに装填し、残りの19枚のプレートを同じ方法で覆い、揮発性の高い状態から最も低い状態まで作業します。マイクロチューブ冷却キャリアが緑色のライトで示されるように摂氏4度になったら、カバーを取り外します。

少なくとも440マイクロリットルのタンパク質サンプルが入ったマイクロチューブの蓋を切り取ります。サンプルのメニスカスの上に泡がないことを確認してください。これは液体検出システムに干渉するためです。チューブをマイクロチューブ冷却キャリアの位置1に配置します。

PCRプレートをリキッドハンドラーデッキのプレート移動アダプターキャリアの前のに置きます。次に、フロントパネルを閉じます。リキッドハンドラーメソッド管理インターフェースで、「プレートのセットアップ」を選択します。

両方のシステムの初期化を監視し、プレートタイプと各条件の液滴数、液滴サイズ、処理する最初のプレートの位置、プレート数などの実行パラメーターを入力します。デッキのロードについてサポートが必要かどうか尋ねられたら、[いいえ]をクリックします。空のチップラックがないことを確認したら、[OK]をクリックします。実行のヒントが十分にあることを確認したら、[OK] をクリックします。必要に応じて、チップ管理システムを更新し、[OK] をクリックします。ナノリットルのディスペンサーデッキがストリップホルダーブロックから離れていること、およびキャリアが50マイクロリットルのチップスタックの後ろにあり、アルミニウムSBSの蓋が離れていることを確認してください。

他のすべての必要なコンポーネントの準備ができていることを再確認してから、プロセスを開始します。ナノリットルディスペンサーが最初のプレートに液滴をセットし、その後プレートシーラーがプレートをシールする間、システムを監視します。最初のプレートの準備が完了するまで、システムを放置しないでください。

20枚のプレートすべてに結晶化液滴が準備され、自動的にスライドキャリアに戻ったら、フロントパネルを開き、プレートを静かに取り外します。結晶化のためにプレートを保管する前に、プレートが正しく密封されていることを確認してください。SBSの蓋を20%エタノール溶液で洗浄してから、リキッドハンドラーの左側に積み重ねて保管します。

PCRプレートとマイクロチューブを廃棄します。マイクロチューブ冷却キャリアの電源を切り、結露を拭き取ります。クーラー面の上にペーパータオルを置いて、さらなる結露を吸収します。

次に、キャリアカバーを元に戻し、フロントパネルを閉じます。OmpFおよびMreBは、最初にこれらの完全に自動化されたプロトコルを使用してスクリーニングされました。X線回折に十分な品質のOmpF結晶がLMB 7プレートの井戸A4で発見されました。

MreBの回折品質の結晶は、LMB 20プレートの井戸D12で発見されました。プレフューエルプレートを10°Cで保管することは、結晶化条件の悪化や結露に関連する問題を引き起こす可能性のある凍結と4°Cでの保管を避けるための妥協点です。この方法で保管すると、プレートは4〜5か月以内に使用できます。

4 から 8, 000 LMB プレートがシステム 1 で毎年製造され、後で初期スクリーニングに使用されます。プロトコルは、予想される売上高がはるかに低い場合に、異なる方法で最適化する必要があります。当社のプレフューエルプレートの全セットは、通常、新規サンプルの大型初期スクリーニングとして使用されます。

ただし、多くの特定のサンプル要件に対して選択できるプレートは少なくなります。液滴を調製した後、プレートは4°Cまたは18°Cに厳密に制御された温度で低振動の棚に保管されます。実験はスクロール光源顕微鏡で評価します。

結晶の性質を慎重に調査した後、LMBやC6 Screenデータベースなどのウェブベースのツールを使用して、条件間の形質と類似性を分析できます。その後の結晶化条件の最適化は、まだ必要かもしれません。4コーナー法と添加剤スクリーニングによる追加の自動化プロトコルは、当社の原稿に記載されています。