Name: MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶ自動化された蒸気拡散結晶化法により、タンパク質・DNA・RNA複合体の高品質結晶を効率的に調製する手法です。ナノリットル液滴を用いて最大1,920の実験を自動化し、構造生物学研究を加速します。

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MRC LMB 結晶化設備は、医学研究議会 (イギリス) によってサポートされている親切です。我々 は彼らのサポートの LMB のメンバーに感謝: オルガ Perisic (PNAC)、トニー · ウォーン、Fusinita ・ ヴァン ・ デン耳鼻咽喉科とパット ・ エドワーズ (構造学)、スティーブ ・ Scotcher と他のメンバー機械研修会のニール グラントそしてジョー ウェストモーランド (視覚効果)、ポール ・ ハートとトム(IT) プラット。我々 はまたステファンズにジョージとドナルド Ogg (Alphabiotech、スティーブ ・ エリオット (Tecan、英国)、ミッチェル スチュアートとヘザー Ringrose (ハミルトン ロボット、イギリス)、ポール雪解け、ロバート ・ ルイスと Joby ジェンキンス (TTP Labtech、英国)、ポール · リアドン (Swissci AG、スイス連邦共和国) に感謝したいと思います英国)、ニール ・ ウィリアムズ (Markem Imaje、英国)、グラハム ・ ハリス (クリーブランド庁) 技術的なヘルプ。

1. 2 つの完全自動システム (第一次選考)
<ol><li>
システム 1: 72 96 ウェルの結晶化プレートの準備はスクリーニング キット (LMB 板) でいっぱい
	<ol>
<li>手順を実行する前にシステムのロボットが初期化され、制御ソフトウェアが開いていることを確認します。チラー チューブ冷却キャリアのメイン プログラムが開始する前に約 30 分を入れます。</li>
		<li>プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアのテスト プレートを配置します。プレート シーラーを実行し、フィルムが正しく適用されることを確認します。プレート シーラーが準備ができていることを確認する 2 回以上このテストを繰り返します。</li>
		<li>20 L の脱イオン水を液体ハンドラーのメイン コンテナーに追加します。小さなコンテナー (20% エタノールの解決の洗浄) からカップリング挿入を外し、メインのコンテナーに挿入を接続します。</li>
		<li>インク ジェット プリンターのタッチ スクリーンに適切なスクリーン名 (表 1) を入力します。開くし、カルーセルの回転をトリガーするカルーセル ドアを閉じます。最初のスタックがそれ自身を示すときは、ドアを開きます。</li>
		<li>22 の結晶化プレートをそれぞれ 1 列向きを持つ最初のスタックは完全に読み込むをします。完全に同じ方法で次の 2 つのスタックをロードします。</li>
		<li>4 番目のスタックの最も高い位置で残り 6 プレートをロードします。カルーセルのドアを閉じます。</li>
		<li>冷凍機の表示は 14 ° c. を示すことを確認します。ゆっくりと繰り返し 1 分選択したスクリーニング キットを反転します。次に、液体ハンドラーのフロント パネルを開きます。</li>
		<li>管を開き、標準の 96 ウェル レイアウト(A1、A2)によると冷却キャリア内に配置します。各管に配置するとキャリアで、同じ 96 ウェル レイアウト トレイにその蓋を配置します。</li>
		<li>クロス チェック チューブ位置し、すべてのチューブが、レベルでキャリアに定住しました。フロント パネルを閉じます。</li>
		<li>液体ハンドラー ソフトウェアの 'スタートアップ' ウィンドウで '実行メンテナンス' を選択し、フラッシュのプログラムを開きます。液体分注チップの外側を洗浄するシステムから 20% エタノールをフラッシュするプログラムを実行します。</li>
		<li>フラッシュが完了すると、「スタートアップ」に戻るには、[キャンセル] をクリックします。'既存のプロセスの実行'、'あなたの選択を開始' をクリックします。「MRC キット調剤' プログラムをを開きます。入力 '18' 'インスタンス' 構成の画面し、プログラムを実行します。</li>
		<li>最初の 4 つのプレート、ラベル、いっぱい、密封システムを監視します。</li>
		<li>すべて 72 プレートを準備し、カルーセルで再配置するは、小さな容器に主なコンテナーからカップリング挿入を切り替えます。'フラッシュを開始' プログラムを実行 (手順 1.1.10 参照)。</li>
		<li>チを切り、空を破棄スクリーニング キット チューブ。カルーセルから 72 準備板を慎重に取り外します。誤って充填が不十分な密閉型またはプレートを破棄します。10 ° c. ですぐに使用できるプレートを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
システム 2: 設定の 20 LMB プレートの 1 つのサンプルから結晶化液滴 (100 nL タンパク質 + 100 nL 条件)
	<ol>
<li>まず、システムのロボットが、ナノリッター ディスペンサーは、オープン ソフトウェアで初期化されます、液体ハンドラーのメソッド マネージャーが開いていることを確認します。チューブ冷却キャリアをオンに、メイン プログラムが開始する前に約 15 分。</li>
		<li>プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアのテスト プレートを配置します。プレート シーラーを実行し、プレートを適切にシールされていることを確認します。テスト プレート シーラー 3 回。</li>
		<li>ナノリッター ディスペンサー テスト プレートで試験溶液の 100 nL 液滴を設定するを実行します。顕微鏡下で水滴が正しく設定されていることを確認します。ナノリットル ディスペンサー ソフトウェアを閉じて、デッキからストリップ ホルダー ・ ブロックを削除します。</li>
		<li>次に、カスタム デザインのプレート ホルダーに挿入 (代表の結果を参照してください: 結晶デバイス開発、LMB) 条件 (表 1) 揮発性試薬の最高の相対量を用いた LMB プレート。プレートから粘着フィルムを削除します。</li>
		<li>液体ハンドラーの前面パネルを開き、最初のスライド キャリアの後ろのデッキで封印されていないプレートを置き (スライド キャリアが引き出されるアクセスの容易さのため)。</li>
		<li>カバー、SBS アルミ蓋付きプレート。キャリアの後部の左上隅に向かって蓋を蓋の反対側の角に穏やかな圧力を適用することによって解決します。</li>
		<li>開封、スライド キャリアに読み込む作業から最も少なく揮発性の条件を同じ方法で残りの 19 のプレートをカバーします。マイクロ チューブ冷却キャリアが 4 ° c と緑色のライトによって示されるように、カバーを外します。</li>
		<li>蛋白質のサンプル (表 2) の (少なくとも) 440 μ L を含むマイクロ チューブの蓋をカットします。この液体検知システムの妨げとなりますのでサンプルには、メニスカスの上の泡はありませんを確認します。マイクロ チューブ冷却キャリアの位置 1 にチューブを置きます。</li>
		<li>プレート移動アダプター キャリアの前に液体ハンドラー デッキに PCR プレートを配置します。フロント パネルを閉じます。</li>
		<li>デッキをロードした後ナノリットル ディスペンサー デッキはストリップ ホルダー ・ ブロックのクリアと 50 μ L チップ スタックの後ろにキャリアがアルミ SBS 蓋の明確であるを確認します。</li>
		<li>液体ハンドラーのメソッド管理 ' インターフェイス 'セットアップ プレート' を選択します。両方のシステムの初期化を監視し、実行のパラメーターを入力します。(プロンプト、数字および準備を手伝ってチップ管理システム) のメソッド管理インターフェイスのガイドラインに従ってください。</li>
		<li>必要なすべてのコンポーネントの準備が整ったと、プロセスを開始することを再確認してください。</li>
		<li>モニター システム ナノリッター ディスペンサーはその後最初のプレートとプレートのシーラーで滴をセットとしては、プレートをシールします。</li>
		<li>すべて 20 プレートを結晶滴で準備し、自動的にスライド式のキャリアに戻ると、フロント パネルを開くし、プレートを慎重に取り外します。プレートが結晶化のそれらを格納する前に密封されて正しくことを確認します。</li>
		<li>ストレージの液体ハンドラーの左側にそれらを積み重ねる前に 20% エタノール溶液と SBS の蓋をきれい。PCR プレートと、チューブを破棄します。</li>
		<li>マイクロ チューブ冷却キャリアを切り、結露を拭きします。さらに結露を吸収するクーラーの表面の上にペーパー タオルを残します。キャリア カバーを交換し、フロント パネルを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 条件の最適化
<ol><li>
注射器ベースの液体ハンドラー: 結晶化プレート (4 コーナー方法) の貯水池に濃度の 2 つの線形グラデーションを作成します。
	<ol>
<li>液体ハンドラーはオープン ソフトウェアで初期化されて最初を確認します。</li>
		<li>'グラデーション' タブ: 必要なプログラムを開き、貯水池 (表 3) の結晶化プレート型と最終巻を選択。[イソプロパノール] > 10 %v/v と [警視庁] > 20 %v を含むソリューションを使用する場合/v は、3,000、6,000 から 'max ショット集」の高度な設定を引き下げるべき
</li>
		<li>注射器を準備します。各注射器 (ダウン先の尖った端) にピストンを配置、注射器の背面をロボットの頭の下に指定の溝に挿入します。注射器を (プログラムが正しく接続されているすべての必要な注射器でのみ開始) 位置でロックを時計回りにねじる。</li>
		<li>谷を準備します。ステンレス製のフレームを削除し、谷を挿入します。左側の 4 つの位置は、4 コーナー A、B、C、D. (表 3、0.5 mL のデッド ボリュームが表示されているボリュームに追加された) の各シリンジのソリューションに必要なボリュームを表示する '設定' タブにスイッチに対応します。彼らのそれぞれの谷にコーナー ソリューションを注ぎ、デッキ (デッキの前面にある 2 つの磁石の位置に保持するフレーム) にフレームを置きます。には既にデッキに置かれるとき、谷にソリューションを注ぐには、この手順を続行する方法です。
</li>
		<li>モーターを備えられた SBS キャリアの結晶化プレートを配置します。</li>
		<li>「吸引」をクリック、(ピストンを途中で止まって) ときに完了するこの手順を待ちます。</li>
		<li>'実行'] タブに切り替えて、プログラムを実行します。</li>
		<li>プログラムを修了すると、設定タブに戻り、[削除]: システムが残ったソリューションから注射器をパージし、ピストンをわざわざ持ち上げます。'削除' の代わりに '削除' があります; これは同じ注射器でより多くのソリューションを吸引する準備ができて下の位置でピストンを残しています。
</li>
		<li>注射器をそれらを反時計回りに回して取り外します。</li>
		<li>注射器と適切な箱に谷を破棄 (または脱イオン水とし、再利用するため 20 %v/v エタノール溶液で洗浄し)。</li>
		<li>プレート シール、高粘性溶液が混合されているとき、1,000 rpm 3 分または 10 分のマイクロ プレート ミキサーに置きます。プレートはナノリッター ディスペンサーに結晶化液滴を設定可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
添加剤のスクリーニング プロトコル (結晶化液滴添加物画面であらかじめ塗りつぶさ 96 ウェルの結晶化プレートを設定) 1
	<ol>
<li>まず、初期濃度 10% (分 vol. 15 mL 液体ハンドラーと添加物の画面上にコンテナーから状態を転送するとき) 増加した試薬の状態を準備します。</li>
		<li>液体ハンドラーが動作するように準備ができていることを確認します。プログラム「一枚板の添加剤追加画面」を開く (貯水池ボリュームを入力: '72 μ').プロンプト、フィギュアやロボットは、選択した内容に従って動作するように準備ができていることを確かめるとチップ管理システム (必要な 12 x 1,000 μ L ヒント) ヘルプします。
</li>
		<li>-20 ° C の定温器から添加物の画面を取得し、そのアルミ シールをすぐに (プレート ホルダーを使用) を削除、液体ハンドラーのデッキ プレートを配置します。プログラム (プレートはキャリアのフロント左にある A1 コーナーに) 縦レイアウトに従って動作します。条件を満たしたを配置もできます。プログラムを実行します。</li>
		<li>プレートの貯水池が入力されている後は、マイクロ プレート シェーカーにし、プログラムを実行します。再利用の脱イオン水と 20% エタノールを状態のコンテナーをすすいでください。</li>
		<li>
ナノリッター ディスペンサーで水滴を設定します。まず、開封結晶化プレート (プレート ホルダーを使用します)。その後、ストリップ ホルダー ・ ブロックの最初の位置に帯プレートと 8 もタンパク質。制御ソフトウェアの 'セットアップ' タブにはデッキ上の各コンポーネントの実際の位置が表示されます。それぞれを読み込む必要なドロップ サイズ (表 4) によると蛋白質のサンプルを有する帯板のも。液滴を準備するプログラムを実行します。
</li>
		<li>プログラムを修了すると、デッキからプレートを削除し、すぐにそれを封印 (プレート シーラー、3 インチ幅の粘着テープを使用)。適切な箱にストリップを破棄します。</li>
		<li>サイズ、形状を評価し、保管する前に顕微鏡下で水滴の中心します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
添加剤のスクリーニング プロトコル (再使用可能な添加物スクリーン 96 ウェルの結晶化プレートにおける結晶化液滴を設定) 2
	<ol>
<li>まず、添加物の画面を準備: 40 分間室温で解凍に対応する冷凍の 96 ウェル細胞培養プレートを残します。その後、2 分間 1,000 x g で添加物の画面を遠心分離機します。</li>
		<li>条件 (分 vol. 15 mL 液体ハンドラーと添加物の画面上にコンテナーから状態を転送するとき) を準備します。</li>
		<li>条件で 96 ウェルの結晶化プレートの貯水池を埋めます。液体ハンドラーのプロトコル 1 として同じ道を進む、2.2.2、ステップしますが、貯水池のボリュームの '80 μ L' を入力してください。</li>
		<li>デッキ (結晶化プレートと 8 よくタンパク質ストリップ ストリップ ホルダー ・ ブロック、表 4の最初の位置に、添加物の画面を含むプレート) の 3 つのコンポーネントを持つナノリッター ディスペンサーで水滴を設定します。</li>
		<li>アルミニウム シート、スクリーンを含む細胞培養プレートを密封し、-20 ° C の定温器に戻ってそれを置きます。</li>
		<li>サイズ、形状を評価し、保管する前に顕微鏡下で水滴の中心します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

LifeArc は、次の項目を製品化したので、我々 はここに、競合する商業的な関心を状態: 96 ~ と 48 ウェルの MRC プレート、MRC 掛かるドロップ シール、モーフィアス、Pi、オングストローム、LMB の結晶化画面。

1-準備と板に格納されている最初のスクリーンの使用
スクリーニング キットは、貯蔵中にいくつかのチューブで光沈殿や相分離が発生するため、プレートに調剤されて前に混合する必要があります。画面が 2 つのキット (2 x 48 管) で構成される 2 番目のキットの最初の管は冷却のキャリアの E1 の場所に配置されます。画面 4 キット (4 x 24 管) で構成される場合、2 番目のキットの最初のチューブ、C1 の場所に配置されます、3 番目のキットの最初の管の挿入位置が E1、4 キットの最初の管場所 G1 に配置されます。その冷却のキャリアでチューブを挿入中、蓋は、次の標準的な 96 ウェル風景レイアウト トレイに配置されます。よく番号が蓋の上に製造業者によって示され、以来、これはすべての管は、正しい順序で配置されている場合をクロス チェックできます。これはまた板の減らされた数を入力するときにチューブに正しい蓋を置き換えるのに役立ちます。
あらかじめ入力されているプレートは 10 ° C、フリーズおよびシールの劣化状況と問題を引き起こす可能性のある 4 ° c の記憶を避けるために妥協に格納します。プレート保存通常顕著な結露内側の面のシールの数ヶ月まで。これは、これらは比較的高濃度の揮発性試薬 (表 1) の条件を含んでいる LMB05、LMB06、LMB09、LMB10 プレートのより少なく本当です。シールの内側に結露の量が少ないシール効率が低下し、プレートを封印しながら井戸間の交差汚染を引き起こすことができます。初期冷房時の結露を防止し、一晩 4 ° C の冷たい部屋に格納されている、断熱ピクニック クーラーにカルーセルからプレートを最初に転送できます。非常に遅い冷却シール ウエル内で温度勾配の開発を最小限に抑え、結露を減少し、したがって全体15。さらに、プレートが 10 の ° C の定温器に保存されている社内カスタム SBS ポリスチレン蓋 (図示せず) 各スタックの上部プレートに配置されます。
あらかじめ入力されたお皿のセット全体は、小説、水溶性、蛋白質のサンプルに対して大規模な初期画面として使用できます。また、少ない板は特定の要件に合わせて選択できます。たとえば、LMB15 および LMB19 は、膜タンパク質サンプル26,27の具体的策定の画面または LMB20 回折データ28の実験段階を容易にする重い原子を配合した画面 (また見なさい:<a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">モーフィアス蛋白質結晶化画面の定式化</a>)。
2. 結晶化液滴を設定
2 システムを使用している場合最初スクリーニング大量の揮発性試薬キットを処理する必要があります。これは SBS の蓋は、蓋処理とプレート シールに影響を与えることができるゴムの結露を防ぎます。SBS 蓋に、彼らは最初に配置する必要があります理由は、プレートの上部にある隙間のビットは、(プロトコル1.2.6 の手順を参照してください)。PCR プレートの井戸の中の蛋白質のデッド ボリュームが比較的寛大な (0.8 μ L、表 2を参照してください伝説)。8 よくストリップ (表 4) でタンパク質を個別にナノリッター ディスペンサーを使用するとき寛大なデッド ボリュームも同様に、採用に注意してください。小さいのデッド ボリュームが動作可能性があります、ただし、いくつかのサンプルは、ヒントに従う、ロボットのキャリブレーションが少し不正確になる可能性があります、部屋は通常、等より暖かいかもしれません。すべてサンプル損失をアプローチを統合するために寛大なデッド ボリューム カバーに します。
さらに実験の小型化に有効に最近の動向と、それゆえ結晶化条件スクリーニングに必要なサンプル量を削減できる、対応する技術29,30 を統合することにより.しかし、更なる小型のいくつかの側面には、31液滴の蒸発および微結晶32の操作など、慎重に検討が必要があります。
最後に、(球面上井戸) の結晶化液滴を設定するとき遠心 (2,000 rpm、1 分) プレートをルーチンの最後のステップとして統合されること。一貫性のあるサイズと遠心分離に起因する液滴の形状再現性の問題33,34を減らすことができます。確かに、中心の滴は全体のプレートのようになります必要な焦点距離として顕微鏡を用いた実験の後で評価を緩和します。
3. 4 コーナー方法の利点
4 コーナー方法の最も重要な利点は、そのシンプルさ、エラーを最小限に抑え、容易に簡単な自動化されたプロトコルです。たとえば、4 コーナー ソリューションは、次の同じレイアウト液体ハンドラーのデッキに常に配置されます。また、すべてのプログラムは、固定比率は、ソリューション (図 3) に基づいています。 高濃度で高粘度にすることができますソリューションの自動処理に 4 コーナー ソリューションの手動準備お勧めします。ほとんど液体クラスの最適化のための最小要件と液体ハンドラーの型で可能な比較的迅速かつ正確な調剤/吸引できます。それにもかかわらず、いくつかのコーナーのソリューションはすぎる粘性液体システムが効率的に動作する搭載ロボットの可能性があります。これは、我々 は肯定的な変位 (図 3 b) と液体ハンドラーを選んだ理由です。
濃度の 2 の線形グラデーションに加えて便利な方法で、一定濃度の 3 番目のコンポーネント (つまりバッファー/添加剤のセット) をテストできます。このため、比較的大量に変化する成分を除く適切に高い濃度でコーナー ソリューションのコア セットの最初に準備します。その後、この成分を含む溶液が最終濃度を調整する追加されます。たとえば、一連の 4 コーナー ソリューションの 50 mL は、当初よりも 10% 高い濃度で用意しています。このコア セットし、4 の 5 の小さなサブセットに分割されます。最後に、サブセットごとに、異なるバッファー pH 液量の 10% が追加されます。
4 フォーマットおよび添加物スクリーンの種類
画面は、彼らが定期的に使用されていないので-20 ° C (図 4) で通常格納され、揮発性/不安定な化合物を含みます。ディープ ウェル ブロック (井戸で 1 mL) に格納されている冷凍添加物スクリーンを使用は、完全に室温で解凍するすべての添加剤溶液の 12 〜 24 時間かかるので早く計画されなければなりません。また、利用者が多数の交差汚染の問題を引き起こし、同じ添加物画面を共有します。最後に、ディープ ウェル ブロックの高さ、それら不適当ほとんどナノリットル ディスペンサー。これらの問題を回避する便利なソリューションとして画面に転勤させるディープ ウェル ブロックからロープロファイル プレート (図 4)。
歴史的には、さまざまな (単一濃度) と 1 つの試薬を含む添加剤の画面は、非常に人気のある35,36をされています。ただし、添加物37または単一添加剤濃度の異なる38で発見の数が減少のミックスを統合する添加物スクリーンの他のタイプを開発されています。最後に、補完的なアプローチは、結晶化39,40前にサンプルに添加剤の効果を調べるためです。
5 その他の考慮事項
をお勧め:ほとんどの画面にはあるいは有毒有害物質が含まれておよびプロトコル中にそれ故に十分な個人的な保護を用いなければなりません。同様に、ロボットの可動と、(ロボットのほとんどは、緊急停止ボタン/システムを持っている) が、プログラムの実行中に手動で干渉しようときに特にに、怪我につながる可能性があります。関与する、正規の技術的な複雑さのためチェック ロボット、画面とプログラムの以前の特徴テスト サンプルは、再現性の高いレベルで継続のために重要。
スループット:指示として 4,000 に 8,000 LMB のプレートが生産システム 1 年間 (および最初のスクリーニングのためのユーザーによってその後採用)。悪化し蒸発開始されます予想売り上げ高が 4-5 ヶ月後、いくつかの条件として、はるかに低い 10 の ° C であらかじめ入力された板の大量在庫に合わせられない。小-中規模の所41オートメーション プロトコルへの異なるアプローチを実施しています。
の格納と実験を評価する:水滴の準備ができたら、プレート、ルーム 4 または 18 ° C (± 0.5 ° C の最大偏差) 厳しく制御された温度で低振動の棚に格納されます。実験は、冷や光の源の顕微鏡を使用して評価されます。様々 な自動イメージング システムのすべての側面を慎重に検討する必要があります 1 つしかし、市販されている: プレートをスキャンするために必要な速度が高いスループットを十分でしょうか?結晶以外のオブジェクトはオート フォーカスを妨げるか。結果として得られる画像の品質は (特に水滴の周囲) のスポットの非常に小さい結晶に十分でしょうか。42,43,44
結晶化条件の比較:当初得られた結晶の性質について注意深い調査の後の傾向と類似点<a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB 画面データベース</a>または45C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Web ツール</a>を使用して、条件間で分析ができます。

さらに原子レベルで生物学と疾患のメカニズムの私達の理解を進めるため、その後薬物探索1への合理的なアプローチを支援するために、x 線結晶構造解析が広く適用されます。このため、精製、蛋白質、DNA、RNA、その他配位子およびその錯体の濃縮 (2-50 mg/mL) 高分子サンプルは、フォームの傾向を命じた三次元格子結晶化2,3 を試験的 ,4。X 線を回折する高品質の結晶が得られるとき、結晶構造は原子分解能5,6の近くで解決できるかもしれない。重大に、新しいサンプルを結晶化条件を予測できず、高品質結晶の収量が通常非常に低い。根本的な理由は、興味の多くのサンプルが結晶化 (通常は数日) の対応するタイム スケールでそれらを不安定にさせる挑戦の生化学的特性を持っていることです。最後に、プロセスは、サンプルとサンプルのバリエーションを生産し、彼らの精製と結晶化7、8を最適化するために必要な時間によって合成されます。
結晶化条件のサンプルの溶解度を低減する共沈剤とソリューションであり、条件は頻繁にまたバッファーおよび添加物を含みます。何百ものような試薬、サンプルの完全性 (蛋白質、核酸の展開など) と干渉する性向が低いので結晶化実験のパラメーターを変更する適しています。結晶化試薬の組み合わせの数百万のテストは可能ではない、様々 な戦略9配合 - 多くのスクリーニング キットにはいくつかのテスト,10 - は小型の試験やプロトコル自動で可能です。このような観点で最も従順の技術はおそらく特殊な結晶化プレート11で実装された結晶化条件 (25 250 μ L) を含む貯水池の上の小さな井戸の上に座って 100 200 nL 水滴と水蒸気拡散,12. 蛋白質のサンプルと条件は頻繁に 200 の合計ボリュームの 1:1 の比率で結合 nL 上井戸における液滴を設定するとき。代替技術や下油バッチ13など脂質キュービック相14 (最新のものは膜貫通タンパク質に特に適用されるプレートで実装可能なロボット ナノリットル タンパク質結晶化非常に悪い水で溶ける)。
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">MRC LMB に結晶化設備</a>は 2000 年代初頭に開始され、2005年15で私達の自動化されたプロトコルの初期の概要が発表されました。タンパク質結晶化への歴史的導入が発表され、またロボット ナノリットルの利点の概要のアプローチ (その後、日常的な実験への新しいアプローチ).高分子結晶化以来、さまざまな (最適) の初期条件を採用、非常にほとんど、あるいは全く役立つ事前情報が本質的に確率過程品質回折結晶16の収量を高めます。その上、大初期画面のしばしば見落とされる利点はサンプルと多くの場合結晶の最適化の必要性を大幅に削減します。もちろん、1 つはまだ後でいくつかの初期条件の最適化を続行する必要があります。通常、試薬の pH 濃度は体系的に調査します。多くの試薬は、さらに結晶化のパラメーターを変更する最適化された条件に組み入れることもできます。確かに、1 つは作りたてのサンプルの結晶化を試みる必要があります、それゆえ対応するプロトコルなりません簡単で利用可能ないつでも。
ここで、2 つは完全に MRC LMB (システム 1 と 2) で設計されたシステムを自動化し、対応するプロトコルの記述に完全に。これらの 2 つのシステムの主な用途は初期座ってドロップ結晶化プレートを用いた蒸気拡散によってスクリーニングです。システム 1 は、液体ハンドラー、株式板に自動化されたカルーセル、プレートの分類のためのインク ジェット プリンタと接着プレート シーラーを統合します。システム 1、72 96 ウェル プレート、市販のスクリーニング キット (試験管に 10 mL の開始ボリュームから貯水池に転送条件の 80 μ L) でいっぱい、ラベルおよびシールします。プレートは、利用可能なユーザーにいつでも (初期画面と呼ばれる 'LMB プレート') として 10 ° C の定温器に保存されます。
システム 2 は、粘着プレート シーラー、ナノリッター ディスペンサー液体ハンドラーを統合します。システムの蒸気拡散実験の滴 (100-1,000 nL) に座って 2 は条件を組み合わせることによって生成され、20 の 48 または 96 ウェル プレートの上井戸にサンプルは事前条件でいっぱい。これは 1,920 の選考条件は試験的システム 2 で 20 LMB プレートを使用する場合を意味します。
ロボットは選択した条件の最適化にも個別に使用され、対応する半自動化されたプロトコルについても説明します。4 コーナー方法17を日常的に利用して、最適化画面を生成します。対応するプロトコルは最初 4 ソリューション ('A、B、C、および D') のマニュアルの準備を要求します。(2 主な結晶化剤の濃度の 2 つの線形グラデーションは結晶化プレートの貯水池に直接は自動的に生成されます。このため、注射器ベースの液体ハンドラーは異なる比率で 4 コーナー ソリューションを分配します。
条件をさらに最適化するには、可能性のある結果の結晶18の特性を高める添加物スクリーン採用できます。添加剤のスクリーニングのため 2 つの方法があります: 液滴 (プロトコル 1) を設定する前に結晶化プレートの貯水池に分配される添加物から始まるプロトコルと添加物の画面が分配される別のプロトコル直接に水滴 (プロトコル 2)。
自動の高分子の結晶化を容易にする MRC LMB で開始された他の有用な開発はまた掲載されています。基本的には、結晶化プレートとふたを積み重ね可能な社会の生体分子スクリーニング (SBS) などの関連するデバイスはシステム 2 を使用して、条件の蒸発を最小限にします。
簡潔にするため、ユーザーが基本機能とナノリッター ディスペンサー、インク ジェット プリンター、および接着剤板シーラーのメンテナンスに精通していることが想定されます。ロボットのデッキ プレートが配置されている限り、そのよく A1 (A1 コーナー) はプレート キャリアの左後ろの方。

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>リキッドハンドラー (システム1)。システム液体に基づく吸引/ディスペンス。自動カルーセルを統合します。EVOware plus 制御ソフトウェア v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロラボ&reg;スター&トレード;</td><td>ハミルトン</td><td>n/a</td><td>リキッド ハンドラー (システム 2)。容積式(CO-RE&trade;技術)に基づく吸引/ディスペンス。メソッド管理インターフェースを備えたハミルトンSTAR制御ソフトウェアv.4.3.5.4785。</td></tr><tr><td>蚊&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>マイクロシリンジベースのナノリットルディスペンサーで、液滴(システム2およびスタンドアロン)、3ポジションデッキのセットアップに使用されます。制御ソフトウェア v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>トンボ&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>シリンジベースのリキッドハンドラーで、最適化スクリーン(4コーナー法)の作成に使用されています。制御ソフトウェア v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>粘着プレートシーラー</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>システム1および2に統合(スタンドアロンロボットとしても使用)。</td></tr><tr><td>インクジェットプリンタ9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n / a</td><td>システム1に統合されています。タッチスクリーンインターフェース。</td></tr><tr><td>Crystallization screens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade; LMB01</td> Crystal Screen 2&tradeで使用される<td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td>晶<td>析キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td></td>LMB01 Wizard&tradeで使用される<td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>晶析キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB02</td><td></td> Wizard&tradeで使用されるClassic 1 <td>Rigaku</td> 1009530<td>晶析キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB02</td><td></td>グリッドスクリーン&tradeで使用されるクラシック2<td>リガク</td>1009531<td>晶析キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-211</td>結晶<td>化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB03</td></tr><tr><td>グリッドスクリーン&tradeで使用。LMB03</td>クイックスクリーン&トレードで使用されるPEG/LiCl<td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-217</td><td>晶析キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td></td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-221</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB03</td></tr><tr><td>グリッドスクリーン&tradeで使用。塩化ナトリウム</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-219</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB03</td></tr><tr><td>グリッドスクリーン&tradeで使用。PEG 6000</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-213</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB04</td></tr><tr><td>グリッドスクリーン&tradeで使用されます。LMB04</td> MemFac&tradeで使用されるMPD<td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-215</td><td>晶析キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td></td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-114</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB04</td></tr><tr><td>PEG/イオン&トレード</td>で使用。<td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-126</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&tradeで使用。</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-116</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB05</td></tr><tr><td>クリスタルスクリーンライト&トレード</td>で使用。<td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-128</td><td>LMB06 Custom Liteスクリーンで使用される晶析キット(試験管、条件あたり10mL)</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n / a</td><td>LMB06 Wizard&tradeで使用される結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Crystallization kit (試験管、1条件あたり10mL) は LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade で使用されています。LMB07</td><td></td><td></td> JBS1 JenaBioScience CS-101L LMB08 JBS2 JenaBioScience CS-102L に使用されている Cryo 2 Rigaku 1009537 <td>結晶化キット (試験</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>管、条件ごとに 10mL) LMB08</td></tr> JBS3 <tr><td></td><td></td><td>JenaBioScience</td> CS-103L <td>に使用されている結晶化キット (試験管、条件ごとに 10mL</td></tr>)<tr><td></td><td></td><td></td><td>LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td> で使用した晶析キット(試験管、1条件あたり<td>10mL) LMB08で使用した晶析キット(試験管、10mL/条件</td></tr>) <tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>LMB09で使用した晶析キット(試験管、10mL/条件) LMB09で使用した晶析キット(試験管、10mL</td></tr>/<tr><td></td><td></td><td></td><td>条件</td></tr>)<tr><td>JBS7</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>CS-107L</td><td>LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>CS-108L</td> LMB09 イエナバイオサイエンス CS-109L イエナバイオサイエンス CS-109L で使用される晶析<td>キット(試験管、条件ごとに10mL</td></tr>) LMB10 JBS10 イエナバイオサイエンス CS-110L <tr><td></td><td></td><td></td><td>に使用 結晶化キット(試験管、条件ごとに10mL</td></tr>)<tr><td></td><td></td><td></td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)はLMB10</td></tr><tr><td>クリアストラテジー&トレードで使用されます。LMB10クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB10クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB11クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB11クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB1 Clear Strategy&tradeで使用されるスクリーン1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB11クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB12クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB12クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB12クリア戦略&トレードで使用されるスクリーン2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td>LMB12インデックス&トレードで使用されるスクリーン2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)。</td></tr><tr><td></td>LMB13 SaltRX&tradeで使用される<td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td>結晶<td>化キット(試験管、条件あたり10mL)</td></tr><tr><td>;LMB14</td> SaltRX&tradeで使用される<td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td>結晶<td>化キット(試験管、条件あたり10mL)</td></tr>&<tr><td>trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td>結晶<td>化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&tradeで使用されます。</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td>結晶<td>化キット(試験管、条件あたり10mL)はLMB15</td></tr><tr><td>MemSys&tradeで使用されます。</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)はLMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&tradeで使用されます。Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td> LMB16 MORPHEUS&reg;スクリーン<td>で使用される結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>LMB17 Piミニマルスクリーンで使用される結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)</td></tr><tr><td></td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td> LMB18 Pi-PEGスクリーン<td>で使用される結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)</td></tr><tr><td></td><td>JenaBioScience</td>で使用<td>CS-128</td><td>結晶化キット(試験管、1条件あたり10mL)はLMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&regに使用されています。IIスクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>結晶化キット(試験管、条件あたり10mL)LMB20</td></tr><tr><td>LMB結晶化スクリーン&tradeで使用されます。</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td> LMB21Additive screens<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT additive screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td> で使用された晶析キット (試験管、<td>条件あたり 10mL) 96 ウェル ディープウェル ブロック (ウェルあたり 1 mL) で凍結。</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; 添加剤スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>96ウェル深井戸ブロック(500 & micro;L per well)。</td></tr><tr><td>ANGSTROM 添加剤スクリーン&貿易;&nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>96ウェルディープウェルブロック(1ウェルあたり1mL)で凍結。</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; 添加剤スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>96ウェル細胞培養Costar&reg;プレートで凍結 V字型ウェル(100 &micro;L per well)。</td></tr><tr><td>ANGSTROM 添加剤スクリーン&貿易;&nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>96ウェル細胞培養Costar&reg;プレートで凍結、V字型ウェル(100 &micro;L per well)。</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES添加剤スクリーン</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n / a</td><td>48単一添加剤(MORPHEUSで見つかった薬物化合物&reg;III)。</td></tr><tr><td><ストロング>その他の消耗品</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルMRC 2ドロッププレート</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>シッティングドロップ、蒸気拡散プレート。貯水池の推奨容量:80&nbsp;有効液滴量の範囲:10-1000nL。紫外線透過性。</td></tr><tr><td>48ウェルMRC 1ドロッププレート&nbsp;(「MAXIプレート」)</td><td>スイス</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>スケールアップ/最適化のためのシッティングドロップ、蒸気拡散プレート。貯水池の推奨容量:200&nbsp;&micro;L.有用な液滴量の範囲:0.1-10 &micro;L.紫外線透過性。</td></tr><tr><td>MRCハンギングドロップシール</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>ハンギングドロップ、MRC蒸気拡散プレート(MRC 96T-UVPおよびMMX01-UVP)の両方と互換性があります。紫外線およびX線透過性。</td></tr><tr><td>粘着シールテープ</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR4-50</td><td>3インチ幅ダック&reg;HDクリア&トレード;シーラーおよび手動シール用。</td></tr><tr><td>粘着性アルミニウムシート</td><td>ベックマン・コールター</td><td>538619</td><td>添加剤スクリーンの再シールに使用されます。</td></tr><tr><td>インクカートリッジ</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>システム1(インクジェットプリンター)。</td></tr><tr><td>溶剤カートリッジ</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>システム1(インクジェットプリンター)。</td></tr><tr><td>50 マイクロ;Lのヒント&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>235947</td><td>システム2(STAR&trade;リキッドハンドラー)。1920 x CO-RE&tradeの6セットのボックス。使い捨てのスタックのヒント。</td></tr><tr><td>試薬容器</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>添加剤スクリーニングプロトコル中に状態をプレートに分注するために使用されます。&nbsp;</td></tr><tr><td>PCRプレート</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>システム2(蚊に転送するタンパク質が含まれています&reg;)。Abgene Diamond ultra、384 V字型ウェル。</td></tr><tr><td>マイクロシリンジ</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Mosquito&reg; ナノリットルディスペンサー(9mm間隔)用の26,000マイクロシリンジのスプール。</td></tr><tr><td>ストリップホルダーブロック</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Mosquito&regsストリップ用のSSBデバイス、別名「4ウェイ試薬ホルダー」。</td></tr><tr><td>2 &マイクロ;L 8ウェルストリップ</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>モスキートのデッキにタンパク質が含まれています。40ストリップのボックス、井戸の最大体積は3.2μ;Lです。</td></tr><tr><td>5 &マイクロ;L 8ウェルストリップ</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>モスキートのデッキにタンパク質が含まれています。40ストリップのボックス、井戸の最大体積は7.5μ;Lです。</td></tr><tr><td>5 mLシリンジ</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Dragonfly&reg;液体ハンドラー用のシリンジ本体とピストン。100個入り。</td></tr><tr><td>トラフ/リザーバー</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Dragonfly&reg;のデッキにストックソリューションが含まれています。50個入り。</td></tr><tr><td>オービタルマイクロプレートシェーカー</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg; シングルプレート(0-2000 rpm)での混合条件用。</td></tr><tr><td>マイクロプレートミキサー</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne.96本の振動ピンを持つ1枚のプレートでの混合条件。</td></tr></tbody></table>

mrc 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

X 線を回折する高品質の結晶が得られるとき、結晶構造は原子分解能の近くで解決できるかもしれない。蛋白質、Dna、Rna、その錯体の結晶化条件はない、しかし予測します。さまざまな条件を用いた回折結晶の品質の収穫を増加する方法です。2 つの完全に自動化されたシステムは、ナノリットル液滴を用いた蒸気拡散によってで、MRC 分子生物学実験施設 (ケンブリッジ、イギリス、MRC LMB) 1,920 の初期条件に対する結晶化を容易にする開発されています。半自動化されたプロトコルは、試薬、pH、濃度を変更するか、可能性のある結果の結晶の特性を向上させる添加物を導入することによって条件を最適化する開発されています。対応するすべてのプロトコルの詳細に説明・簡潔に説明されます。一緒に取られて、彼らは便利で高効率高分子結晶化マルチ ユーザー機能でユーザーに彼らの実験の主要なパラメーターを制御を与えている間を有効にします。

自動化されたシステムと画面の大きい数のルーチンの準備のためのプロトコル、蒸気拡散実験のためのナノリットル結晶滴は説明し、説明しました。

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

この手順の全体的な目的は、初期の結晶化スクリーニング条件から高品質の結晶を作製することです。これらの結晶は、タンパク質、DNA、RNA、およびそれらの複合体の構造研究に使用できます。高分子構造に関する研究は、ますます困難になっています。また、多様な初期条件を提供することで、サンプルや結晶の最適化への手間を軽減しつつ、有用な結晶の得率を高めることができます。2つの完全自動化システムであるLMBにより、ナノリットル液滴を用いた最大1,920件の蒸気拡散実験の準備が可能になります。簡潔にするため、ユーザーはナノリットルディスペンサー、インクジェットプリンター、および粘着プレートシーラーの基本機能とメンテナンスについて既に習熟しているものとします。処法を実施する前に、システムのロボットが初期化されており、制御ソフトウェアが開いていることを確認してください。メインプログラムを開始する約30分前に、チューブ冷却キャリアのチラーをオンにします。プレートシーラーの電動SBSキャリアにテストプレートを設置してください。プレートシーラーを作動させ、フィルムが適切に貼付されているかを確認します。プレートシーラーの準備が整っていることを検証するため、このテストをさらに2回繰り返します。その後、リキッドハンドラーのメインコンテナに20 litersの脱イオン水を追加します。カップリングインサートを20%エタノール洗浄液の小型容器から取り外し、メイン容器に接続します。インクジェットプリンターのタッチスクリーンに適切なスクリーン名を入力してください。その後、カルーセルドアを開閉して、カルーセルの回転を始動させます。最初のスタックが表示されたら、ドアを開けます。最初のスタックに22枚の結晶化プレートを、すべて1列目が外側を向くように完全にロードします。続く2つのスタックも同様に完全にロードします。残りの6枚のプレートを4番目のスタックの最上段にセットし、カルーセルドアを閉じます。チラーのディスプレイに 14 °C と表示されていることを確認してください。選択したスクリーニングキットを、1分間、ゆっくりと繰り返し転倒混和します。次に、リキッドハンドラーのフロントパネルを開きます。チューブの蓋を開け、標準的な96ウェルレイアウトに従って冷却キャリアに配置します。チューブをキャリアに配置する際、その蓋を同じ96ウェルレイアウトでトレイ上に置いてください。System 1を使用する場合、チューブが正しく配置されているかを確認するため、ラベルリードを96ウェルレイアウトに従ってトレイ上に配置します。チューブの位置を照合し、すべてのチューブがキャリア内で水平に安定して収まっていることを確認してください。その後、フロントパネルを閉じます。リキッドハンドラーソフトウェアのStartupウィンドウで［Run Maintenance］を選択し、Flushingプログラムを開きます。このプログラムを実行して、システム内から20% ethanolをフラッシュし、液体分注チップの外側を洗浄します。フラッシングが完了したら、［Cancel］をクリックしてStartupに戻ります。「Run An Existing Process」を選択し、「Start Your Selection」をクリックします。MRC Kit分注プログラムを開きます。Configuration画面のInstancesに「18」と入力し、プログラムを実行します。最初の4枚のプレートにラベルが貼られ、充填および密封されるまでシステムを監視します。最初の4枚のプレートの調製が完了するまで、システムを放置しないでください。全72枚のプレートの調製が完了し、カルーセルに戻されたら、カップリングインサートを脱イオン水容器から20% ethanol容器に切り替えます。前回と同様の手順でスタートアップフラッシュプログラムを実行してください。チラーの電源を切り、空のスクリーニングキットチューブを廃棄します。準備した72枚のプレートをカルーセルから注意深く取り出します。充填が不適切または封印が不十分なプレートは廃棄してください。調整済みプレートは10°Cで保存します。まず、システムのロボットがオンであること、ナノリットルディスペンサーが初期化されソフトウェアが開いていること、およびリキッドハンドラーのメソッドマネージャーが開いていることを確認してください。メインプログラムを開始する約15分前に、マイクロチューブ冷却キャリアの電源を入れてください。プレートシーラーの電動SBSキャリアにテストプレートを設置します。プレートシーラーを動作させ、プレートが適切に密封されていることを確認してください。プレートシーラーのテストを3回行います。次に、ナノリッターディスペンサーを作動させ、テストプレートに100 nanoliterのテスト溶液ドロップを分注します。ここでは、ナノリッターディスペンサーによって作製された、赤色染料を含むテスト溶液の100 nanoliterドロップの光学顕微鏡写真を示しています。ナノリッターディスペンサーのソフトウェアを終了し、デッキからストリップホルダーブロックを取り除きます。次に、独自設計のプレートホルダーに、条件の中で揮発性試薬の相対量が最も多い、あらかじめ充填された96ウェル結晶化プレートをセットします。プレートから粘着フィルムを取り除きます。リキッドハンドラーのフロントパネルを開き、シールを剥がしたプレートを、最初のスライディングキャリア後方のデッキ上に配置します。プレートをSBS製アルミ蓋で閉じます。蓋の反対側の角を軽く押して、蓋をキャリアの左後方に密着させます。System 2を使用する場合、揮発性試薬を多量に含むスクリーニングキットを優先的に処理してください。これにより、SBSリードに結露が生じるのを防ぎます。結露が生じると、リードの自動ハンドリングやプレートのシーリングに影響を及ぼす可能性があります。シールを剥がし、スライディングキャリアにロードして、残りの19枚のプレートも同様に、揮発性の高い条件から低い条件の順にカバーをかけます。マイクロチューブ冷却キャリアが4 degrees Celsiusに達し、緑色のランプが点灯したら、そのカバーを取り除きます。少なくとも440 µLのタンパク質サンプルが入ったマイクロチューブの蓋を切り落とします。液面の上に泡がないことを確認してください。泡があると液体検出システムに干渉します。チューブをマイクロチューブ冷却キャリアのポジション1に配置します。プレート移動アダプターキャリアの前のリキッドハンドラーデッキにPCRプレートを設置します。その後、フロントパネルを閉じます。リキッドハンドラーのメソッド管理インターフェースで、[Setup Plates]を選択します。両システムの初期化をモニタリングし、プレートの種類、各条件のドロップ数、ドロップサイズ、処理する最初のプレートの位置、およびプレート数を含むランパラメータを入力します。デッキへのロードのヘルプが必要かという問いに対し、「No」をクリックします。空のチップラックがないことを確認し、「OK」をクリックします。ランに必要な十分なチップがあることを確認し、「OK」をクリックします。必要に応じてチップ管理システムを更新し、「OK」をクリックします。ナノリッターディスペンサーのデッキにストリップホルダーブロックがないこと、キャリアが後方にあり、50 µLチップスタックがアルミニウム製SBS蓋に接触していないことを確認してください。他のすべての必要コンポーネントが準備できているか再確認し、プロセスを開始してください。ナノリットルディスペンサーが最初のプレートに液滴を分注し、続いてプレートシーラーがプレートを密封する間、システムを監視してください。最初のプレートの準備が完了するまで、システムを放置しないでください。20枚すべてのプレートに結晶化ドロップを調製し、スライディングキャリアに自動的に戻されたら、フロントパネルを開けてプレートを慎重に取り出します。結晶化のために保管する前に、プレートが正しく密封されていることを確認してください。SBSリッドを20% ethanol溶液で洗浄した後、保管のためにリキッドハンドラーの左側に積み重ねます。PCRプレートとマイクロチューブを廃棄します。マイクロチューブ用冷却キャリアの電源を切り、結露を拭き取ってください。さらに結露を吸収させるため、クーラーの表面にペーパータオルを置いておきます。その後、キャリアカバーを戻し、フロントパネルを閉じます。OmpFとMreBは、当初これらの完全自動化プロトコルを用いてスクリーニングされました。X線回折に十分な品質のOmpF結晶が、LMB 7プレートのウェルA4で見出されました。MreBの回折可能な品質の結晶が、LMB 20プレートのウェルD12で得られました。結晶化条件の悪化や結露による問題を避けるため、プリフューエルプレートを4℃での保存ではなく10℃で保存することは妥当な妥協案となります。このように保存した場合、プレートは4～5ヶ月以内に使用することが可能です。System 1では、年間で4,000から8,000枚のLMBプレートが作製され、その後、初期スクリーニングに使用されます。想定される回転率が大幅に低い場合は、プロトコルを別に最適化する必要があります。通常、作製したすべてのプレフューエルプレートを、新規サンプルの大規模な初期スクリーニングに使用します。ただし、特定のサンプル要件に応じて、選択するプレート数を少なくする場合もあります。ドロップレットを調製した後、プレートは温度が4℃または18℃に厳密に制御された低振動シェルフに保存します。実験の評価には、スクロール光源顕微鏡を使用します。結晶の性質を注意深く調査した後、LMBまたはC6 Screenデータベースなどのウェブベースのツールを用いて、条件間の特性や類似性を分析できます。その後、結晶化条件のさらなる最適化が必要になる場合があります。4コーナー法および添加剤スクリーニングを用いた追加の自動プロトコルについては、当社の原稿に記載されています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

分子の3次元構造がどのように分子の機能のユニークな理解を提供します。ニア原子分解能で構造決定のための主要な方法は、X線結晶です。ここで、我々はX線結晶構造決定に適している任意の高分子の三次元結晶を得るための現在の方法を示しています。...

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ここでは、EMBLグルノーブルのHTX研究所でCrystalDirect技術に基づくタンパク質から構造への自動高分子結晶学パイプラインの使用方法、迅速なリガンド-タンパク質複合体分析、大規模なフラグメントスクリーニングの方法について説明します。...

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ハーウェル研究施設の結晶化施設を使用したタンパク質の結晶化のプロトコルと、その後のダイヤモンドの多用途高分子結晶構造解析in...

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学ぶ自動化された蒸気拡散結晶化法により、タンパク質・DNA・RNA複合体の高品質結晶を効率的に調製する手法です。ナノリットル液滴を用いて最大1,920の実験を自動化し、構造生物学研究を加速します。

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