ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

これらの標識手順の全般的な目的は、発達中のゼブラフィッシュ胚における安定した微小管、動的な微小管、および新生の微小管をイメージングし、定量化することです。この手法は、微小管が細胞極性の形成にどのように寄与するかなど、発生神経生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、in situ で異なる微小管集団の検出と定量化を最適化できることです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、微小管の完全性を維持することの難しさから苦労することがあります。テキストのプロトコルに従って段階的なゼブラフィッシュ胚を脱塩素化した後、培地をできるだけ取り除きながら、1.5 milliliter centrifuge tubesに移します。4% PFAを含むmicrotubule assembly buffer（MAB）を1 milliliter加え、28.5 degree celsiusで5分間、胚を固定します。

次に、ピペットを使用して固定液を吸引し、1 mLの新しい固定液と交換します。サンプルをロッカーに乗せ、室温で3時間インキュベートします。固定液を吸引し、1 mLのTBS NP-40緩衝液を加えます。

ロッカーを用いて胚を5分間緩やかに撹拌します。この洗浄工程をさらに2回繰り返します。その後、バッファーを1 mLの新鮮なTBS NP-40に交換し、胚を4 °Cで7日以内に保存します。

テキストプロトコルに従って胚の脱卵黄およびアガロースへの包埋を行った後、TBS NP-40を満たした切片作成用ディッシュに胚を置きます。ビブラトームを用いて、アガロースに包埋された胚の最も高い軸に沿って40 micrometersの切片を作成します。微細ピンセットを用いて、目的の切片を24ウェルプレート内の500 microlitersのTBS NP-40に移します。バッファーを除去し、500 microlitersのブロッキング液を加えます。

その後、切片を室温で少なくとも1時間ロッキングします。ブロッキング溶液を、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体300 µLに置換し、サンプルをロッカーを用いて4 °Cで36〜72時間インキュベートします。TBS NP-40 600 µLを用いて、サンプルを2回洗浄します。

室温で30分間ずつロッカー上で静置します。ブロッキングバッファーで希釈したフルオロフォア標識二次抗体を300 µL切片に加え、4 °Cのロッカー上で暗所にて16〜24時間インキュベートします。その後、先ほど示した通りにサンプルを2回洗浄します。

次に、胚に500 µLのDAPI溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。その後、TBS NP-40を用いて、室温で5分間の洗浄を3回行います。洗浄後、防退色剤を含む封入剤を、ダストフリーのスライドグラスの中央に1滴滴下します。

微細ピンセットを使用して、切片を封入剤の液滴に転送します。次に、サンプルの上にダストフリーのカバーガラスを載せます。イメージングを行うまで、スライドをアルミホイルで包み、乾燥した冷暗所に保存してください。

テキストプロトコルに記載された詳細に従い、選択した二次抗体蛍光標識のチャンネル設定でzスタック共焦点画像を撮影し、画像ファイルを保存します。Image Jなどの3D解析ソフトを使用して、データファイルのコピーを開きます。[Image]、[Color]、[Merge Channels]を選択し、目的のチャンネルを重ね合わせてマージ画像を作成します。

594ナノメートル、488ナノメートル、およびDAPIチャネルを選択し、それぞれ赤、緑、青に擬似色を割り当てます。「Check」、「create composite」、「select」、「okay」の順に選択します。「images」、「stack」、「z project」を使用してzスタックの最大強度投影を行い、マージされたzスタックを単一の2D画像として可視化します。

inner best z平面の開始位置と終了位置を、それぞれ開始スライス（start slide）と停止スライス（stop slice）として入力します。投影タイプに「max intensity」を選択し、「okay」をクリックしてください。3D解析ソフトウェアで「create library」を選択し、画像ライブラリに分かりやすい名前を付けてください。

raw画像ファイルをクリックして作成し、ライブラリにドラッグします。次に、解析するファイルを選択します。その後、ビューメニューから「拡張フォーカス」を選択し、メインウィンドウにチャンネル統合画像を表示させます。

フリーハンドROIツールを選択し、解析対象となる関心領域を囲みます。「アクション」タブを選択し、「選択範囲で切り抜き」をクリックして画像をクロップします。その後、クロップした画像ファイルを新しい名前で保存してください。

次に、[measurements]タブをクリックし、3D解析に関連する特定のオブジェクトをフィルタリングするためのプロトコルを作成します。次に、[find objects]をプロトコルウィンドウにドラッグし、最初のプロトコル名をDAPIに変更します。ドロップダウンメニューからbeta tubulinチャネルを選択してください。

次に、以下の設定をβ-tubulinプロトコルにドラッグし、「Find Objects（オブジェクトの検索）」の下に次の順序で配置します：「Fill Holes and Objects（穴とオブジェクトの塗りつぶし）」、「Separate Touching Objects（接触しているオブジェクトの分離）」、「Exclude Objects by Size（サイズによるオブジェクトの除外）」、および「Exclude Not Touching ROIs（接触していないROIの除外）」です。最後に、各プロトコルの最下部にある「Measure（測定）」を選択します。

次に、DAPI以外のすべてのチャネルについて、「強度および体積測定（intensity and volume measurement）」を選択し、すべてのチューブリン標識について「骨格長（skeletal length）」を選択します。測定対象の領域を囲むようにROIを描画します。サマリータブで、ソフトウェアが領域を処理した後の測定値を確認します。

次に、データをコピーし、ここに示すように編集可能なスプレッドシートに保存します。マルチウェル・フロースルー装置を製作するために、ジグまたは帯鋸を使用して、50 milliliter遠心チューブを縦方向に半分に分割します。70 micrometerナイロンメッシュから、半径3 centimetersの半円を7枚切り出し、分割した遠心チューブの片側にぴったりと収まるようにトリミングします。

水槽用シリコンシーラーを用いて、半円形パーツを遠心チューブ内の10 mLの目盛りに平行に接着します。装置を2日間乾燥させた後、ビーカーの水に2〜3時間浸してすすぎます。切断した遠心チューブの上部ネジ端にモデリングクレイを盛り、フロースルーデバイス内に保持される液体の深さが1/4 inchになるように調整します。

50 mLシリンジからプランジャーを取り外し、先端に12インチの細いチューブを挿入して洗浄装置を準備します。チューブを奥まで押し込み、接合部をモデリングクレイで密封します。胚培養液を用いてメッシュをあらかじめ濡らし、液体がフロースルーデバイス全体を通過するようにします。

デバイスを氷上に傾け、すべてのコンパートメントに液体が入りつつ、粘土製の縁がある前面からは液体が排出されるようにします。洗浄装置をリングスタンドに吊り下げ、氷上のフロースルーデバイスの上に配置します。200 millilitersの胚培養液を氷上で冷却し、すべての気泡が除去され、流速が約7 milliliters/minになるまで洗浄装置に注ぎます。

シリンジの高さを変えて流量を調節します。テキストプロトコルに従って胚の脱塩素化およびノコダゾールの調製を行った後、10 millilitersの冷やしたノコダゾール作動溶液を用いて、ノコダゾール処理群の胚培地を交換します。発生段階に応じた適切な時間、ペトリ皿を氷上に置きます。

次に、火炎滅菌した1 mLガラスピペットを用いて、実験群ごとに分けた個別のコンパートメントがあるフロースルー装置に胚を移します。50 mLシリンジの上部に氷冷した胚培地を注入し、ノコダゾールの洗浄を開始します。室温で20分間洗浄した後、火炎滅菌した1 mLガラスピペットを用いて胚を温めた胚培地を含むガラス製ペトリ皿に移し、微小管を再増殖させます。

胚を転移させた直後に、タイマーを開始します。最後に、コントロール群および洗浄後の胚を1分、5分、10分で固定します。具体的には、約10個の胚を、1 mLの4% PFA MAB固定液が入った1.5 mL遠心チューブにピぺッティングし、このビデオの前の段階で示した方法でサンプルを固定します。安定した微小管および動的な微小管のマーカーとして、glu-tubulinおよびtyr tubulinを使用します。

神経キル段階の後脳において、動的な微小管が優位であることが示されています。上皮化が促進される神経ロッドへと発達するにつれ、特に腹側ロッドにおいて、抗tyr-tubulin抗体に対する微小管の免疫反応性は定性的に低下します。対照的に、glu-tubulinは神経キル全体に散在し点状に認められますが、神経ロッドの腹側では微小管束に沿って濃縮しています。

矢印は、ラベル付けが亢進している特定の微小管束または構造を示しています。ノコダゾール処理によって微小管が脱重合し、ラベル付けが拡散します。微小管が再成長すると、中心体から伸長します。

しかし、微小管の軌道は非平面的であるため、単一の平面ではこれが明確に現れない場合があります。それにもかかわらず、一部の画像解析ソフトウェアでは3Dでの長さ測定が可能であり、ノコダゾール洗浄後の微小管の伸長を評価できます。解析した神経管のすべての領域において、ノコダゾール洗浄後の微小管の平均長は、時間の経過とともに増加しているように見えます。

3D画像解析ソフトウェアを用いてデータ解析を完了し、品質管理を行った後、全微小管の平均長や安定化微小管の平均長、および全微小管に対する安定化微小管の比率などの有用な情報を生データから回収できます。この手法を習得すれば、開始から完了まで1週間もかかりません。この手順を行う際は、微小管は脱重合しやすいため、迅速にサンプルの回収および処理を行うことが重要です。

この手順は変異体の解析にも適用可能です。このビデオを視聴することで、無傷の胚において異なる微小管集団を捕捉する方法について十分に理解できるはずです。