Name: ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚における微小管の免疫標識法。安定した、動的、および新生微小管を可視化・定量し、発生神経生物学における細胞極性の樹立メカニズムを解明する。

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共焦点顕微鏡はから、米国国立科学財団 (NSF)、補助金 #DBI 0722569 資金で購入しました。研究によって、米国国家機関の健康/国立医学研究所の一般的な (NIH/日の出) グラント #GM085290 および米国国防総省 (DOD) グラント #W81XWH-16-1-0466 r. m. ブリュー スターに授与を受けました。E. バイタルは UMBC に前の大学と学部科学教育プログラムを通じてハワード ヒューズ医学研究所からの助成金によって支えられた、#52008090 を付与します。S. p. ブラウンは奨学金教育 GAANN によって米国部のサポートされていた、メイヤーホフ大学院フェローシップ NIH/日の出の補助金によって資金を供給 #GM055036、および資金によって、米国の国防総省グラント #W81XWH-16-1-0466 研究させて。

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現在多くの方法がありますゼブラフィッシュ胚における MT 動態をイメージングしてタグ付き分子ライブ イメージングからの反応に至るまで固定組織11,12,13,14。単一のセルに MTs は、動的または安定した状態で存在できますが、上皮化は、MTs は徐々 に時間をかけて安定化プロセスです。安定性と動的な MTs のマーカーを使用してこの現象を可視化する方法を提供しています。ここで紹介した方法では 3次元イメージング ソフトウェアの機能を活用して、動的からゼブラフィッシュ胚組織の断面の安定した MT の集団への移行を定量化します。プロトコル 2メソッドを使用して、新生 MTs の明瞭な人口をラベルし、核生成と成長の残業代に従ってください。
MTs が外界にその傾向のため、自然な状態でイメージし悪名...

微小管 (MTs) は、ポリマーの α- および β-チューブリン線形原繊維、いくつかを組み合わせて、中空の管1,2を形成にまとめることです。MTs は、終了プラス成長著しい中心体または他の微小管重合のセンター (脂質)3で固定終了マイナス成長が遅いとの偏波構造です。De novoMT 形成は (γ-テュルク) に複雑な γ-チューブリン環核 MT アセンブリ4のテンプレートを提供するによって開始されます。任意の指定されたセルに MTs の二集団区別できるそのターン以上異なるレートで。動的 MTs は、成長の段階と動的不安定5として知られているプロセスの収縮の間の切り替えによって、細胞環境を探る。動的 MTs とは異なり安定した MTs 非成長しているし、動的 MTs6より長い半減期があります。

細胞生物学の研究の十年は MT の構造と機能を研究するためのツールの高度な配列を提供、これらの細胞骨格要素に関する知識の大きいボディの結果します。例えば、MTs は確立と維持だけでなく安定動的 MTs7,対の差動細胞内分布にも、本質的な極性に起因する細胞極性の中心的な役割を再生8. 対照的に、まで以下について理解される MT アーキテクチャと脊椎動物の胚などのより複雑な三次元 (3 D) 環境で機能の一部高解像度で MT 骨格のイメージングへの挑戦のため。この制限にもかかわらず gfp 発現するトランスジェニックの最近の生成は行ラベル MTs または MT マーカーの蛍光タグの一過性の発現は、MTs を受けるダイナミックな変化と自分の携帯電話の私達の理解を増加しているとゼブラフィッシュ胚の発達の役割。どちらかは、ラベル付きの9またはチューブリンのポリマーは、直接 MT 関連タンパク質を使用してを分類しているが直接のチューブリンの形質転換線で視覚化される MT ネットワーク全体 Doublecortin ようなキナーゼ (Dclk) または Ensconsin (EMTB)10、 11。他の線 (および構造体) 生成されている MT プラス終了の具体的分類によって MT 本質的な極性の評価を有効にするまたは終了11,12,13,マイナス中心体固定14です。 これらのツールの力を成長の有機体ライブ、MT のダイナミクスを学習する能力であります。このような研究は明らかに、たとえば、特定の細胞集団に MTs の空間と動的配布、形態形成 (細胞分裂面のインジケーター) を受けている組織で細胞分裂の方向のスピンドルは、MT ポリマーの極性細胞の伸長など、移行プロセスに関連と MT 成長率彗星速度9,13,15によって決まります。これらのツールの制限は、彼らが容易に安定性と動的 MT 集団間に行いません。 ことです。

豊富な細胞生物学文献からの描画、反応メソッド ゼブラフィッシュ胚における安定性と動的な MTs のイメージを説明ここでは、形質転換線の使用を補完するものであります。ゼブラフィッシュのような反応方法の普及はやや固定プロシージャ中に MT の整合性を維持する難しさによって妨げられています。プロトコル 1の反応の合計、ダイナミックな最適化手法の概要を説明し、発展途上のゼブラフィッシュ脳の断面積で安定した Mt。さらに、商業的に使用する直接的な方法利用可能なソフトウェアは、これらの MT 集団を定量化に記載されます。安定した MTs は、α-チューブリンのアセチル化、detyrosination、時間16,17をかけて安定した MTs の蓄積などのいくつかの翻訳後修飾に基づく動的 MTs と区別されます。ゼブラフィッシュの胚のアセチル化は、毛様体と軸索の MTs の安定した界面 MTs18、安定した MTs のサブセットにこのマーカーの有用性を制限することではなく、発生します。対照的に、detyrosination は、ゼブラフィッシュ胚18のすべての安定した MTs で発生するが表示されます。この翻訳後修飾は、α-チューブリン (tubulin detyrosinated)18のカルボキシ末端のグルタミン酸を公開し、抗グルタミン酸チューブリン19を使用して検出することができます。Detyrosination は、安定した MTs に優先的に発生しますが、実験的証拠は MT 安定16の原因ではなく結果、この翻訳後修飾であることを示します。、抗-Tyr-チューブリン, α-チューブリン19の tyrosinated フォームを特異的に認識する抗体を用いた動的な MTs の構成相互の MT の人口は区別されます。次のこれらのマーカーと共焦点レーザー顕微鏡の反応、MTs (長さ、番号、および相対的な豊かさ) の定量分析は成長の神経管の定義された領域で実行できます。合理化されたメソッドは、3次元画像処理ソフトウェアを使用して分析を実行するためここで提供されます。このメソッドは、形態形成や設立成熟細胞極性20の質問はアドレスに適用できます。確かに、安定した MTs の偏光配列の精緻化に伴う光受容形態21、開発途上神経管18と軸索形成の8細胞の上皮化を含む多くの発達的イベント。

プロトコル 2では、そのアセンブリ フェーズ (アンカレッジ/核生成と成長)22,23中 MTs を分析する細胞生物学試験の生体の適応について説明します。新生 MTs は中心体を核、その後母中心小体23の subdistal 肢に固定します。次の解重合初期の MT 再生を分析する方法を説明します。このプロトコルは、MTs、薬物のウォッシュ アウト プロシージャおよび治療後の回復期間を耳下腺ノコダゾール処理に関する詳細を提供します。MT の再成長が一定間隔で監視します。合計 MTs のためのマーカーとの反応によって s post ウォッシュ アウト (抗 β-チューブリン) 中心体のマーカーと一緒に (抗 γ-チューブリン) と核 (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI))、プロトコル 1で説明する一般的な手順によると。De novo MT の評価ではなく既存の MTs の拡張が可能、このプロトコルの MT 解重合ステップは欠かせません。この手法は結合タンパク質 3 チャンらに示すように、緑色蛍光タンパク質 (EB3 GFP) に融合エンドなどプラスのヒント マーカーを使用して、(解重合の不在) の MT の成長率を測定するためその他のパブリッシュされた手順とは異なるため201211。この試金は胚・ デ ・ ノボMT アセンブリの欠陥を分析する場合に役立ちますまた、不完全なものに終って中心体には γ-チューブリンの募集が障害者である以前に報告したNEDD1変異など神経管形成と神経欠陥24。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td></td><td></td><td>ペトリディッシュの処理に使用されます。&nbsp;&nbsp;><&nbsp;1X胚培地100 mlあたり1グラムのアガロースをマイクロ波 で重合するまで</td></tr>。<tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals AB01424</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade mountingmedium</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗β-チューブリン</td><td>発生研究 ハイブリドーマバンク</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>ウサギ抗γ-チューブリン</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>ウサギ抗β-チューブ</td>リン <td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>ウサギ抗脱チロシン化チューブリン</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&nbsp;新規ロットの初使用で抗体を滴定します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗チロシン化チューブリン</td><td>ミリポア</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>マウス反中心ミリ</td><td>ポア</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>ヤギ 488 反ウサギ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>ヤギ 594 反ウサギ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>ヤギ 594 アンチマウス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>ヤギ488 反マウス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ビブラトーム</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>世界の精密機器</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ペトリ皿</td><td>細胞治療</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ペトリ皿</td><td>細胞治療</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml ファルコン チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>ウーブンナイロンメッシュ70um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>フィッシャー</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>水族館シーラント</td><td>Amazon.com、マリンランド</td><td>シリコン シーラー 1 オンス (チューブ)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>リング スタンド</td><td>フィッシャー</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>マイクロボア PTFE チューブ、0.022 インチ ID</td><td>コール パーマー</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>モデリング クレイ</td><td>Amazon.com</td><td>サージェント アート 22-4000</td><td>任意のワックスまたは油ベースの無毒モデリング クレイで十分です</td></tr><tr><td>クランプ</td><td>フィッシャー</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60ml シリンジ</td><td>フィッシャー</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>胚培地 (E3)</td><td></td><td></td> <td>34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2&middot;2H2O 9.78 g MgCl2&middot;6H2O 60倍ストックを調製するには、材料をH2Oに溶解し、最終容量を2 Lにします。NaOHでpHを7.2に調整します。オートクレーブ。1X培地を調製するには、60Xストック16.5 mLを1 Lに希釈します。</td></tr><tr><td>ブロッキング溶液</td><td></td><td></td><td>50 ml TBS-NP-40 2.5 ml正常ヤギ血清 1 g BSA 625 &micro;l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6.4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>商用3D画像処理ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>ドライブロックヒーター&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>プロトコル1でアガロースを溶かすためのホットプレートとして使用されます。</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>フラット埋め込み型</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>パブリックドメイン画像処理ソフトウェア</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 成功はロット番号により異なる</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

微小管 (MTs) は、イメージ体内、特に脊椎動物の胚に挑戦して、ダイナミックで壊れやすい構造です。反応メソッドは、ゼブラフィッシュの胚の成長の神経管の MTs の異なる集団を分析するためここで記述されます。神経組織にフォーカスがある、この方法論は他の組織に広く適用されます。手順は、早くに半ば形成段階の胚 (12 体節に 1 体節)、しかし彼らに適応できる一連の比較的マイナーな調整と他のステージのために最適化されています。最初のプロトコルは、安定性と動的な MTs の空間分布を把握し、画像処理ソフトウェアでこれらの集団の定量的分析を行うメソッドを提供します。このアプローチは、既存のツールにリアルタイムを使用して形質転換線のタグ構造体の一過性の発現分布と画像微小管動態を補完します。確かに、このようなツールは、ダイナミックで安定した MTs とは容易に区別しないしかし、非常に便利。イメージを作成し、これらの異なる微小管集団を分析することで、細胞の極性形成と形態形成メカニズムの理解のための重要な含意。2 番目のプロトコルでは、新生 MTs を具体的に明らかにする手法について説明します。これは、次の薬ノコダゾールと薬物ウォッシュ後の回復期の微小管脱重合時間をかけて、MTs のde novoの成長特性をキャプチャで。この手法は、MTs のゼブラフィッシュ胚におけるにまだ適用されていない、微小管重合に関与する蛋白質の生体内機能を調査するための貴重なアッセイをします。

反応を使用して安定性と動的な MTs の解析 プロトコル 1, Glu チューブリンと Tyr チューブリン マーカーとして使用する安定性と動的な MTs のそれぞれ初期 (神経キール) 中に MT のサブ集団の分布と神経管の開発の後期 (神経ロッド) が明らかに。動的な MTs 一世を風靡菱脳神経キール ステージ (4-5 体節) で (図 2A ~ D)。キールが神経のロッド (11-12 体節)、強化された上皮化の段階に発展する質的少ない MTs は腹側のロッドを中心に反 Tyr チューブリン抗体 (図 2E H) 陽性。対照的に、Glu チューブリンが散在しており神経キール (図 3A ~ D) 全体で点状が MT...

ここでは、他の組織に広く適用される、ゼブラフィッシュ脳の発達における微小管の異なる集団を分析するメソッドについて反応について説明します。最初のプロトコルでは、反応の安定性と動的微小管の最適化手法について説明します。第二議定書は、画像し、初期微小管を具体的に数値化する方法を提供します。

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

これらの標識手順の全般的な目的は、発達中のゼブラフィッシュ胚における安定した微小管、動的な微小管、および新生の微小管をイメージングし、定量化することです。この手法は、微小管が細胞極性の形成にどのように寄与するかなど、発生神経生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、in situ で異なる微小管集団の検出と定量化を最適化できることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、微小管の完全性を維持することの難しさから苦労することがあります。テキストのプロトコルに従って段階的なゼブラフィッシュ胚を脱塩素化した後、培地をできるだけ取り除きながら、1.5 milliliter centrifuge tubesに移します。4% PFAを含むmicrotubule assembly buffer（MAB）を1 milliliter加え、28.5 degree celsiusで5分間、胚を固定します。次に、ピペットを使用して固定液を吸引し、1 mLの新しい固定液と交換します。サンプルをロッカーに乗せ、室温で3時間インキュベートします。固定液を吸引し、1 mLのTBS NP-40緩衝液を加えます。ロッカーを用いて胚を5分間緩やかに撹拌します。この洗浄工程をさらに2回繰り返します。その後、バッファーを1 mLの新鮮なTBS NP-40に交換し、胚を4 °Cで7日以内に保存します。テキストプロトコルに従って胚の脱卵黄およびアガロースへの包埋を行った後、TBS NP-40を満たした切片作成用ディッシュに胚を置きます。ビブラトームを用いて、アガロースに包埋された胚の最も高い軸に沿って40 micrometersの切片を作成します。微細ピンセットを用いて、目的の切片を24ウェルプレート内の500 microlitersのTBS NP-40に移します。バッファーを除去し、500 microlitersのブロッキング液を加えます。その後、切片を室温で少なくとも1時間ロッキングします。ブロッキング溶液を、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体300 µLに置換し、サンプルをロッカーを用いて4 °Cで36〜72時間インキュベートします。TBS NP-40 600 µLを用いて、サンプルを2回洗浄します。室温で30分間ずつロッカー上で静置します。ブロッキングバッファーで希釈したフルオロフォア標識二次抗体を300 µL切片に加え、4 °Cのロッカー上で暗所にて16〜24時間インキュベートします。その後、先ほど示した通りにサンプルを2回洗浄します。次に、胚に500 µLのDAPI溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。その後、TBS NP-40を用いて、室温で5分間の洗浄を3回行います。洗浄後、防退色剤を含む封入剤を、ダストフリーのスライドグラスの中央に1滴滴下します。微細ピンセットを使用して、切片を封入剤の液滴に転送します。次に、サンプルの上にダストフリーのカバーガラスを載せます。イメージングを行うまで、スライドをアルミホイルで包み、乾燥した冷暗所に保存してください。テキストプロトコルに記載された詳細に従い、選択した二次抗体蛍光標識のチャンネル設定でzスタック共焦点画像を撮影し、画像ファイルを保存します。Image Jなどの3D解析ソフトを使用して、データファイルのコピーを開きます。[Image]、[Color]、[Merge Channels]を選択し、目的のチャンネルを重ね合わせてマージ画像を作成します。594ナノメートル、488ナノメートル、およびDAPIチャネルを選択し、それぞれ赤、緑、青に擬似色を割り当てます。「Check」、「create composite」、「select」、「okay」の順に選択します。「images」、「stack」、「z project」を使用してzスタックの最大強度投影を行い、マージされたzスタックを単一の2D画像として可視化します。inner best z平面の開始位置と終了位置を、それぞれ開始スライス（start slide）と停止スライス（stop slice）として入力します。投影タイプに「max intensity」を選択し、「okay」をクリックしてください。3D解析ソフトウェアで「create library」を選択し、画像ライブラリに分かりやすい名前を付けてください。raw画像ファイルをクリックして作成し、ライブラリにドラッグします。次に、解析するファイルを選択します。その後、ビューメニューから「拡張フォーカス」を選択し、メインウィンドウにチャンネル統合画像を表示させます。フリーハンドROIツールを選択し、解析対象となる関心領域を囲みます。「アクション」タブを選択し、「選択範囲で切り抜き」をクリックして画像をクロップします。その後、クロップした画像ファイルを新しい名前で保存してください。次に、[measurements]タブをクリックし、3D解析に関連する特定のオブジェクトをフィルタリングするためのプロトコルを作成します。次に、[find objects]をプロトコルウィンドウにドラッグし、最初のプロトコル名をDAPIに変更します。ドロップダウンメニューからbeta tubulinチャネルを選択してください。次に、以下の設定をβ-tubulinプロトコルにドラッグし、「Find Objects（オブジェクトの検索）」の下に次の順序で配置します：「Fill Holes and Objects（穴とオブジェクトの塗りつぶし）」、「Separate Touching Objects（接触しているオブジェクトの分離）」、「Exclude Objects by Size（サイズによるオブジェクトの除外）」、および「Exclude Not Touching ROIs（接触していないROIの除外）」です。最後に、各プロトコルの最下部にある「Measure（測定）」を選択します。次に、DAPI以外のすべてのチャネルについて、「強度および体積測定（intensity and volume measurement）」を選択し、すべてのチューブリン標識について「骨格長（skeletal length）」を選択します。測定対象の領域を囲むようにROIを描画します。サマリータブで、ソフトウェアが領域を処理した後の測定値を確認します。次に、データをコピーし、ここに示すように編集可能なスプレッドシートに保存します。マルチウェル・フロースルー装置を製作するために、ジグまたは帯鋸を使用して、50 milliliter遠心チューブを縦方向に半分に分割します。70 micrometerナイロンメッシュから、半径3 centimetersの半円を7枚切り出し、分割した遠心チューブの片側にぴったりと収まるようにトリミングします。水槽用シリコンシーラーを用いて、半円形パーツを遠心チューブ内の10 mLの目盛りに平行に接着します。装置を2日間乾燥させた後、ビーカーの水に2〜3時間浸してすすぎます。切断した遠心チューブの上部ネジ端にモデリングクレイを盛り、フロースルーデバイス内に保持される液体の深さが1/4 inchになるように調整します。50 mLシリンジからプランジャーを取り外し、先端に12インチの細いチューブを挿入して洗浄装置を準備します。チューブを奥まで押し込み、接合部をモデリングクレイで密封します。胚培養液を用いてメッシュをあらかじめ濡らし、液体がフロースルーデバイス全体を通過するようにします。デバイスを氷上に傾け、すべてのコンパートメントに液体が入りつつ、粘土製の縁がある前面からは液体が排出されるようにします。洗浄装置をリングスタンドに吊り下げ、氷上のフロースルーデバイスの上に配置します。200 millilitersの胚培養液を氷上で冷却し、すべての気泡が除去され、流速が約7 milliliters/minになるまで洗浄装置に注ぎます。シリンジの高さを変えて流量を調節します。テキストプロトコルに従って胚の脱塩素化およびノコダゾールの調製を行った後、10 millilitersの冷やしたノコダゾール作動溶液を用いて、ノコダゾール処理群の胚培地を交換します。発生段階に応じた適切な時間、ペトリ皿を氷上に置きます。次に、火炎滅菌した1 mLガラスピペットを用いて、実験群ごとに分けた個別のコンパートメントがあるフロースルー装置に胚を移します。50 mLシリンジの上部に氷冷した胚培地を注入し、ノコダゾールの洗浄を開始します。室温で20分間洗浄した後、火炎滅菌した1 mLガラスピペットを用いて胚を温めた胚培地を含むガラス製ペトリ皿に移し、微小管を再増殖させます。胚を転移させた直後に、タイマーを開始します。最後に、コントロール群および洗浄後の胚を1分、5分、10分で固定します。具体的には、約10個の胚を、1 mLの4% PFA MAB固定液が入った1.5 mL遠心チューブにピぺッティングし、このビデオの前の段階で示した方法でサンプルを固定します。安定した微小管および動的な微小管のマーカーとして、glu-tubulinおよびtyr tubulinを使用します。神経キル段階の後脳において、動的な微小管が優位であることが示されています。上皮化が促進される神経ロッドへと発達するにつれ、特に腹側ロッドにおいて、抗tyr-tubulin抗体に対する微小管の免疫反応性は定性的に低下します。対照的に、glu-tubulinは神経キル全体に散在し点状に認められますが、神経ロッドの腹側では微小管束に沿って濃縮しています。矢印は、ラベル付けが亢進している特定の微小管束または構造を示しています。ノコダゾール処理によって微小管が脱重合し、ラベル付けが拡散します。微小管が再成長すると、中心体から伸長します。しかし、微小管の軌道は非平面的であるため、単一の平面ではこれが明確に現れない場合があります。それにもかかわらず、一部の画像解析ソフトウェアでは3Dでの長さ測定が可能であり、ノコダゾール洗浄後の微小管の伸長を評価できます。解析した神経管のすべての領域において、ノコダゾール洗浄後の微小管の平均長は、時間の経過とともに増加しているように見えます。3D画像解析ソフトウェアを用いてデータ解析を完了し、品質管理を行った後、全微小管の平均長や安定化微小管の平均長、および全微小管に対する安定化微小管の比率などの有用な情報を生データから回収できます。この手法を習得すれば、開始から完了まで1週間もかかりません。この手順を行う際は、微小管は脱重合しやすいため、迅速にサンプルの回収および処理を行うことが重要です。この手順は変異体の解析にも適用可能です。このビデオを視聴することで、無傷の胚において異なる微小管集団を捕捉する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶゼブラフィッシュ胚における微小管の免疫標識法。安定した、動的、および新生微小管を可視化・定量し、発生神経生物学における細胞極性の樹立メカニズムを解明する。

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

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