タンパク質結晶の微結晶化およびセルロで回折

タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。

このプロトコルの全体的な目標は、微結晶、特にin vivo結晶と見なされる細胞で生成されるものに適用されるX線結晶構造解析法を導入することです。このアプローチの主な利点は、微結晶を生成、検出、分析するためのシンプルで効率的なプロセスを提供することです。この方法は、生細胞内で成長した結晶を使用することで微結晶の使用を容易にすることを目的としており、複雑な精製プロセスやAprocox鎮静試験の必要性を排除します。

このビデオでは、シンクロトロンビームラインでのX線偏向実験の簡単な準備と操作に焦点を当てます。古典的な結晶学と最も異なるステップを示します。このデモンストレーションでは、成功裏に成長した重要な多面体タンパク質の結晶を使用しますが、この方法は、細菌、昆虫、哺乳類、または酵母細胞で結晶を形成するタンパク質にも適用できます。

まず、回転プラットフォーム上で、シポウイルス多面体タンパク質を発現する30ミリリットルのSf9細胞を摂氏27度で3日間インキュベートします。500マイクロリットルのSf9細胞培養物を滅菌血清ピペットを使用してマイクロ遠心チューブに移し、クラスIIバイオセーフティキャビネットを使用し、標準的な無菌技術に従って、メイン培養物の無菌性が維持されるように注意します。マイクロ遠心チューブから5マイクロリットルの細胞をスライドガラスにピペットで移します。

次に、ガラスカバースリップをサンプル上にそっと傾け、片方の端が液滴に触れるようにし、気泡の形成を避けるために、カバースリップを液体の上に慎重に下げます。次に、倒立顕微鏡でスライドを画像化します。200倍の倍率から始めて、潜在的な結晶を検出するときは最大倍率でズームインして、細胞を慎重に調べます。

鋭いエッジと屈折率の変化を探します。結晶が同定された場合は、前の手順を繰り返して、毎日培養物を検査し、結晶の成長を監視します。Sf9細胞の場合は、培養物を遠心分離管に移して回収します。

チューブを氷の上に置き、できるだけ早く次のステップに進みます。結晶含有細胞の単離には、フローサイトメトリー分析に適合したチューブ内で4ミリリットルの感染Sf9細胞をピペットで移します。対照として、模擬感染培養物からの同数のSf9細胞を含む2本目のチューブを調製します。

次に、フローサイトメトリー評価の直前に、ヨウ化プロピジウムを両方のサンプルに最終濃度1ミリリットルあたり1マイクログラムまで添加します。次に、コントロールサンプル細胞を、FSCおよびSSCに準拠した細胞選別が可能な標準フローサイトメーターに適用します。少なくとも 20, 000 のイベントを分析します。

死んだ細胞、細胞の塊、および破片を分析から破棄した後、FSCからSSCへのプロットを生成します。これに続いて、結晶含有サンプルの少なくとも20, 000のイベントを分析します。FSCとSSCのプロットをコントロールと比較し、結晶含有細胞に対応する異なる集団の外観を探します。

結晶含有細胞集団の周りのゲートを定義します。通常は、より高いSSCまたはFSCで現れます。このゲーティングを使用して、約150,000〜200,000個の結晶含有細胞を、50マイクロリットルのPBSバッファーをあらかじめ充填した1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに選別します。前述したように、選別されたサンプルを光学顕微鏡で画像化し、どの集団が結晶含有細胞と関連しているかを確認します。

この段階では、実験的な位相調整が必要な場合、細胞を重原子溶液でインキュベートすることができます。このアプローチは、本文や他のレビューに記載されているさまざまな化合物のスクリーニングとインキュベーション時間に続くものです。サンプルをマウントするためのツールをセットアップするには、まずピンに取り付けられたマイクロメッシュを磁気ワンドの端に取り付けます。

ワンドを透析フロートブイの裂け目に横向きに置きます。次に、ピンセットで紙の芯を手に取り、ロックします。続行する前に、セットアップが完了していることを再確認してください。

次に、等量の0.4%トリパンブルー溶液と細胞を最終濃度0.2%に混合します細胞を再懸濁した後、選別した細胞の0.5マイクロリットルをマイクロメッシュにピペットで移します。細胞をマイクロメッシュ表面に沈着させた後、紙芯で吸い取り、余分な液体の大部分を取り除きます。マイクロメッシュが十分にブロットされていないと、細胞は過剰な液体内の深さが異なるため、シンクロトロンのX線ビームへの配列が複雑になります。

さらに、余分な液体は背景のX線散乱を増加させます。マイクロメッシュが過剰にブロットされると、液体が完全に除去され、サンプルがグリッド開口部に保持されなくなります。最適なブロッティングでは、マイクロメッシュ上に薄い液体の層のみが残り、サンプルを保護し、グリッド開口部に押し込みます。

一部の結晶では、凍結保護剤の使用が必要になります。このケースでは必須ではありませんが、サンプルを塗布してからブロッティングする手順と同じです。液体の薄い層だけが残っていることを確認してください。

マイクロメッシュを液体窒素ですぐに急速冷却し、ロボットパックに移してシンクロトロンマイクロフォーカスビームラインに輸送します。in vivo結晶のサイズが小さいため、マイクロフォーカス結晶学ビームラインで画分データを収集します。まず、マイクロメッシュをゴニオメーターに取り付けます。

次に、まず、フェースオンとサイドオンの向きを使用して、マイクロメッシュをビームパスの中央に配置します。マイクロメッシュを正面から見た状態で、マイクロメッシュの水平レーンの1つの中央を揃えて位置合わせを微調整します。この水平レーンに沿ってデータを収集し、線形をわずかに再調整するだけで済みます。

レーンのすべてのクリスタルがテストされたら、次のレーンに進み、位置合わせ手順を繰り返します。トリパンブルーの色の変化をガイドとして使用して、結晶を見逃したり、2回撃たれたりしないように、処理されたレーンが明確に識別されていることを確認してください。in vivo微結晶を用いた構造決定の2つの方法の概要を示します。

上の行は、細胞からの結晶の精製を含む古典的なアプローチを説明し、下の行は、データ収集のために結晶を宿主細胞に保持するセルロ結晶構造解析アプローチを示しています。In celluloアプローチでは、非感染細胞のフローサイトメトリープロファイルを結晶含有細胞のプロファイルと比較し、結晶含有細胞を他の細胞から分離するためにどの細胞集団を選択すべきかを決定するために使用されます。この例では、多面体を含む細胞は、感染していない細胞よりも側方散乱が高くなります。

トリパンブルーで染色された細胞は、ほとんどのシンクロトロンビームラインに設置されているカメラを使用して簡単に視覚化できます。精製された結晶は、サイズが小さいため、X線ビームを識別して位置合わせするのが面倒ですが、データを収集するときは、センタリング手順を最小限に抑え、同じ細胞または結晶が2回露出したり、細胞や結晶が欠落したりしないように、グリッドパターンで進めるのが最善です。このフロースルーをマスターすると、結晶含有細胞の採取からデータ収集まで約半日かかります。

この手順は、実験的な位相調整のための重原子ソークに適合します。多面体の場合、タンパク質発現開始から8日で正常な構造が得られました。液体窒素の取り扱いは非常に危険であり、窒息や火傷に対する予防策を講じる必要があることを忘れないでください。