タンパク質結晶の微結晶化および

本プロトコルの全体的な目的は、マイクロクリスタル、特に細胞内で生成されin vivo結晶とされるものに適用されるX線結晶構造解析の手法を紹介することである。このアプローチの主な利点は、マイクロクリスタルの作製、検出、および解析のためのシンプルで効率的なプロセスを提供することにある。本手法は、生細胞内で成長させた結晶を利用することで、複雑な精製工程やAprocox沈降試験の必要性を排除し、マイクロクリスタルの利用を容易にすることを目的としている。

このビデオでは、シンクロトロン放射光施設におけるX線回折実験のための簡便な試料調製と操作に焦点を当てます。古典的な結晶学の手法と最も異なるステップについて解説します。本デモンストレーションでは、適切に成長させたバイタルポリヘドロンタンパク質の結晶を使用しますが、この手法は細菌、昆虫、哺乳類、または酵母細胞で結晶化するあらゆるタンパク質にも適用可能です。

まず、cypovirus polyhedronタンパク質を過剰発現させたSf9細胞30 millilitersを、回転台を用いて27 degrees celsiusで3日間インキュベートします。クラスIIバイオセーフティキャビネットを使用し、標準的な無菌操作に従って主培養の無菌性を維持しながら、滅菌済みセロロジカルピペットを用いてSf9細胞培養液500 microlitersをマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブから5 microlitersの細胞をガラススライド上にピペッティングします。

次に、ガラスカバーのスリップを緩やかに傾け、片方の端を液滴に接触させ、気泡が入らないように注意しながらゆっくりと液体の上に下ろします。続いて、倒立顕微鏡を用いてスライドを撮影します。200倍の倍率から細胞を注意深く観察し、結晶と思われるものが検出された場合は最大倍率までズームして確認します。

鋭いエッジや屈折率の変化を確認します。結晶が確認された場合は、前述の手順を繰り返し、結晶の成長を監視するために培養液を毎日観察してください。Sf9細胞については、培養液を遠心分離管に移して回収します。

チューブを氷上に置き、速やかに次のステップに進みます。結晶含有細胞を単離するため、感染させたSf9細胞4 mLをフローサイトメトリー解析に適したチューブにピペットで分注します。対照として、擬似感染（mock infected）させた培養液から同数のSf9細胞を分注した2本目のチューブを用意します。

次に、フローサイトメトリーによる評価の直前に、両方のサンプルにプロピジウムヨードを最終濃度1 µg/mLとなるように添加します。続いて、FSCおよびSSCに基づいたセルソートが可能な標準的なフローサイトメーターを用いて、コントロールサンプルの細胞を解析します。少なくとも20,000イベントを解析してください。

死細胞、細胞凝集塊、およびデブリを解析から除外した後、FSC-SSCプロットを作成します。続いて、結晶を含むサンプルのイベントを少なくとも20,000個解析します。FSC-SSCプロットをコントロールと比較し、結晶を含む細胞に対応する明確な集団が出現しているかを確認します。

通常、SSCまたはFSCが高くなる結晶含有細胞集団の周囲にゲートを設定します。このゲーティングを用いて、結晶含有細胞を約150,000〜200,000個、50 µLのPBSバッファーをあらかじめ満たした1.5 mLマイクロ遠心チューブにソートします。前述の方法に従い、ソートしたサンプルを光学顕微鏡で観察し、どの集団が結晶含有細胞に関連しているかを確認します。

実験的な位相決定が必要な場合は、この段階で細胞を重原子溶液でインキュベートします。このアプローチは、本文および他のレビューで説明されている通り、さまざまな化合物およびインキュベーション時間のスクリーニングに従って行います。まず、ピンに取り付けられたマイクロメッシュをマグネットワンドの端に装着し、試料作製のためのツールを準備します。

透析用フロートブイの切り込みに、ワンドを横向きに配置します。次に、ピンセットでペーパーウィックをつまみ上げ、固定します。次へ進む前に、セットアップが完了していることを再確認してください。

次に、細胞を同量の0.4%トリパンブルー溶液と混合し、最終濃度を0.2%にします。細胞を再懸濁させた後、ソートした細胞を0.5 µL分、マイクロメッシュ上にピペットで分注します。細胞をマイクロメッシュ表面に沈着させた後、ペーパーウィックで吸い取り、余剰液の大部分を取り除きます。マイクロメッシュの吸い取りが不十分な場合、余剰液の中で細胞の深さが不揃いになり、シンクロトロンにおけるX線ビームへのアライメントが困難になります。

さらに、液量が多いと背景のX線散乱が増加します。マイクロメッシュを拭き取りすぎると、液体が完全に除去され、サンプルがグリッドの開口部に保持されなくなります。適切に拭き取りを行うことで、マイクロメッシュ上に薄い液層のみが残り、サンプルを保護しながらグリッドの開口部へと押し込むことができます。

結晶によっては、凍結防止剤の使用が必要な場合があります。本ケースでは不要ですが、その手順はサンプルの適用およびブロッティングの手順と同様です。液層が薄い膜状にのみ残っていることを確認してください。

マイクロメッシュを液体窒素で直ちに急速冷却し、シンクロトロン放射光マイクロフォーカスビームラインへ搬送するためのロボットパックに移します。in vivo結晶はサイズが小さいため、マイクロフォーカス結晶構造解析ビームラインで回折データを収集してください。まず、マイクロメッシュをゴニオメーターにマウントします。

まず、正面および側面からの向きを確認し、マイクロメッシュをビーム光路の中心に合わせます。マイクロメッシュを正面に向けた状態で、水平方向のレーンの一つの中心に合わせることで、アライメントを微調整します。アライメントに軽微な再調整のみを加えながら、この水平レーンに沿ってデータを収集します。

1つのレーンのすべての結晶のテストが完了したら、次のレーンに進み、アライメント手順を繰り返します。処理済みのレーンを明確に識別し、トリパンブルーによる色の変化を指標として、結晶の測定漏れや二重測定が起こらないようにしてください。ここでは、in vivoマイクロ結晶を用いた構造決定のための2つの手法の概要について説明します。

上段は細胞から結晶を精製する古典的な手法について説明しており、下段はデータ収集のために結晶を宿主細胞内に保持するin cellulo結晶構造解析手法を示しています。in cellulo手法では、非感染細胞のフローサイトメトリープロファイルと、結晶含有細胞のプロファイルを比較し、結晶含有細胞を他の細胞から分取して選択すべき細胞集団を決定するために使用します。この例では、多面体含有細胞は非感染細胞よりも側方散乱強度が強くなっています。

トリパンブルーで染色された細胞は、ほとんどの放射光ビームラインで利用可能なカメラを用いて簡単に可視化できます。精製された結晶はサイズが小さいため、特定およびX線ビームへの光軸合わせに手間がかかりますが、データ収集時には、センタリングの手順を最小限に抑え、同一の細胞や結晶への二重露光や、細胞・結晶の見落としを避けるため、グリッドパターンで進めるのが最適です。このワークフローを習得すれば、結晶を含む細胞の回収からデータ収集まで、約半日で完了します。

この手順は、実験的な位相決定のための重原子浸漬法と併用可能です。多面体の例では、タンパク質発現の開始から8日間で通常構造が得られました。液体窒素の使用は極めて危険であり、窒息や凍傷に対する予防措置を講じなければならないことに留意してください。