Name: タンパク質結晶の微結晶化およびセルロで回折 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ、生細胞内でタンパク質微結晶を培養し、シンクロトロン回折実験でX線結晶解析を行う手法。複雑な精製工程を省略し、様々な生物系への応用が可能な簡便なプロトコルを解説する。

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著者たちは、オーストラリアシンクロトロンのMX2ビームラインでの支援のために精製微結晶、Daniel ErikssonとTom Caradoc-Daviesの写真を提供するChan-Sien Layと、Monash UniversityのFlowCore施設からのKathryn FlanaganとAndrew Fryga貴重な援助。

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
<li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="https://elifesciences.org/articles/01345">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2 (0), e01345(2013).</li>
<li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0889311X.2010.527964">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li>
<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/CH/CH14455">Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography.</a> Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
<li>Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029405000956">Protein crystallization in vivo.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector%2C+and+its+assembly+into+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).</li>
<li>Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Virus-like+Particles+for+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Production+and+Purification+of+Recombinant+Murine+Kindlin-3+from+Insect+Cells+for+Biophysical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li>
<li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?a15572">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).</li>
<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
<li>Rey, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virology%3A+holed+up+in+a+natural+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Virology: holed up in a natural crystal.</a> Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).</li>
<li>Schönherr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+investigation+of+dynamic+protein+crystallization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells.</a> Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).</li>
<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、過去に見過ごされていた非常に小さな結晶の分析を容易にする目的で、微結晶を分析する2つのアプローチを提供する。 微結晶の浄化のための重要なステップ 提示されたプロトコールは、モデル系としてSf9細胞で発現されたボンビクス・モリ CPV1ポリヘドリンを用いて最適化されている。しかしながら、 in vivo微結晶は、機械的耐性に大きなばらつきを示す。例えば、昆虫細胞中で増殖したカテプシンBの針状結晶は、剛性であり、機械的ストレスに対して高度に耐性であり、本明細書に記載されたものと同様のプロトコールを用いて精製することができる14 。一方、ホタルルシフェラーゼ結晶は、培養された昆虫細胞で同様の針状形態で増殖し、すぐに細胞溶解に溶解する38 。したがって、 インビボの抽出および精製のためのプロトコール結晶は、ステップ1.3,2a.3-4,2b.4,3.1.3-4および3.2a.5...

生物学的高分子の高分解能構造の決定のためのX線結晶学の使用は、過去20年間にわたり安定した進行を経験している。非専門家による研究者によるX線結晶学の益々の取り込みは、ライフサイエンスの多くの分野におけるこのアプローチの民主化を実証している1 。 歴史的に、約10μm以下の寸法を有する結晶は、構造決定のために使用できないとしても、困難であると考えられてきた。世界的なシンクロトロン放射源の専用マイクロフォーカスビームラインの利用可能性と、微結晶を操作するためのツールの開発などの技術的進歩により、X線マイクロ結晶の幅広い利用を妨げてきた多くの障壁が取り除かれました。シリアルX線microcrystallography 2,3及びマイクロ電子回折4ヘクタールの進歩構造決意用マイクロおよびナノ結晶の使用が可能でなく、大きな結晶5、6、7の使用に時々好ましくないだけであることが示されまし。 これらの進歩は、第一のペプチド8及び昆虫ウイルス9、10によって生成される天然の結晶の研究に適用しました。それらは現在、膜タンパク質や大きな複合体などの最も難しい系を含む多様な生物学的巨大分子に使用されています11 。これらの微結晶の分析を容易にするために、それらはメソ 、特に膜タンパク質12およびマイクロ流体チップ13において分析されている。 これらの新規な微結晶化方法の利用可能性は、古典的なインビトロ crystallogenesisに代わるものを提供する構造生物学14、15、16のための新たな経路として結晶体内。残念なことに、 インビボ結晶が産生されても、細胞からの精製中のリガンドの分解または喪失、シンクロトロンビームラインでの結晶の操作および視覚化の困難さ、退屈なX線回折実験などのいくつかの障害が残る。別の結晶はまた、任意の精製工程17、18、19せずに細胞内で直接分析されているように。比較分析はcelluloアプローチにおけるように精製された結晶およびより高い解像度20の収率データの分析よりも効率的であることを示唆しています。 このプロトコルはタンパク質微結晶学の新しい研究者を支援する傾向があった。それは、シンクロトロンビームラインでのX線回折実験のための試料調製および操作に焦点を当てた方法論を提供する。 2つの選択肢が、古典的な微結晶学のための単離された結晶またはフローサイトメトリーによってソーティングされた結晶含有細胞を用いて、セルロ分析で提案されている（ 図1 ）。

<table><tbody><tr><td>Sf9細胞</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM 昆虫培地</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 1 L細胞培養フラスコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫細胞培養用振とうインキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL用スイングバケット付き遠心分離機19</td> mmプローブMSE Soniprep 150を装備した<td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td>チューブ<td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD インフラックス セルソーター&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Heavy原子スクリーン</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25メッシュは、より大きな表面を提供します。インデックス付きメッシュは、体系的な研究のために購入できます。</td></tr><tr><td>ペーパーウィック</td><td>Mitigen</td><td></td><td>ペーパーウィックのサイズは、最適な流れのために変更することができます。これは、使用される結晶と凍結保護剤の性質に大きく依存します。</td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 マイクロフォーカスビームライン</td><td>Australian Synchrotron</td><td></td><td>利用可能なマイクロフォーカスビームラインのリストは、Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash;1806, DOI:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

多くのシンクロトロン施設で高品質のマイクロフォーカスビームラインが出現したことにより、最大の次元で10μm以下の結晶の日常的な解析が可能になりました。本発明者らは、X線結晶学によるタンパク質微結晶の構造決定のための2つの代替のワークフローを提示し、特にin vivoで成長した結晶に焦点を当てる。微結晶は、超音波処理によって細胞から抽出され、微分遠心分離によって精製されるか、または結晶含有細胞のフローサイトメトリーによる細胞選別の後、セルロで分析される。場合によっては、精製された結晶または結晶含有セルを、実験段階的な調整のために重原子溶液に浸漬する。これらの試料は、マイクロメッシュ支持体上に塗布し、液体窒素中でフラッシュ冷却することにより同様の方法で回折実験用に調製する。我々は、単離された微結晶および結晶質結晶の連続回折実験を簡単に説明し、モデル構築および精密化に適したデータセットを生成するためにマイクロフォーカスシンクロトロンビームラインを使用している。 これらのワークフローは、昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることによって産生されるBombyx mori cypovirus 1（BmCPV1）ポリヘドリンの結晶で例示される。このケーススタディでは、セルロ分析では精製された結晶の分析よりも効率的であり、発現から精製まで約8日間で構造が得られます。

生体内微結晶を用いた構造決定のための代替方法の両方の概要が示されている（ 図1 ）。多面体は、超音波処理および遠心分離によって容易に精製することができる。密度のため、ピペットで取り除くことができる破片の層の下のチューブの底に層を形成する（ 図3aおよび3b ）。次いで、サンプルを数回の超音波処理およびペレットの白色および白亜面から判断されるように十分なレベルの純度に達するまで洗浄する（ 図3c ）。 イン・セルロ・アプローチでは、非感染細胞のフローサイトメトリー・プロファイルを結晶含有細胞のプロファイルと比較し、どの細胞集団を選択して結晶含有細胞を他の細胞（ <strong class...

タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

本プロトコルの全体的な目的は、マイクロクリスタル、特に細胞内で生成されin vivo結晶とされるものに適用されるX線結晶構造解析の手法を紹介することである。このアプローチの主な利点は、マイクロクリスタルの作製、検出、および解析のためのシンプルで効率的なプロセスを提供することにある。本手法は、生細胞内で成長させた結晶を利用することで、複雑な精製工程やAprocox沈降試験の必要性を排除し、マイクロクリスタルの利用を容易にすることを目的としている。このビデオでは、シンクロトロン放射光施設におけるX線回折実験のための簡便な試料調製と操作に焦点を当てます。古典的な結晶学の手法と最も異なるステップについて解説します。本デモンストレーションでは、適切に成長させたバイタルポリヘドロンタンパク質の結晶を使用しますが、この手法は細菌、昆虫、哺乳類、または酵母細胞で結晶化するあらゆるタンパク質にも適用可能です。まず、cypovirus polyhedronタンパク質を過剰発現させたSf9細胞30 millilitersを、回転台を用いて27 degrees celsiusで3日間インキュベートします。クラスIIバイオセーフティキャビネットを使用し、標準的な無菌操作に従って主培養の無菌性を維持しながら、滅菌済みセロロジカルピペットを用いてSf9細胞培養液500 microlitersをマイクロ遠心チューブに移します。マイクロ遠心チューブから5 microlitersの細胞をガラススライド上にピペッティングします。次に、ガラスカバーのスリップを緩やかに傾け、片方の端を液滴に接触させ、気泡が入らないように注意しながらゆっくりと液体の上に下ろします。続いて、倒立顕微鏡を用いてスライドを撮影します。200倍の倍率から細胞を注意深く観察し、結晶と思われるものが検出された場合は最大倍率までズームして確認します。鋭いエッジや屈折率の変化を確認します。結晶が確認された場合は、前述の手順を繰り返し、結晶の成長を監視するために培養液を毎日観察してください。Sf9細胞については、培養液を遠心分離管に移して回収します。チューブを氷上に置き、速やかに次のステップに進みます。結晶含有細胞を単離するため、感染させたSf9細胞4 mLをフローサイトメトリー解析に適したチューブにピペットで分注します。対照として、擬似感染（mock infected）させた培養液から同数のSf9細胞を分注した2本目のチューブを用意します。次に、フローサイトメトリーによる評価の直前に、両方のサンプルにプロピジウムヨードを最終濃度1 µg/mLとなるように添加します。続いて、FSCおよびSSCに基づいたセルソートが可能な標準的なフローサイトメーターを用いて、コントロールサンプルの細胞を解析します。少なくとも20,000イベントを解析し

microcrystallography-of-protein-crystals-and-in-cellulo-diffraction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

注文した膜タンパク質アレイの形成のために2次元（2D）の結晶化試験を評価すると、電子線結晶学における非常に重要かつ困難な作業です。 90kDa -...

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

このプロトコルでは、作製し、室温での x...

シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

本論文では、透析法とX線回折実験を用いて、オンチップタンパク質結晶化のために開発されたマイクロ流体チップの製造プロトコルについて詳しく述べる。微細加工プロセスにより、半透膜再生可能なセルロース透析膜を、チップの2層間の任意の分子量カットオフと統合することが可能になります。...

In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

ここでは、微結晶電子回折(MicroED)実験用の低分子結晶粉末を調製するために私たちの研究室で開発された手順について説明します。...

低分子の微小結晶電子回折

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

脂質単層は、構造研究のための2次元(2D)タンパク質結晶を形成するための基礎として何十年も使用されてきました。それらは空気水の界面で安定しており、電子のイメージ投射のための薄い支持材料として役立つことができる。ここでは、生物学的研究のための脂質単層を調製するための実証済みのステップを紹介します。...

電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

この寄稿では、結晶オンクリスタルデバイスでタンパク質結晶化をセットアップする方法と、オンチップ結晶化プラットフォームを使用して室温で自動シリアルデータ収集を実行する方法について説明します。...

室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

高分子の高解像度クライオEMマップは、200kV TEM顕微鏡を使用することによっても達成できます。このプロトコルは、200kV TEMを使用して高解像度データセットを正常に収集するために不可欠な、正確な光学系アライメント、データ収集スキーム、およびイメージング領域の選択を設定するためのベストプラクティスを示しています。...

200KV透過型電子顕微鏡を用いた高分解能クライオEMデータセットのルーチンコレクション

提示されたプロトコルは、96ウェルハイスループット透析プレートを使用してタンパク質結晶化条件と結晶成長をスクリーニングするための簡単なアプローチを説明しています。微結晶の大規模な成長のためのダイアライザーチューブの使用は、シリアル結晶学およびMicroEDアプリケーションでも実証されています。...

マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化

学ぶ、生細胞内でタンパク質微結晶を培養し、シンクロトロン回折実験でX線結晶解析を行う手法。複雑な精製工程を省略し、様々な生物系への応用が可能な簡便なプロトコルを解説する。

タンパク質結晶の微結晶化および

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