Name: 血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 学ぶ乳腺脂肪移植と全組織標本法を用いた血管内皮幹細胞の血管形成能評価法。この技術によりin vivoでの幹細胞特性と機能的血管統合を詳細に解析可能となる。

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この研究は、中国国立科学財団（31530045および31371500、YAZ、31401245からQCY）、中国科学技術省（2014CB964800）、中国科学アカデミー（XDB19000000からYAZ）、および中国細胞生物学会（QCYへの早期キャリアフェローシップ）。

実験手順は、承認されたプロトコールSIBCB-NAF-15-002-S335-003の下で、上海生化学および細胞生物学研究所の中国科学アカデミーのアニマルケアおよび使用委員会によって承認された。 1.マウス乳腺からのVESCの単離<ol><li> 乳腺の収穫および組織消化。 <ol><li>組織ドナーとして、8週齢のアクチン-GFP成熟処女レポーターマウスを使用し、体重範囲は20〜25gです。 注：ドナーから由来する細胞は、GFP発現によって容易に追跡することができる。 </li><li> RPMI1640中の5％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペン/ストレプ、および25mM HEPESからなる組織消化基礎培地を調製する。この混合物を0.22μmのフィルターで濾過し、滅菌し、これを水浴中で37℃に予熱する。 </li><li> CO 2チャンバー内でマウスを犠牲にする。最初に垂直の皮膚を作ることによって、第4の鼠径乳腺の対を解剖する。メスを使用して下腹部の正中線（または外科用ハサミ）でncision。静かに片側に皮を剥がし、鉗子を使って鼠径乳腺を露出させます。両側から4番目の鼠径乳腺を得、はさみを用いて6cmのペトリ皿で細かく切る。 <ol><li>細かい組織の総重量を測定し、それを50 mLチューブに入れます。 注：得られた組織の切れ端が、各部分のサイズが1 mm 3未満であることを確認してください。典型的な収量は、1匹あたり約5,000のVESCである。 </li></ol></li><li> 50mLの蓋をした遠心分離管内の消化基礎培地を組織1g当たり10mLの容量で調製する。消化緩衝液を構成するために、消化ベース培地10mL当たり300単位の濃度でコラゲナーゼタイプ3を添加する。均等に混合し、それを組織ミンスに加える。 </li><li>水平に50 mL遠心チューブをロッキングプラットフォームに置き、速度を100 rpmに、温度を37℃に設定します。かき混ぜる乳房組織を2時間インキュベートする。適切な消化を確実にするためにチューブを20分ごとに点検し、手で振る。 注：FACSに先立つ組織消化の目的は、固形細胞から単一細胞溶液を調製することです。したがって、消化の終わりまでに、内容物は目に見える組織片なしで濃厚な溶液でなければならない。 </li></ol></li><li> 単一細胞溶液調製。 <ol><li>消化後、予め加温した滅菌PBSを含む50mL遠心分離チューブを補充し、均一に混合するようにチューブを逆さにします。チューブを200×gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得る。 </li><li>上清を除去し、チューブの底を軽くたたいて細胞ペレットを緩めます。 3 mLの赤血球溶解バッファー（材料表を参照）を加え、室温（RT）で組織培養フード内で5分間インキュベートして、赤血球を除去する。 </li><li> 10mLの滅菌PBSを加え、均等に混合するようにチューブを逆さにする。組織の内容物を200 xgで5分間遠心分離し、ディスク上清を回収する。あらかじめ加温した0.05％トリプシン3 mLを添加し、37℃で5分間保存して残りの組織をさらに消化する。 </li><li> 3mLの予熱したIMDMを添加し、次に100μLのDNaseI溶液（1mLのPBSに希釈した0.25mgのDNaseI）を加える。 37℃でチューブを保存してDNAフィラメントを分解する。組織混合物を70μmセルストレーナーに通して細胞溶液を得る。 2 mLのPBS + 5％FBSでストレーナーを2回すすぎ、酵素消化を中和します。 </li><li> 200×gで5分間細胞混合物を遠心分離して細胞をペレット化する。上清を捨て、抗体染色のために1mLのPBS + 5％FBSに細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol></li><li> FACSベースのProcr + VESC分離 <ol><li>公開された慣用のプロトコール8次抗体染色にドナー乳房組織から得られた細胞混合物を供します。 注：以下の抗体を使用した：抗マウス抗マウスCD31（PECAM1）-PECY7、抗マウスCD105-APC（いずれも1μg/ mLの濃度で使用）、抗マウスCD201（Procr） - ビオチン（濃度2.5 μg/ mL）、およびストレプトアビジン-v450（0.5μg/ mLの濃度で使用）。 <ol><li>抗体染色の後、PBS + 5％FBSで細胞を補充し、次いで200gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのPBS + 5％FBSで細胞を再懸濁する。 40μmセルストレーナで濾過します。 FACSソーティングまで氷上に置く。 </li></ol></li><li> Procr + VESCを分離するためにFACSベースのソーティングを実行します。 <ol><li>染色されていないサンプルと各単色コントロールを分析して、各色の電圧を決定します。自己蛍光やバックグラウンド染色を避けるために、補正パラメータを計算します。目的の細胞集団の適切なゲーティングおよびソーティングのためのテンプレートを設定する。 </li><li> FACSソーティングの階層を確立するには、まず、全ての事象を検出し、次いで、幅を用いてトリガーすることにより、ダブレットまたは接着性細胞クラスターを廃棄する。細胞をゲートアウトし、CD31 +およびCD105 +を使用して内皮集団を定義する。 注：Procr +細胞は、FMO対照と比較してCD31 + CD105 + ECから単離された。代表的なFACS解析プロットを図1に示します 。 FACSで単離したVESC集団は、IMDM + 50％FBS中に懸濁させ、その後の処理まで氷上に保存しなければならない。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.乳房脂肪パッドを用いたインビボ VESC血管形成アッセイ<ol><li> 一次ECを移植用に準備する。 <ol><li> 10mLのPBS + 5％FBSを含むFACSソート細胞を補充し、200xgで5分間遠心分離して、細胞を底に沈降させる。 </li><li>液体を慎重に吸引し、血球計数器を用いて細胞数を数え、細胞ペレットを基底膜マトリックス混合物で再懸濁する（consi100ng / mL rmVEGFおよび60U / mLヘパリンを補充した50％基底膜マトリックスおよび20％FBSを含むPBSのスティング）を用いて15,000細胞/15μLの作業濃度に到達させた。 注：基底膜マトリックスの混合物は、常に氷上に保存する必要があります。 </li><li>最終的な注入量が合計15μLを超えないように、1.5mLのマイクロチューブで必要な入力濃度に達するように、選別および計数した細胞を連続希釈する。移植中のより良い内容の視覚化のために、各チューブに0.1％トリパンブルーを加える。ピペットで徹底的に混合する。使用するまでチューブを氷上に保管します。 注：船舶の建設が成功するには、最低100 VESCを達成する必要があります。 </li></ol></li><li> 一次ECを乳房脂肪パッドに移植する。 <ol><li>手術器具とベンチトップを消毒する。複数の動物で同じ器具を使用する場合は、ビーズ滅菌器を使用して消毒することができます。 </li><li> 3週齢のBALB / cヌードマイスを麻酔するあなたの施設の獣医師とIACUCによって推奨される麻酔プロトコルを使用してください。各マウスを仰臥位に置き、手術台に背中を置きます。粘着テープを使用して四肢を固定する。 </li><li>綿棒をヨウ素ベースの消毒液に浸す。手術前に皮膚表面を滅菌するために、マウスの腹部全体を完全に拭きます。 </li><li>鉗子でマウスの腹部の皮膚を持ち上げ、持ち上げます。外科用メスを使用して、1cmの垂直切開部を小さくします。後ろ向きにそれぞれ約0.5〜1cmの2つの切れ目を入れて、逆さまのY字型切開を達成します。 <ol><li>鉗子と綿棒を使用して、皮膚を腹部から静かに引き離し、鼠径乳腺を露出させるために皮膚を横にピン止めします。ステレオスコープの下にマウスを置き、倍率を2.0Xに設定します。乳房の脂肪パッドがはっきりと見えるように、フォーカスを調整してください。 </li></ol></li><li> 27G 1/2 &quot;ニードルを置く凍ってから冷やす。前もって基底膜マトリックス混合物を含む1mLシリンジを準備して、針取り付け領域内に捕捉された可能性のある気泡を除去する。 15μLの混合溶液をマイクロ遠心チューブのキャップにピペットで注入し、次に全量をプライミングしたシリンジに吸引します。 </li><li>鼠径リンパ節の前に乳房脂肪パッドを細かいピンセットを用いて持ち、容易に注射できるようにわずかに持ち上げます。脂肪パッドに注射針の約1/4を静かに挿入します。 <ol><li>流しパッドからピンセットを離して、注射針を握って安定させます。液体が漏れないようにゆっくりと溶液を注入してください。針を引き抜くときに漏れを最小限に抑えるために、細胞混合物が凝固していることを確認するために数秒間保持する。 </li></ol></li><li>吸収可能な縫合糸で皮膚フラップを閉じる。サイズ5-0の非反応性モノフィラメント縫合糸を使用して皮膚フラップを縫合し、外科医のスタイルの結び目で創傷を閉じ、各結び目の近似ately 0.3 cm離れている。あるいは、創傷ステープルを用いて皮膚を閉じる。 </li><li>回復のために操作したマウスを別のケージに入れる。麻酔したマウスが低体温に陥るのを防ぐために、ケージの上に加熱ランプを置きます。ケージの底に柔らかい紙と綿を置き、マウスを手術後に暖かく保ちます。 <ol><li>すべての受診者が完全に目を覚ますまで注意深くマウスを観察する。次の数日間は、すべての動物に、または施設の獣医師の指示に従って、術後鎮痛剤を先制的に適用する。創傷感染が起こる場合、承認された動物プロトコールに従って抗生物質を適用する。外科用創傷が創傷ステープルで閉鎖されている場合、創傷が完全に閉鎖した手術の10日後に創傷クリップを除去する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.顕微鏡観察のための全身組織調製<ol><li> 組織収穫 <ol><li>移植後2〜4週間で、レシピエントBALB / cを麻酔するステップ2.2.2のように、体重20g当たり0.12mLの投与量で2.5％麻酔剤の腹腔内注射を用いて、ヌードマウスに投与した。 注：陽性の血管成長は、細胞移植の2〜4週間後に検出することができます。 </li><li> 50μg/ 25gの体重の用量でisolectin-647色素の尾静脈注射でレシピエント全身循環を標識し、50μLの滅菌PBSに再懸濁する。 5〜10分の休憩を取る。 CO 2を用いてマウスを犠牲にする。 </li><li>ステップ2.2.4の後に細胞が最初に注入された乳房組織の領域を解剖する。外科用ハサミを使用する。手術用ブレードを使用して、組織を6cmのペトリ皿で約3〜4mm 3立方体にチョップします。 </li></ol></li><li> 組織消化および抗体染色のための調製。 <ol><li>コラゲナーゼIIIを補充した予め加温した消化基礎培地（ステップ1.1.2）10mLを満たした15mLの遠心チューブに組織片を消化する（10mLあたり300U）。 </li><li>速度を100rpmに設定し、温度を37℃に約1時間設定したロッキングプラットフォーム上に15mL遠心チューブを水平に置き、組織構造を緩め、過剰な脂肪細胞組織を除去する。 注：脂肪細胞は自己蛍光を生成する傾向があり、その結果、ノイズの多い蛍光バックグラウンドが生じる可能性があります。消化の終わりまでに、組織片は柔らかく曇った外観を有するべきである。最適な消化期間は、切断された組織片のサイズに依存し、従って、最良の結果を得るために調整されるべきである。組織の脈管構造はすでに蛍光標識Isolectinで標識されているため、以下の手順はすべて光から保護する必要があります。 </li><li> RTで10分間PBSで組織片を洗浄する。蛍光を保存するために、4cmのPFA（pH 7.2-7.4）を半分にした6cmのペトリ皿に慎重にピースを置くことによって、全マウント組織を固定する。ペトリ皿を置くロッキングプラットフォーム上に置き、RTで30分間組織を静かに攪拌する。 注：PFAは発癌性物質であり、注意して取り扱う必要があります。 </li><li>残りのPFAを除去し、全洗浄緩衝液（PBS中0.1％トゥイーン）で3回、各洗浄の間に10分間の間隔を置いて固定組織を3回洗浄する。 </li></ol></li><li> 全マウント組織抗体染色。 <ol><li>抗体染色バッファー中の一次抗体を2 mL遠心チューブで希釈する。一次抗体と組織を4℃で一晩インキュベートする。 注：一次抗体としてラット抗CD31（濃度10μg/ mL）またはラット抗VE-カドヘリン（CD144 / Cdh5;濃度2.5μg/ mL）を用いた。 CD31およびVE-カドヘリンの両方は、内皮細胞を認識するために使用される細胞表面マーカーである。 5x抗体染色緩衝液を500mMマレイン酸（pH7.5）で調製する。 750mM NaCl;および0.5％（v / v）トゥイーンをPBSに溶解する。新鮮な1x作業溶液を調製する場合にのみ、適切な血清容量（5％）を加える9 。 </li><li>抗体染色バッファーを取り除き、10分間隔で洗浄バッファーで全マウント組織を3回洗浄する。組織を二次抗体（ 材料表を参照）に加えて、DAPIと室温で4時間、4℃で振とうするか、または4℃で一晩インキュベートする。 注：5μg/ mLの最終濃度でDAPI（4 &#39;、6-diamidino-2-phenylindole）を使用して核を可視化します。 </li><li>洗浄緩衝液で全マウント組織を3回、それぞれ10分間洗浄する。より良い保存のために組織を脱水するために、80％グリセロールまたは80％スクロース中の組織片を一晩インキュベートする。 </li><li>個々の組織片をガラススライド上に置き、過剰な脱水緩衝液を除去する。組織をマウント媒体で覆い、カバースリップを置き、穏やかに組織を絞ってセットします。 </li><li>共焦点顕微鏡画像取得を行う。全身乳腺の場合、NA = 1.3の油性対象物で40倍の画像を取得するve。 1,024×1,024の光学セクション解像度と1.0〜1.2μmのレイヤー分離で、Zスタックのタイルスキャンを取得します。 注：正しい蛍光信号を捕捉するには、フィルタービームスプリッターを3倍ダイクロイック（TD）488/553/638に設定し、ゲイン設定をPMTゲイン600-800に設定する必要があります。以下の励起/放射源を使用すべきである：mGFP、488 / 509nmの励起/発光最大値;励起/発光極大が532 / 588nmのmTomato; Alexa-647、励起/放出極大は594/665; DAPI、励起/発光極大は350/470である。 </li></ol></li></ol>遺伝的に改変されたマウスモデルを用いた系譜の追跡<ol><li> マウスモデルを使用してProcr + VESCを検出します。 <ol><li> Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + （ Procr CreERT2と呼ばれる）ノックインマウス系統を使用する。 注：このマウスモデルでは、 CreERT2-IRES-tdTomatoカセット<sprocr 11の最初のATGコドンの後に挿入される。 <ol><li> Rosa26 mTtomatomGFP （ R26 mTmGと呼ばれる）レポーター株を用いて、内因性Procr + ECのin vivoでの運命を追跡するためのProERT CreERT2マウス11 。 GFP発現を用いて、全ての標識された内因性Procr + ECおよびそれらの子孫を同定する。 </li></ol></li><li>糖尿病の段階（5週間）中に体重25mgの体重で腹腔内に腹腔内にタモキシフェン溶液11 （10mg / mLのピーナッツ油+ 10％エタノールに溶解したタモキシフェン10mgを腹腔内に貯蔵） Procr + ECの発達的な運命を追跡するためのものです。 </li><li>ステップ3で概説した調製ステップに従って、全マウント免疫染色により標識細胞のクローン形成効率を分析する。短期（2日）および延長された期間（10ヶ月まで）。 図3を参照してください。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

血管新生アッセイは、血管動態を研究するための良好な実験的アプローチである。出生後に発症するマウス網膜血管系は、血管新生を研究する魅力的なモデルであることが証明されている12 。それが比較的接近可能であるにもかかわらず、網膜血管床内の実際の操作はむしろ困難である。これまでのところ、最もよく記述されているインビボ移植は、基底膜マトリックス塊の内部に細胞を封入し、外科的にインプラント/レシピエントマウスの側面領域に皮下注射するプラグアッセイであった。この血管形成アッセイは、埋め込み細胞の再生能および血管形成能を試験するのに有効である。しかし、植え込まれたマトリックスプラグの位置は、細胞内の比較的孤立した環境を作り出すため、最適な生理学的ニッチを提供しない。最近、サーファにフィブリンパッチを適用することにより、新しい肺血管新生モデルも開発されているマウス肺の13部位。しかし、この技術はマウスの胸腔の中で侵襲的に働くため、より一般化されたアッセイ設定で使用することが困難になるため、操作はさらに別のリスクをもたらす。 ...

発生およびホメオスタシスの間、血管の成長およびリモデリングは、臓器の成長および修復に従って忠実に起こる。血管新生は、既存の血管か​​らの新しい血管の発生を説明し、これらの動的な血管変化を媒介する主要な力とみなされる。各血管は内皮細胞（EC）の層で内張りされており、血管構造の基礎と思われる。長い間、恒常性の間にECプールが補充されるメカニズムは依然として不明であり、血管代謝回転が成熟EC増殖の結果であるか、または血管幹/前駆細胞活性の寄与であるかについて議論がなされた。直接の生理学的証拠の欠如のために、血管内皮幹細胞（VESC）の存在および細胞の同一性もまた議論の余地があった。 幹細胞の行動を確認するために使用される最も一般的なアプローチの1つは、移植計画推定上の幹細胞のレシピエントマウスへの導入。この方法は、 インビボで候補幹細胞の幹細胞の可能性を測定する。移植は、骨髄幹細胞1の研究に最初に適用され、これは造血系2の階層的特徴の確立に寄与した。内皮の分野では、側面皮膚の下に皮下に挿入された基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）プラグは、移植されたECの血管形成能力に対処するために使用される標準的なin vivo血管形成アッセイであった。 3D培養系及び移植におけるコロニー形成を含む、複数の実験方法は、潜在的なEC前駆/ VESC集団3、4、5、6を示唆しています。しかし、基底膜マトリックスに埋め込まれたECは、これは、移植された細胞の血管形成能を完全に探索するのに必要な最適なニッチ環境を提供しない。その結果、マトリックスプラグ内に形成された血管は、主に毛細管様であり、機能的に測定不可能である。 乳腺は出生後に発達し、最も堅牢な成長が思春期および妊娠中に起こる。思春期段階では、乳房上皮は急速に拡大し、周囲の血管構造の効率的なリモデリングを伴う乳房脂肪パッド全体を占有する。したがって、乳腺は、血管新生の研究のための優れたモデルを提供する。これは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管新生刺激を提供し、したがって、外因性細胞の血管新生能力を評価するための理想的な移植部位である。さらに、乳房脂肪パッドは、形成された外因性血管を宿主循環系と統合することを可能にし、さらなるf皮下移植に対する優位性を表す。 インビトロ培養および移植アッセイは、細胞集団の再生特性を調べるのに有効な方法であるが、そのようなアッセイは、細胞がそれらの天然生息地から取り除かれるにつれて可塑性を刺激することがあり、細胞が切断されると彼らの生理的環境7 。したがって、細胞運命の直接インビボ証拠を得ることは、内皮集団の行動の現在の理解を進めるための重要なアプローチである。 VESCの同定および身体系におけるそれらの特性の調査のためには、生理学的状況におけるインビボでの幹細胞の挙動を明らかにすることができるため、遺伝的運命マッピング（ すなわち、インビボ系譜の追跡）が不可欠であり、実際の幹細胞は、評価される。リネージュtraci候補VESCの長期持続（ すなわち、自己再生）および起源組織（ すなわち、分化能力）のための細胞型を産生するそれらの能力の直接的な証拠を提供する。 このプロトコルは、VESCの血管発生能力を観察するための新規の乳房脂肪パッド移植技術および系譜追跡方法を記載する。これらの技術は、現在利用可能なアッセイの欠点を克服し、VESCの幹細胞特性を最適に評価する新しい方法を提供する。これらのアプローチは、内皮集団の挙動および血管形成特性を評価し、病理学的環境内の血管細胞効力変化を決定するために使用できる効率的なツールである。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0.05% トリプシン</td></tr><tr><td>0.22 & マイクロ;m フィルターユニット</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 & マイクロ;m フィルター</td></tr><tr><td>2-メチルブタノール-2, ReagentPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>tert Amyl</td></tr><tr><td>Alcohol 222, トリブロメタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, トリブロメタノール</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &micro;mセルストレーナーBD</td><td>FAL</td><td>352350</td><td>70 &micro;m細胞ストレーナー</td></tr><tr><td>接着顕微鏡スライド</td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>ガラススライド抗</td></tr><tr><td>マウスCD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82、クローンMJ7 / 18</td><td>FACSアナログ使用1 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>抗マウス CD201 ビオチン</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>FACS analusis 用 2.5 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗マウス CD31 PE-シアニン 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82、クローン 390</td><td>FACS analusis 用 1 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz セルソーター</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>ウシ血清 アルブミン</td><td>シグマ</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 3 型</td><td>Worthington-Biochem</td> <td>#LS004183</td><td>コラゲナーゼIII</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP8</td><td>共焦点</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼ I</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>二次抗体、0.5 & micro;g / mL</td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>フロセップス</td></tr><tr><td>デュモン鉗子-マイクロ鈍いヒント</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>鉗子</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ハイクロン</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3 / Gr1 / CD11b / CD45R(B220)/ Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>FACS分析用の血統カクテル、25 & マイクロで使用。L per test</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Glycerol</td></tr><tr><td>Iscov's Modified Dulbecco's Medium</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora&nbsp; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>Isolectin-647</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;マトリックス(成長因子減少)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Mouse 系統 (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>Mouse strain (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Mouse strain&nbsp;(BALB/cヌード)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c ヌー</td><td>ドマウス</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>ProLong Gold退色防止試薬</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Mounting Medium</td></tr><tr><td>Rat anti CD144</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>for whole-mountanalysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>ラット抗 CD31-ビオチン</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>ホールマウント麻酔用、抗 CD31/PECAM1 抗体 内皮表面接着分子用、10 & micro で使用;g/mL</td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>赤血球溶解バッファー</td></tr><tr><td>ストレート/シャープ-ブラント/10cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>ファインハサミ</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>FACS分析用 0.5 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグ</td><td>マ 101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>ワックス コーティング 編組シルク (サイズ 5-0 USP (1 メートル法)、18 インチ (45 cm) BLACK on C-1 Needle)</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>縫合糸&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌ディスポーザブルスカプル</td><td>スワンモートン</td><td>#10</td><td></td></tr>メス<tr><td>ベタジン</td><td>Yifengメディカル</td><td>20160101</td><td>消毒液</td></tr></tbody></table>

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

内皮細胞（EC）は、血管構造の基本的な構築ブロックであり、適切な血管発達およびホメオスタシスを確実にするための血管成長およびリモデリングを媒介する。しかしながら、内皮系統の階層に関する研究は、アクセスを獲得し、インビボでのその行動を直接評価するためのツールがないため、依然として分かり難い。この欠点に対処するために、乳房脂肪パッドを用いて血管新生を研究するための新しい組織モデルが開発されている。乳腺は主に、思春期および妊娠を含む出生後の段階で発症し、その間に堅牢な上皮増殖が広範囲の血管リモデリングを伴う。乳房脂肪パッドは、成長する乳房上皮からの空間、マトリックス、および豊富な血管形成刺激を提供する。さらに、乳房脂肪パッドは、腹膜腔の外側に位置し、外因性細胞の血管新生能を評価するための容易に接近可能な移植部位となる。この作品はまた、効率インビボで血管内皮幹細胞（VESC）の標的とされた集団を特異的に標識するために蛍光レポーターマウスを用いるntトレースアプローチ。この系譜追跡法は、その後の組織全面顕微鏡法と組み合わせて、標的細胞およびその子孫の直接的な可視化を可能にし、増殖能力を定量化し、分化のコミットメントを運命マッピングすることができる。これらの方法を用いて、VESCを発現する二重性プロテインCレセプター（Procr）の集団が最近、複数の血管系において同定されている。新たなECおよび周皮細胞の両方を生じるProcr + VESCは、発生、ホメオスタシス、および傷害修復の間に血管新生に積極的に寄与する。全体として、この原稿は、VESCsの幹細胞特性を評価するために使用することができる新しい乳房脂肪パッド移植およびインビボ系譜追跡技術を記載している。

乳腺VESC単離： その結果の移植アッセイのための内皮集団を単離するために、成熟（8週齢）の未処理マウス乳腺をドナー材料として採取した。内皮細胞は、抗体に基づく細胞選別技術を用いて単離された。 8週齢のC57BL / 6乳腺ECにおけるVESC集団のFACS分析の代表的プロットを図1に示す（図8は 、Yu ら 8 ）。 乳腺脂肪移植： 乳房脂肪パッドは、血管新生の研究に理想的な部位を提供する。 FACSに基づく単離の後、Procr +</sup...

この研究は、顕微鏡観察のための全マウント組織調製に続く、乳房脂肪パッド移植による血管内皮幹細胞（VESC）の増殖、分化および血管形成能を評価するための新規アプローチを実証する。 インビボでのVESCの挙動を調べる系統的な追跡戦略も提示される。

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

この実験の目的は、乳腺脂肪体への移植法とそれに続く顕微鏡観察用の全層組織標本作製を通じて、血管内皮幹細胞の増殖、分化、および血管新生能を評価することです。この手法は、血管内皮幹細胞のin vivoにおける幹細胞性を最適に評価するための新たな方法を提供します。本手法の主な利点は、思春期において乳腺が、新しく形成された血管の生成および統合に適した理想的な血管新生環境を提供することにあります。これにより、移植された内皮細胞の機能評価が可能になります。この技術の意義は内皮機能の検査にとどまらず、局所的な血管リモデリングに対する血管新生因子の影響を評価することまで広げることができます。これらのアプローチは、腫瘍環境における内皮細胞集団の研究や細胞能の変異の研究など、複数の分野に適用可能な効率的なツールです。本手順の実演は、当研究室の大学院生であるWenqian Songが行います。テキストのプロトコルに従って組織消化ベースの培地を準備し、8週齢のActin-GFP成熟処女レポーターマウスを犠牲にした後、まず下腹部正中線に垂直に皮膚切開を加え、メスを用いて第4対の鼠径乳腺を切り出します。細切した組織を計量し、50 mLチューブに入れます。消化バッファーを調製するために、消化用培地10 mLあたり300 unitsのコラゲナーゼ type IIIを添加します。均一に混ぜ合わせ、細切した組織に加えます。50 mL遠心チューブをロッキングプラットフォームに水平に設置し、速度を100 rpm、温度を37 °Cに設定します。乳腺組織を2時間攪拌します。消化後、50 mL遠心チューブに予め温めておいた滅菌PBSを満たし、チューブを転倒させて均一に混ぜ合わせます。次に、チューブを200 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、チューブの底を軽く叩いて細胞ペレットをほぐします。その後、赤血球溶解バッファーを3 mL加え、室温で5分間インキュベートして赤血球を除去します。10 millilitersの滅菌PBSを加え、チューブを転倒混和して均一に混ぜ合わせます。その後、組織を遠心分離し、上清を捨ててから、あらかじめ温めておいた0.05%trypsinを3 milliliters加え、37 degrees Celsiusで5分間インキュベートして、残りの組織をさらに消化します。次に、あらかじめ温めておいたIMDMを3 milliliters加え、続いてDNase I溶液を100 microliters加えます。DNAフィラメントを分解するため、チューブを37°Cでインキュベートします。次に、組織混合物を70 µmのセルストレーナーに通し、細胞懸濁液を得ます。酵素消化を中和させるため、5% FBS添加PBSを2 mL使用して、ストレーナーを2回洗浄してください。細胞混合液を 200 ×g で5分間遠心分離します。上清を捨て、抗体染色のために細胞ペレットを 1 mL の PBS（5% FBS 添加）で再懸濁します。抗体染色後、PBS（5% FBS 添加）を加えて定量を満たし、サンプルを 200 ×g で5分間遠心分離します。その後、上清を捨て、1 mLのPBSに5% FBSを加えた溶液を用いて細胞を再懸濁します。懸濁液を40 µmのセルストレーナーでろ過します。次に、テキストプロトコルに従ってFACSによるソーティングを行い、プロテインC受容体陽性の血管内皮幹細胞を単離します。FASCソートした細胞にPBSおよび5% FBSを10 mL加え、200 ×gで5分間遠心分離して、細胞をチューブの底に沈殿させます。上清を注意深く吸引した後、血球計数器を用いて細胞数をカウントし、基底膜マトリックス混合液を用いて細胞ペレットを15 µLあたり15,000細胞になるように再懸濁します。ソートおよびカウント済みの細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で段階希釈し、最終注入量が15 µLを超えないように注意しながら、必要な導入濃度に調整します。次に、移植中の内容をより明確に視覚化するため、各チューブに0.1% trypan blueを添加します。ピペッティングで十分に混合し、使用までチューブを氷上で保存します。初代内皮細胞またはECを乳脂肪体へ移植するには、各マウスを手術台の上に仰向けに寝かせます。次に、粘着テープを用いて四肢を固定します。綿棒をヨウ素系消毒液に浸します。手術前に、マウスの腹部全体を十分に拭き、皮膚表面を滅菌させます。次に、ピンセットでマウスの腹部の皮膚を保持して持ち上げます。その後、手術用メスを用いて、1 cmの小さな垂直切開を行います。さらに、後肢に向かって長さ約0.5〜1 cmの切開を2回行い、逆Y字型の切開を形成します。ピンセットと綿棒を使用して、腹部から皮膚をそっと剥離し、鼠径乳腺を露出させるために皮膚を横にピンで固定します。次に、マウスを実体顕微鏡の下に置き、倍率を2倍に設定します。27ゲージ 1/2インチの針を氷上に置き、あらかじめ冷却しておきます。シリンジをプライミングした後、15 µLの基底膜マトリックス溶液をマイクロチューブのキャップ上にピペットで分注し、その全量をプライミング済みのシリンジで吸引します。細胞の内容物を完全に注入するため、プライミングおよび細胞の採取後、針の中に気泡が閉じ込められていないことを確認してください。精密ピンセットを使用して、鼠径リンパ節の前にある乳腺脂肪パッドを保持し、注入しやすくなるようにわずかに持ち上げます。次に、シリンジの針を脂肪体に約1/4ゆっくりと刺入します。ピンセットを脂肪体から離し、シリンジの針を固定して安定させます。液漏れを防ぐため、溶液をゆっくりと注入してください。その後、針を数秒間そのまま保持し、針を抜く際の漏出を最小限に抑えるために細胞混合物が凝固していることを確認します。5-0ガット吸収性縫合糸を用いて皮膚フラップを閉鎖し、外科結紮法（サージョンノット）で傷口を縫合します。この際、各結紮の間隔は約0.3 centimeterとします。組織を回収するために、PBSで希釈したIsolectin 647染料を尾静脈に注入し、レシピエントの体循環を標識します。5〜10分間の静置時間を設けます。テキストのプロトコルに従ってマウスを安楽死させた後、手術用ハサミを用いて、細胞を最初に注入した乳腺組織の部位を切り出します。6 cmのペトリ皿の中で、メスを用いて組織を概ね3〜4立方ミリメートルの立方体状に細切にします。次に、組織片を消化させるため、コラゲナーゼIIIを添加し、あらかじめ加温した10 mLの消化培地が入った15 mLチューブに組織片を移します。組織構造を緩め、過剰な脂肪細胞組織を除去するため、15 mL遠心チューブをロッキングプラットフォームに水平に配置し、100 rpm、37 °Cで約1時間静置します。次に、室温で10分間、PBSを用いて組織を洗浄します。次に、蛍光を保持するため、組織片を4%PFAを半分まで満たした6cmのペトリ皿に慎重に配置し、ホールマウント組織を固定します。ペトリ皿をロッキングプラットフォームに置き、室温で30分間、組織を緩やかに攪拌します。テキストのプロトコルに従って組織を洗浄し、希釈した一次抗体でインキュベートした後、染色液を除去し、洗浄バッファーを用いて組織を10分間ずつ3回洗浄します。次に、組織を二次抗体とDAPIを含む溶液で、ロッキングプラットフォームを用いて室温で4時間、または4°Cで一晩インキュベートします。本文のプロトコルに従ってサンプルを洗浄した後、より良好な保存のために組織を80% glycerolまたは80% sucroseに移し、一晩脱水させます。組織を封入し、本文のプロトコルに従って共焦点顕微鏡観察を行います。FACSを用いた細胞分離の代表的な結果をここに示します。血球系細胞をゲートアウトし、CD31陽性かつCD105陽性を内皮細胞の定義として用いた後、プロテインC受容体陽性の内皮幹細胞を濃縮しました。この共焦点画像は、移植部位におけるレシピエントの乳腺脂肪パッドを示しています。移植されたプロテインC受容体陽性内皮細胞から形成された血管は、宿主の乳腺血管系に統合され、寄与している。この図に、レシピエントの乳腺血管系を示す。レシピエントマウスへのイソレクチンの静脈内投与により、プロテインC受容体陽性内皮細胞が管腔を持つ機能的な血管を形成したことが明らかになった。習熟すれば、適切に実施することで移植の手順を5分以内に完了させることができます。処置を行う際は、術後のレシピエント動物を注意深く観察することが重要です。苦痛や感染の兆候が認められた場合は、適切なケア処置を行う必要があります。この手順に続き、細胞系譜追跡などの他の手法を実施することで、生体内でさまざまな生物学的プロセスの間に標的細胞がどのように振る舞うかを検討することができます。この技術の開発により、血管生物学分野の研究者は、生理的および病理的な両条件下における内皮細胞サブポピュレーションの分化能を探求することが可能となりました。このビデオを視聴することで、乳腺脂肪体移植と組織のホールマウント標本作成を用いて、内皮細胞集団の血管形成能を調査し、形成された血管の機能を評価する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

乳腺上皮移植の手順

自己細胞とテスト生体適合性とチタンの血液接触生体材料をシードする方法について説明する。このメソッドは、ブタ静脈cavaeに外科的に移植後数分以内に接種した内皮前駆細胞およびチタンチューブを、使用しています。この手法は、他の多くの埋め込み型医用機器に適応可能です。...

大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

血管新生は、正常組織工学におけるアプローチの鍵となります。したがって、信頼性の高い技術は、組織構築物における血管網の発達を評価するために必要とされる。ここでは、可視化し、 生体内で血管新生を定量化するためのシンプルで費用対効果の高い方法を提示する。...

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル<em&gt;インビボ</em

私たちは、超音波と内視鏡検査という2つの補完的なイメージングモダリティを使用して、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を説明するためのマトリゲルプラグアッセイについて説明します。細胞外マトリックス(ECM)模倣ゲルであるマトリゲルは、コンディショニング培地(C.M.)に分泌される血管新生因子を宿主(マウス)に導入するために使用されます。...

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

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マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

我々は、有望な血管新生単位を表し、脂肪組織由来の微小血管断片を単離するためのプロトコルを提示します。それらはインビトロ処理に必要とせず、従って、組織工学の異なる分野でワンステップprevascularizationために使用することができる、迅速に分離することができます。...

組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

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細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

本稿では、レシピエント動物の間肩甲膜白色脂肪パッドにドナーラット乳腺上皮細胞を移植する移植方法について説明する。この方法は、乳腺上皮発生に対する宿主および/またはドナーの影響を調べるために使用することができ、事前にクリアする必要がなくなり、この技術の有用性を拡張する。...

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

ここでは、カフ技術を使用してマウス頸動脈に組織工学的血管移植片を移植するためのプロトコルが提示され、血管組織再生メカニズムを調査するための適切な動物モデルが提供されます。...

カフ法 による マウス頸動脈への組織改変血管移植片の移植

この論文は、血管幹細胞の大動脈血管壁への正確な超音波ガイド下送達のためのプロトコルを提示します。この技術は、血管壁を効果的に標的とし、大動脈瘤や解剖における血管修復を促進します。...

大動脈疾患における血管修復のための精密超音波ガイド下幹細胞送達

学ぶ乳腺脂肪移植と全組織標本法を用いた血管内皮幹細胞の血管形成能評価法。この技術によりin vivoでの幹細胞特性と機能的血管統合を詳細に解析可能となる。

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

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