Name: 生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ hiPSC由来無血清胚様体（SFEB）の3D培養法。ヒト大脳皮質発生を模倣し、神経回路形成と創薬スクリーニングに応用可能な革新的なin vitroモデルを構築する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

記事を校正してくれたElizabeth Benevidesに感謝します。私たちはDrsに感謝します。ジョン・ハスマンとジーン・ブラットが彼らの有益な議論とコメントのために語った。

1.神経前駆細胞の作製<ol><li> 小分子を補充したヒトiPSC培地（材料表参照）中のγ-照射マウス胚性フィーダー（MEF）細胞層上の6ウェルプレート中の線維芽細胞およびPBMC由来のhiPSCを維持する。 注：毎日のメンテナンスは、以前に報告された手順1、16の修正版です。 <ol><li> 6ウェル組織培養グレードプレートの各ウェルに300μL/ウェルの推奨培地（製造業者のプロトコールに従って）に6×10 5個の MEFをプレートする。 </li><li> 48時間後、hiPSCを添加する前に、MEF培地を300μL/ウェルのhiPSC培地で1時間交換する。 </li><li> 37℃の水浴でhiPSCをすばやく解凍し、1mLのhiPSC培地をゆっくりと滴下します。 hiPSCと培地を15 mLコニカルチューブに移す。培地を加えて総容量を5 mLにする。 129xgで4分間遠心分離し、上清を吸引する1：1000濃度のROCK阻害剤を含む1mLのhiPSC培地中でペレットを静かに再懸濁する。 </li><li> MEF細胞層上に（典型的には30万細胞/ウェルで播種した）細胞懸濁液をプレートし、37℃、5％CO 2、湿度95％でインキュベートします。 </li><li> iPSC培養を光学顕微鏡を用いて密接にモニターする。 48時間後に、不均一な縁を有する培養物を除去し、嚢胞様になるまで増殖させるか、または光学顕微鏡下で黄褐色に見えるようにして自発的分化を最小化する。 注：7〜10日後、hiPSCコロニーが形成されるはずです。コロニーは、境界が明確に定められ、細胞密度が均一であり、緩やかに充填された不均一な細胞がない丸いものでなければなりません。 </li><li>自発的に分化した細胞の培養をクリアするために、丸いhiPSCコロニーを手動で選択する。コロニーを新鮮なMEF層に置くことによってコロニーを広げる。とき文化コンフルエントとフリーズ1、16近くに7日ごとに3：1を展開します。 </li></ol></li><li>増殖および凍結細胞（バックアップ用）の後、それらが50〜75％コンフルエントに達するまでプレート上でhiPSCコロニーを増殖させる。 </li><li> 7日間のプレーティング後、軽度の酵素処理（300μLの酵素溶液で5〜10分）および穏やかな粉砕（1000μLピペットで2〜4回）を行い、神経前駆細胞分化のためのhiPSCを採取および調製する。 </li><li> 129xgで4分間細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを5mLのヒトiPSC培地に再懸濁する。 37℃で1時間、細胞懸濁液を0.1％ゼラチンコート5cm細胞培養皿に移し、MEFを除去し、hiPSC収率を最大にする。他の5cmゼラチンコートディッシュに培地（非付着細胞を含む）を移す。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、非接着細胞を15mL遠心管に移す。 3 mL培地でプレートを静かにすすぎ、15 mLチューブに加えます。 </li><li> 129xgで4分間細胞懸濁液を遠心分離し、超遠心分離機を吸引する培地にペレットを静かに再懸濁する。自動細胞計数器を用いて細胞数を決定する。 96ウェルの低接着性のV底プレートに9,000細胞/ウェルのプレート。 </li><li>プレートを163×gで3分間遠心分離する。 37℃、湿度95％、CO 2 5％でプレートをインキュベートする。ピペットを使用して、1日おきに培地の半分を取り出し、新鮮な化学的に定義された分化培地1（DM1; 図1 ; Table of Materials）で14日間交換することにより、50％培地を交換する。 </li></ol> 2.無血清胚様体（SFEB）誘導（ 図2 ） <ol><li> 6ウェルプレートに40μmの細胞培養インサートを置き、凝集物の添加の少なくとも1時間前に1mLのDM1培地を加える。 </li><li> 14日目に、40μlの細胞培養インサート上に200μLの幅のある先端チップを用いて20μlの培地で凝集物を移し、培地をDM2に変更する。 <br/&gt;注：細胞培養インサートは、ウェルの底面から少し離れて位置する特殊なインサートで、ポリテトラフルオロエチレン膜がプラスチックフレームに吊されています。この膜は生体適合性があり、上に置かれるSFEBへの栄養素および酸素輸送を効率的に維持することができる。それらは一般にマウスまたはラット7、17、18から採取した器官型海馬スライス培養で使用されています。 <ol><li>一つの細胞培養インサートに4-6個の凝集体を移し、凝集体の間に十分な空間を確保する。微細なピペットチップ（ 例えば、 200μLチップ）を使用して、可能な限り過剰な溶液を除去する。 注：SFEBの周りから取り除かれた溶液として、細胞培養インサート上を移動するので、SFEBを短時間妨げることは許容される。 </li><li> 37℃、湿度95％、5％CO 2で1mLのDM2で培養物を維持する。ピペットを使用して、75％媒体の3/4を取り除き、3/4の新鮮な媒体に交換することによって、1日おきに培地を交換する。例えば、750μLの培地を除去し、750μLの新鮮な培地を加える。 </li></ol></li><li>培養の14日後、1日おきに、そしてさらに16日間、75％培地交換でDM3培地に切り替える。 </li><li> 30日を超えて細胞培養挿入物上のSFEBを維持するために、培地を60,90および120日間毎日交換する。 注：SFEBは直径約1,000μmまで成長し、通常100-150μmの厚さになります1 。 </li></ol> 3. SFEB組成の決定<ol><li> 200μLの広口ピペットチップを使用して、培地をゆっくりピペッティングすることにより、インサートからSFEBを分離する。 SFEBを移送するには、広い口のピペットチップを使用してピペットの先端に軽く体を吸引します。 SFEBをピペットチップにロードした後、12ウェルプレートに静かに移し、300μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）/ウェル。 注：SFEBは12ウェルプレート中の溶液中に懸濁する。これは、固定剤、ブロッキング溶液、および抗体の完全な浸透を可能にするために重要である。染色に複数のSFEBを使用する場合、12ウェルプレートの1ウェルあたり最大10のSFEBを添加することができる。これは溶液と抗体を保存します。 </li><li> 1ウェルあたり300μLの4％パラホルムアルデヒドを含むSFEBを室温で30〜45分間固定する。固定したSFEBを300μLのPBSで2回、各洗浄で3〜5分間洗浄する。 注意：パラホルムアルデヒドを取り扱う際は、適切な個人用保護具を着用してください。 注：この研究のニワトリのTuj1でニューロンをマークする成熟、細胞タイプ等を決定するためのマーカーに対する免疫反応のためのプローブが1で使用した：追加のマーカーについて、500、表2及び参考文献1、16を参照してください。 </li><li> 0.1％Triton-X100をPBSおよび10％正常ロバ血清（ブロッキング溶液;300μl; 1ウェルあたりL）で室温で1時間インキュベートした。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中の一次抗体300μLでSFEBを処理する。 4℃で一晩インキュベートする。 0.1％トリトン-Xを含む300μLのPBS中でSFEBを3回洗浄する（1回の洗浄につき3〜5分）。 </li><li>二次抗体をブロッキング溶液で1：1000に調製する。二次抗体を用いてSFEBを室温で1時間インキュベートする。 300μLのPBSでSFEBを洗浄し、それぞれ3〜5分間3回洗浄する。 注：この段階でSFEBはイメージングの準備ができます。 </li><li>画像を得るには、ワイドボアピペットを用いてガラススライド上にSFEBをピペットで入れる。静かな吸引を使用して、SFEB周囲の余分な溶液を除去する。 注：同様の染色条件では、複数のSFEBを同じスライドガラスに置くことができます。 </li><li> SFEB上に1滴の封入剤を加え、ガラスカバースリップを置き、軽く押して気泡がないことを確認します。マウントメディアを固めて、イメージングと定量に進みます（ステップ3.8）。 <br/&gt;注：マウント媒体が硬化した後、SFEBはイメージングの準備ができています。 </li><li> SFEB横切って関心領域（ROI）の複数の領域を取り、参考文献1、16に記載されているように、標準的な共焦点顕微鏡で各ROIを介して最大の投影画像と合成Zスタックを用いて、細胞の定量を行います。 注：全体SFEBsは画像ベースのタイルを（詳細は参考文献1、16を参照）を用いて定量することができます。 SFEBは約100μmまで薄いので、組織内での光の散乱が最小であり、したがって、2光子顕微鏡検査の必要性はない。線維芽細胞由来のiPS細胞でこのプロトコルの以前の用途はCGEおよび前前脳運命1、16に類似していた転写アイデンティティと介在ニューロンの亜集団で複雑かつ多様な構造を明らかにしたSFEB運命マップを生成しました。 </sup&gt; </li></ol> 4. MEAを用いたSFEBにおける神経活動の記録<ol><li>製造元の指示に従って12ウェルMEAプレートを調製する。 </li><li> MEAプレートを無菌条件下で滅菌H 2 Oで5分間3回洗浄して洗浄する。 75％エタノールで5分間洗浄し、次に100％エタノールで洗浄してプレートを滅菌する。 </li><li>プレートをオーブンで50°Cで4〜5時間反転させて滅菌処理を完了させます。 </li><li>各ウェルに500μLの0.2％ポリエチレンイミン溶液（PEI）を添加し、室温で1時間インキュベートする。 PEIを吸引し、滅菌蒸留H 2 Oでウェルを4回洗浄する。フード内で一晩空気を乾燥させる。 </li><li> L15培地中のラミニンの20μL/ mL溶液を調製し、各ウェルの中央に10μLのラミニンを添加する。 注記：周囲の参照電極と接地電極を被覆しないでください。 </li><li>培地またはラミニンの蒸発を防ぐために、周囲のリザーバに滅菌dH 2 Oを添加する。プレートを37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> SFEB（セクション1および2を参照）を、ラミニンコーティングされたMEAプレートに、それらを静かに広口ピペットチップに吸引し、それらを移すことによって添加する。各ウェルにDM2培地200μLを添加し、37℃、湿度95％および5％CO 2で一晩インキュベートする。 </li><li> 24時間後に200μLの培地を追加し、プレートを読み取る前に37℃、湿度95％、5％CO 2で30分間回復させる。 </li><li> MEAプレートをプレートリーダー（37℃に予熱）に入れ、神経活動を記録する。関連するMEAレコーディングソフトウェアで10分間活動を記録する。詳細は、参考文献19を参照してください。 </li><li>統計分析ソフトウェアを使用して、未処理のデータ連続ストリームおよびニューロン活動のラスタプロットを生成します19 。 注：MEA記録は、SFEBメッキの7日後に撮影されます。この研究のために、記録を10分間行い、ネットワークバースト活性を検出した漸進的なトレース、およびラスタプロットが含まれます。 SFEBはMEAプレート上で長期間維持することができ、環境的に制御された条件を用いて長期間にわたって記録することができます（ 図6 ）。 </li></ol>

<ol><li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+serum-free+embryoid+bodies+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks.</a> Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Song, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development+and+remapping+through+spike+timing-dependent+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity.</a> Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).</li>
<li>Pre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+course+analysis+of+the+electrophysiological+properties+of+neurons+differentiated+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs).</a> PLoS One. 9 (7), e103418(2014).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+molecular+profiling+of+PSEN1+familial+Alzheimer%27s+disease+iPSC-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors.</a> PLoS One. 9 (1), e84547(2014).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).</li>
<li>Cukier, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+of+extended+families+with+autism+reveals+genes+shared+across+neurodevelopmental+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.</a> Mol Autism. 5 (1), (2014).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Choi, S. H., Tanzi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSCs+to+the+rescue+in+Alzheimer%27s+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPSCs to the rescue in Alzheimer's research.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).</li>
<li>Yagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+Alzheimer%27s+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells.</a> Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).</li>
<li>Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promises+and+challenges+of+human+brain+organoids+as+models+of+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease.</a> Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).</li>
<li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Inducible+Pluripotent+Stem+Cells+and+Autism+Spectrum+Disorder%3A+Emerging+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Res%22%5BJournal%5D)">Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies.</a> Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).</li>
<li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+subpopulation+of+developing+cortical+interneurons+from+human+iPSCs+within+serum-free+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).</li>
<li>Nestor, M. W., Hoffman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cycling+rates+of+Kv4.2+channels+in+proximal+and+distal+dendrites+of+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).</li>
<li>Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+neuron-glial+interactions+mediated+by+astrocytic+EphARs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs.</a> J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).</li>
<li>Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-Derived+Dopamine+Neurons+Reveal+Differences+Between+Monozygotic+Twins+Discordant+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease.</a> Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).</li>
<li>Huang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+stabilizes+axin+and+antagonizes+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling.</a> Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+reprogrammed+from+human+mesenchymal-like+stem%2Fprogenitor+cells+of+dental+tissue+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin.</a> Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clinical-grade+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+Xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 223(2015).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Differentiation+of+a+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Line+%28FS-1%29+Derived+from+Newborn+Foreskin+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts.</a> Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li>
<li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells Int. , 738910(2012).</li>
<li>Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+Spatial+Interaction+Govern+Stem+Cell+Differentiation+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics.</a> Sci Rep. 5, 12617(2015).</li>
</ol>

著者には競合する金銭的利益はない。

本明細書に記載のプロトコルは、hiPSC供給源を、前頭皮質の初期発達段階を再現する3-D構造に区別するための条件を提供する。この手順は、電気生理学のために調べることができ、顕微鏡検査も受け入れやすい構造をもたらす。 SFEBの最終形態は、器官型脳スライス培養のものに似ており、高品質の詳細な共焦点イメージングを可能にする。このプロトコルは、線維芽細胞および末梢血単核細胞由来のhiPSCの両方からSFEBを首尾よく生成することができる。末梢血単核細胞由来hiPSCから作製されたSFEBは、線維芽細胞由来hiPSCから作製されたSFEBと類似の形態学的特徴を示す。 このプロセスは、他の3-Dスキームと同様に、小分子の細胞外手がかりを用いて細胞運命の決定を導く。これは、細胞間接触の固有の特性と組み合わされ、より現実的なネット環境を作り出します仕事の形成と神経の機能。他のレポートは、小分子の細胞外シグナルの適切な組み合わせは、中脳ドーパミン作動8、22、及び皮質介在ニューロン...

私たちはこれまで、ヒト由来の多能性幹細胞（hiPSCs）由来の患者由来の3次元モデルシステムを報告しましたが、これは早期皮質ネットワーク開発のいくつかの側面を再現しています1 。この3-Dモデル、無血清胚様体（SFEB）は、以前の単純な集約hiPSCモデル2,3に向上します。仕事の成長体は、5 /単層hiPSCモデル4私達のSFEBsような3-D構造が、神経発生のおおよその態様は、一般的にインビボおよび2次元（2-D）で観察されるより前の時点で観察されたことが明らかにされています。初期の研究は、生理学的複雑性2を示さずに3次元物体の自己組織化の複雑さに焦点を当てている2 。 本明細書に記載のプロトコルは、線維芽細胞由来の未分化hiPSCおよび<html>末梢血単核細胞（PBMC）である。これらの細胞はγ線照射マウス胚性フィーダー（MEFs）上で維持される。これらのhiPSCコロニーを、自然に分化した細胞を手動で洗浄し、酵素的に採取し、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632（ROCKi）を含有する培地中に再懸濁する。未分化hiPSCを解離および遠心分離に供してから、96ウェルの低接着V底プレートに移す。プレーティング後、前頭前野前脳ニューロン運命系統6を駆動するために、二重SMAD阻害（SB431542およびdNK193189とDickkopf1（DKK-1））を用いて神経誘導を開始する。 14日後、SFEBを6ウェルプレートの細胞培養インサートに移す。一旦移されると、丸いSFEBは、同様の細胞培養インサート1を用いて海馬の器官型スライス培養物調製物でしばしば観察されるように、局所ネットワーク接続を維持しながら、広がり始め、ss = &quot;xref&quot;&gt; 7。 この形式のSFEBに基づく3Dプラットフォームの使用は、カルシウムイメージングまたは電気生理学的アッセイ（例えば、単細胞記録または多電極アレイ（MEA）などの細胞ベースの生理学的アッセイを用いて調べることができる皮質ネットワークの効率的な産生に適している。 ） 1 。 3-Dシステムは早期皮質発達のマーカーを担っているが、他の研究では、これらの3-D体は本質的に遅いヒト組織発生のペースを可能にするためにより長いインキュベーション時間を必要とすることが示されている8 。このSFEBプロトコルは、皮質の初期発生の局面を捕捉する未分化hiPSCからの3-D SFEBを首尾よく生成する。 神経学的障害におけるネットワーク異常をモデル化するためのSFEBの可能性は、このシステムの強みである。患者の組織由来のhiPSCsは、お尻になる神経系の細胞に成長することができます細胞生物学および付随する遺伝子発現に関するものである。ヒトiPS細胞は、自閉症スペクトラム障害（ASD）、統合失調症9、レット症候群10、およびアルツハイマー病11、12のような複雑な病因を有する神経障害を変化させ、個人の大きなグループの遺伝子プロファイルを確認するために使用されています。最近まで、iPSCモデルは、典型的には、分子相互作用の評価に堪能ではあるが、インビボで見られる複雑な細胞相互作用を解読するには不十分な単層調製物であった。動物モデルは、全臓器プラットフォームを再現するためのデフォルトの代替物である。これらの動物モデルは、所見の翻訳の貧弱さに悩まされ、大規模な遺伝子スクリーニング研究によって同定されたヒト遺伝子プロファイルを複製する能力が限られている。従って、iPSCからの3-Dシステムの開発は、人間に必要な複雑さの層を加える疾患モデル13、14。 3D hiPSCプラットフォームの次のステップは、細胞ベースのアッセイを用いたハイスループットスクリーニングの大規模要件に対応することです15 。

<table><tbody><tr><td>SFEBニューロン分化細胞培養培地。試薬。コンポーネント&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM MEDIUM (MEF Media)</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>名義</strong</td><td>>会社&nbsp;</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>DM1 培地コンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x)、グルタマックス液、1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 10 mM (100x)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (1,000x)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td>900 &mu;L</td></tr><tr><td>名</td><td>会社&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>DM2 培地コンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x)、グルタマックス液、1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>グルタマックス 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>15140122</td><td></td><td>5 mL</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;<</td><td>strong>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>DM3 培地成分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL 培地 (1x)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント マイナスビタミン A (50x)、液体</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>グルタマックス 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>Small Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チアゾビビン</td><td>ステムジェント</td><td>04-0017</td><td>2 &mu;M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1,000 (10 &mu;M)</td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>ステムジェント</td><td>04-0024</td><td>1 &mu;M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &mu;M</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>組換えプロチエンス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>コンポーネント/材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Cultureインサート0.4 &mu;M、直径30mm</td>の<td>ミリセル</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞GlobalStem</td><td></td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルV底、蓋付き、</td><td>エバーグリーン</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemProアキュターゼ細胞解離試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td>サー<td>モフィッシャー85111</td><td>リン酸</td><td></td></tr><tr><td>緩衝生理食塩水(PBSの)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DRAQ5 (Nuclear Marker)</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>MEA Plates</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6 well flat bottom</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>会社&nbsp;</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Calretinin</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R&Dシステム</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>TBR1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-d幹細胞培養物の調査のためのhipsc由来の無血清胚様体の開発

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

hiPSCsを使用して多数のin vitro疾患モデルが開発されているが、これらの2次元（2D）システムは、疑わしい疾患の変異を有する罹患者の基礎的な細胞構造および機能の複雑さを表さない可能性がある。従来の2次元モデルは、インビボのような構造の不完全な表現であり、脳の複雑さを適切に捕捉しない。したがって、 in vivo系で見られる細胞相互作用および機能をよりよく再現できる、より多くの3-D hiPSCベースのモデルが必要となっている。 ここでは、無血清胚様体（SFEB）に基づく未分化hiPSCからの3-D系を開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、発達中の腹側新皮質の局面を反映しており、泳動、接続性、通信およびマットのような生きた神経細胞およびインタクトな組織に不可欠な機能への研究を可能にする期間。具体的には、本発明者らのプロトコールを用いたSFEBは、カルシウムイメージング、および凍結切除なしの多電極アレイ（MEA）記録のような生理学的に関連した高含量細胞ベースのアッセイを用いて調べることができることを示す。 MEA記録の場合、我々はSFEBが長期間の培養中にスパイク活性およびネットワークレベル破裂活性の両方を増加させることを示す。このSFEBプロトコルは、早期皮質発達の局面を捕捉する3-Dモデルにおけるネットワーク形成の発展の研究のための堅牢でスケーラブルなシステムを提供する。

本発明者らの技術を用いて増殖させたSFEBは、初期の発達中の皮質下脳室ゾーンに類似した形態学的特徴を有する組織をもたらし、広範囲のTuj1陽性ニューロンならびに神経前駆細胞（ 図3A ）が充満した。 SFEBの外層および内層には、数多くの発育中の皮質のロゼットが観察された（ 図3B ）。 SFEBの外縁は、分裂終了ニューロンを含む発達中の皮質プレートに似ている。これは、最も腹側の外側皮質層における神経前駆細胞のマーカーであるBrn2の発現によって支持される。発達中の皮質の外層で発現されるCajal-Retzius細胞またはそれらの前駆細胞であり得るリーリン陽性細胞も、SFEBにおいて観察される（ 図3C ）。このプロトコルを使用して増殖させたSFEBは、混合尾部（CGE）および内側神経節と一致するマーカーを発現するnic eminence（MGE）起源です。 CGEマーカーCouptf2およびM...

ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

ヒトiPSCを用いた3D無血清胚様体の作製に関する本プロトコルの全体的な目的は、創薬に利用可能な、ヒト初期皮質発達を近似したインビトロシステムを提供することです。この手法は、iPSCからニューロンがどのように分化し、3D組織内で機能的なネットワークを形成するかといった、幹細胞分野における重要な疑問への解答に寄与します。本技術の主な利点は、疾患患者の遺伝情報を持つヒト組織を用いて、皮質発達の側面をディッシュ上でモデル化できることです。したがって、本システムは、スケーラブルであり、多くの異なる神経生物学的疾患の研究に利用可能な、細胞ベースの薬剤スクリーニングプラットフォームとして機能します。この手法は神経生物学的または神経発達障害への洞察をもたらすだけでなく、神経免疫機能や神経情報のモデルに焦点を当てた他の系にも適用可能です。本プロトコルでは、まず胎児細胞の確立から開始します。この培養を確立するために、6ウェルプレートの各ウェルに胎児細胞を600,000個、培地300 millilitersと共に播種します。胎児細胞を48時間培養した後、培地を交換します。幹細胞の準備を行う間、プレートを1時間インキュベートします。37 °Cのウォーターバスで幹細胞を融解します。解凍後、細胞を15 milliliterのコニカルチューブに移し、培養液を滴下して5 millilitersまで満たします。次に、細胞を4分間緩やかに遠心分離し、上清を吸引除去して、ROCK inhibitor含有幹細胞培地1 milliliterでペレットを緩やかに再懸濁します。細胞密度を定量した後、300, 000個の幹細胞をフィーダー細胞上に播種します。その後、培養物を増殖・拡大させ、定期的に健全な細胞を選択し、拡大後にバックアップとして細胞を凍結保存します。幹細胞コロニーを標準プレートで50%から70%のコンフルエンスに達するまで培養します。次に、緩やかな酵素処理と1mLピペットチップによる穏やかなトリチュレーションを行い、神経前駆細胞分化に向けてhiPSCを回収します。懸濁液を緩やかに遠心分離し、上清を吸引除去した後、ペレットを5 mLのヒトiPSC培地で再懸濁します。次に、細胞懸濁液を0.1%ゼラチンコートした5 cm細胞培養ディッシュに移し、プレートを1時間インキュベートします。1時間後、非接着細胞を15 mL遠心チューブに移します。次に、プレートを3 mLの培地で穏やかに洗浄し、同じチューブに移します。続いて、緩やかな遠心分離による再懸濁ステップを繰り返し、細胞密度を測定した後、低接着V底96ウェルプレートに1ウェルあたり9,000 cellsの密度で細胞を播種します。その後、プレートを3分間遠心し、細胞の培養を開始します。その後14日間、1日おきに培地の半分を新鮮な分化培地1（DM1）に交換します。2週間の細胞培養後、40 µmのセルカルチャーインサートと1 mLのDM1培地を入れた6ウェルプレートを準備します。培養細胞を播種する前に、これらのプレートを少なくとも4時間インキュベートします。次に、200 µL用広口ピペットチップを使用して、培地約20 µL分に相当する培養2週目の細胞凝集塊を回収します。溶液を最小限にして、各インサートに4〜6個の凝集塊を移し、余分な溶液を除去します。このステップでは、迅速かつ慎重に作業することが重要です。SFEBの周囲から培地を除去する際、表面張力によってSFEBが溶液中を移動することがあります。培地を除去した後に、それらを再配置しても構いません。すべての凝集体をインサートにロードしたら、培地を1 mLのDM2に交換し、1日おきに細胞の培養を継続します。培地の4分の3を新鮮な培地と交換してください。14日間の培養後、培地にDM3 mediumを添加し始めます。さらに16日間培養を継続し、SFEBを成長させます。次に、200 µLのワイドマウスピペットチップを使用して、インサートからSFEBを穏やかに回収します。SFEBを12ウェルプレートに移し、1ウェルあたり4〜8個ずつ分注します。その後、テキストプロトコルの記載に従って染色を行います。12ウェルプレートおよび8枚のプレートを準備するために、まず滅菌水で3回洗浄してください。次に、75% ethanolで1回、さらに100% ethanolで1回洗浄します。その後、滅菌工程を完了させるため、プレートを逆さまにして50 °Cで4〜5時間ベーキングします。ベーキング後、各ウェルに0.2% PEI溶液を500 µLずつ加え、プレートを室温で1時間静置します。次に、PEIを吸引し、滅菌蒸留水でウェルを4回洗浄して、一晩風乾させます。翌日、L15培地で新鮮なラミナントを調製し、各ウェルの中央に10 µLずつ添加します。その後、蒸発を防ぐために周囲のリザーバーに蒸留水を加え、プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。ラミナントを電極の中心に配置するように照射してください。この際、接地電極の範囲を超えないよう注意してください。範囲を超えると、ニューロンが接地電極の上に成長し、ノイズアーチファクトが発生して記録の忠実度に影響を及ぼします。次に、広口ピペットを用いて穏やかに吸引し、準備したSFEBを各ウェルに1つずつ添加します。その後、各ウェルに200 microlitersのDM2を加え、プレートを一晩培養します。その後、神経活動を記録するために、プレートリーダーにプレートをセットします。37 °Cに予熱してください。次に、ソフトウェアを使用して、各ウェルから10分間の活動を記録します。記載の方法を用いてSFEBを培養したところ、広範なTuj1陽性ニューロンおよび神経前駆細胞を豊富に含む、発達初期の皮質脳室下帯に類似した形態学的特性を持つ組織が得られた。組織の外層および内層において、多数の発達中の皮質ロゼットが観察された。組織の外縁は、ポストミトーティック・ニューロンを含む発達中の皮質板に類似しており、これは神経前駆細胞および最も腹側化した外側皮質層のマーカーであるBrn2の発現によって裏付けられている。外層には、カジュアル・グラッツェル細胞またはその前駆細胞である可能性のあるReelin陽性細胞も含まれています。また、これらの細胞体は、側方および内方神経節隆起の混合的な起源と一致するマーカーを発現していました。これは、cooked TF2およびNkx2.1マーカーの発現に基づいています。培養されたSFEBからは、CalRおよびCalB陽性の介在ニューロンが産生されます。同様に、VGLUT陽性の興奮性ニューロンおよびTbr1陽性のグルタミン酸作動性神経前駆細胞も産生されます。他の報告と一致して、細胞体の61%がVGLUT陽性であり、43%がTbr1陽性でした。細胞体から得られたMEM記録は長時間にわたって行うことができ、その記録によって皮質ネットワークレベルのバースト活動の発達が示されました。このビデオを視聴することで、ヒトiPSCからSFEBを分化させる方法、NSFEBを用いて発達中の皮質ロゼットの神経細胞コンテンツを特性評価する方法、および成熟したSFEBに対して神経生理学的アッセイを実施する方法について十分に理解できるはずです。一般的に、この手法に不慣れな方は、iPSCの挙動や、培養中でiPSCがニューロンへと分化する過程について必要な科学的知見を習得するまでに時間と練習を要するため、苦労する可能性があります。培養細胞は毎日観察する必要があります。本手順に続き、薬剤投与が皮質ネットワークの振動にどのような影響を与えるかといった追加の疑問を解消するために、カルシウムイメージングなどの他の手法を実施することが可能です。

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ビデオバイオインフォマティクスは、自動処理、分析、理解、および顕微鏡ビデオから抽出した生物学的な時空間データのデータマイニングです。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を測定するための方法を示すことです。...

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

この作品の詳細3Dフィブリンの調製は、培養およびplutipotent幹細胞を区別するための足場。このような足場は、同様の薬物送達システムを含むように修正された幹細胞の挙動に及ぼす種々の生物学的化合物の作用をスクリーニングするために使用することができます。...

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

ビデオでは、さまざまな無血清分化培地またはDMを使用して、ニューロン前駆細胞から無血清胚体(SFEB)を開発する手順について説明しています。DM-2はニューロンの成熟と配置を促進してSFEBを形成し、DM-3はさらなる成長維持に使用されます。...

無血清胚様体の開発と維持

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

増殖と分化に生体材料の剛性の影響を調査するため、オリゴペプチド、接木されたさまざまな剛性とポリビニル アルコール co...

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。...

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。...

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

オルガノイドは、疾患モデリングのための貴重なツールとなっています。細胞外マトリックス(ECM)は、オルガノイド生成中の細胞運命を導き、天然組織に似たシステムを使用することで、モデルの精度を向上させることができます。この研究では、動物由来のECMとゼノフリーのハイドロゲルにおける人工多能性幹細胞由来ヒト腸オルガノイドの生成を比較しています。...

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。...

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

学ぶ hiPSC由来無血清胚様体（SFEB）の3D培養法。ヒト大脳皮質発生を模倣し、神経回路形成と創薬スクリーニングに応用可能な革新的なin vitroモデルを構築する手法です。

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

さらに動画を探す