生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

3D ヒト iPSC 無血清胚体に対するこのプロトコールの全体的な目標は、ヒトの初期皮質発生に近似するインビトロシステムを提供することであり、これを創薬に使用できます。この方法は、ニューロンがiPS細胞からどのように派生し、3D組織で機能ネットワークを形成するかなど、幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、罹患した個人の遺伝学を含むヒト組織から、皿の中の皮質発達の側面をモデル化できるため、このシステムは、スケーラブルで多くの異なる神経生物学的障害を研究するために使用できる薬物スクリーニングのための細胞ベースのプラットフォームとして機能することです。

この方法は、神経生物学的または神経発達障害に関する洞察を提供するだけでなく、神経免疫機能や神経情報のモデルに焦点を当てたシステムなど、他のシステムにも適用できます。このプロトコルでは、胎児細胞を確立することから始めます。この培養を確立するために、600, 000個の胎児細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、ウェルあたり300ミリリットルの培地を使用します。

胎児細胞を48時間培養した後、培地を交換します。プレートを1時間インキュベートしながら、幹細胞を調製します。幹細胞を摂氏37度の水浴で解凍します。

解凍したら、細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、チューブを5ミリリットルに培養液で満たし、滴下します。次に、細胞を4分間穏やかに遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをROCK阻害剤を含む幹細胞培地1ミリリットルに穏やかに再懸濁します。細胞密度を定量化した後、300, 000個の幹細胞をフィーダー細胞に播種します。

次に、培養物を増殖および拡大し、定期的に健康な細胞を選択し、増殖およびバックアップのために細胞を凍結します。幹細胞コロニーを標準プレート上で、50%から70%のコンフルエントに達するまで成長させます。その後、軽度の酵素処理と1ミリリットルのピペットチップによる穏やかなトリチュレーションを使用して、神経前駆細胞の分化のためのhiPSCを回収します。

懸濁液を穏やかに遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを5ミリリットルのヒトiPS細胞培地に再懸濁します。次に、細胞懸濁液を0.1%ゼラチンでコーティングした5cmの細胞培養皿に移し、プレートを1時間インキュベートします。1時間後、非接着性細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

次に、プレートを3ミリリットルのメディウムでやさしくすすぎ、同じチューブに移します。次に、穏やかな遠心分離で再懸濁ステップを繰り返し、次に、細胞密度を決定し、細胞を96ウェル、低接着Vボトムプレートに9、000細胞/ウェルでプレートします。次に、プレートを3分間回転させ、細胞の培養を開始します。

次の14日間で、1日おきに半分の培地を新鮮な分化培地と交換します。細胞を培養してから2週間後、40ミクロンの細胞培養インサートと1ミリリットルのDM1培地を含む6枚のウェルプレートを調製します。これらのプレートを少なくとも4時間インキュベートしてから、培養細胞を添加してください。

次に、200マイクロリットルの広口ピペットチップを使用して、約20マイクロリットルの培地に相当する2週間前の細胞凝集体を回収します。最小限の溶液で各インサートに4〜6個の骨材を移し、余分なものを取り除きます。このステップでは、SFEBの周囲から媒体を取り出しながら、表面張力によりSFEBが溶液を横切って移動することがあります。

メディアを取り外した後、それらを再配置しても問題ありません。すべての凝集体がインサートにロードされたら、培地をDM2の1ミリリットルに変更し、1日おきに細胞の培養を続けます。メディウムの4分の3を新しいメディウムと交換します。

14日間の培養後、DM3培地を培養物に加え始めます。さらに16日間培養を続けて、SFEBを成長させます。次に、200マイクロリットルの広口ピペットチップを使用して、SFEBをインサートからそっと取り外します。

SFEBを12ウェルプレートに移し、ウェルごとに4〜8枚をロードします。次に、テキストプロトコルでアウトラインとして染色します。12ウェルと8プレートを準備するには、まず滅菌水で3回洗います。

次に、75%エタノールで一度洗い、もう一度100%エタノールで洗います。その後、50°Cで4〜5時間逆さまに焼き、滅菌完了です。ベーキング後、各ウェルに500マイクロリットルの0.2%PEI溶液を加え、プレートを室温で1時間放置します。

次に、PEIを吸引し、滅菌蒸留水でウェルを4回洗浄し、一晩風乾します。翌日、L15培地で新鮮なラミネートを調製し、各ウェルの中央に10マイクロリットルを追加します。次に、蒸発を防ぐために周囲の貯留層に蒸留水を加え、プレートを摂氏37度で1時間インキュベー

このスペースを超えると、ニューロンが接地電極の上に成長し、ノイズアーチファクトを引き起こし、記録の忠実度に影響を与えるため、接地電極のスペースを超えないように注意して、電極の中央にラミネートをビームするようにしてください。次に、準備したSFEBを1つずつ、ワイドボアピペットで優しく吸引して各ウェルに加えます。次に、200マイクロリットルのDM2を各ウェルに加え、プレートを一晩培養します。

後で、神経活動を記録するために、プレートリーダーにプレートを入れます。摂氏37度に予熱します。次に、ソフトウェアを使用して、各ウェルからの10分間のアクティビティを記録します。

SFEBは、記載された方法を使用して増殖させ、広範なTuj1陽性ニューロンと神経前駆細胞で満たされた早期に発達する皮質脳室下ゾーンに似た形態学的特性を持つ組織を生み出します。多数の発達中の皮質ロゼットが体の外層と内層に観察されました。体の外縁は、有糸分裂後ニューロンを含む発達中の皮質板に似ており、これは、神経前駆細胞のマーカーであり、最も腹側にある外側皮質層であるBrn2の発現によって支えられています。

外層は、カジュアルグラッツェル細胞またはその前駆細胞である可能性のあるリーリン陽性細胞も含んでいます。また、遺体は、コダルと内側神経節の混合の起源と一致するマーカーも発現していました。調理されたTF2およびNkx2.1マーカーの発現に基づいています。

培養SFEBは、CalR陽性ニューロンとCalB陽性ニューロンの両方で収量を示します。また、VGLUT陽性興奮性ニューロンとTbr1陽性グルタミン酸作動性神経前駆細胞も検出します。他の報告と同様に、体内の細胞の61%がVGLUT陽性で、43%がTbr1陽性でした。

体から作成されたMEM記録は、長期間撮影することができ、記録は皮質ネットワークレベルのバーストの発達を示しました。このビデオを見た後、ヒトiPS細胞からSFEBを成長させる方法、NSFEBsを用いた懲罰的発育皮質ロゼットの神経含有量を特徴付ける方法についてよく理解できるはずです。成熟したSFEBで神経生理学的アッセイを実行します。

一般に、この方法に不慣れな人は、iPS細胞の挙動とiPS細胞がニューロンを培養に到着させるために必要な科学分野を開発するのに時間と練習が必要なため、苦労する可能性があります。培養細胞は毎日監視する必要があります。この手順に続いて、カルシウムイメージングなどの他の方法を実行して、薬物治療が皮質ネットワークの振動にどのような影響を与えるかなどの追加の質問に答えることができます。