光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測

これらの方法の全体的な目標は、低分子干渉RNAを介した遺伝子サイレンシング効率の予測を不可能にし、結果として生じるタンパク質発現レベルの制御を空間時間的に容易にすることです。この手法により、構造、機能関係、刺激応答性送達媒体を解明することができます。結合と放出をより適切に制御することで、翻訳可能なプラットフォームや創薬、さらには再生医療技術を解き放つことができます。

この技術の主な利点は、遺伝子発現の変化を単純なsiRNA放出アッセイとキネティックモデリングとしてベース上で制御および予測できることです。これらの方法は新しい光応答性ポリマーを採用していますが、この一連のアッセイは、他のさまざまな刺激応答性システムの試験に容易に適合させることができます。まず、pH 6の20マイクロモルHEPES溶液にsiRNAを添加することにより、32マイクログラム/ミリリットルのsiRNA溶液を調製します。

次に、溶解したmPEGブロックpolyAPN BMAポリマーをpH 6の20ミリモルHEPES溶液に添加してポリマー溶液を調製します。1ミリリットルあたり220マイクログラムの濃度を達成するためには、この濃度はN対P比が4となり、ポリマーにはsiRNA上のリン酸基の4倍のアミン基が存在することになります。次に、ボルテックスマシンで穏やかに混合しながら、ポリマー溶液を等量のsiRNA溶液に滴下します。

ポリマー添加後、30秒間ボルテックスを続けます。その後、サンプルを暗所で室温で30分間インキュベートします。STS溶液を各ナノキャリア溶液に滴下しながら、ボルテックスマシンで穏やかに混合します。

SDS編集後、30秒間渦巻き続けます。サンプルを3, 000Gで5秒間遠心分離し、次に、室温で30分間サンプルを暗所でインキュベートします。365ナノメートルフィルターを使用したUVレーザーをキャリブレーションし、1平方メートルあたり200ワットの強度に設定します。

次に、ゴム製のガスケットに穴を開け、洗浄して乾燥させたスライドガラスの上にゴム製のガスケットを置きます。ナノキャリアSDS溶液をゴム製ガスケットの穴の内側のスライドガラスにピペットで移します。ゴム製ガスケットとの接触を避けながら、スライドガラスに過剰な溶液を充填します。

2 枚目のスライドガラスをスライドガスケットの上に置きます。気泡の発生を防ぐために、スライドの一方の端を最初に下に置き、次にもう一方の端をゆっくりと下げます。ガラスチャンバーの両側にバインダークリップを取り付けて、ガラスチャンバーをしっかりと保持します。

UVレーザーと365ナノメートルフィルターを使用して、1平方メートルあたり200ワットの強度でサンプルを所望の時間照射します。バインダークリップを取り外し、チャンバーを開きます。次に、照射したナノキャリアSDSサンプルの25マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにピペットで移します。

溶液を暗所で室温で30分間インキュベートします。各ナノキャリアSDSサンプルの25マイクロリットルに5マイクロリットルのローディング緩衝液を加えます。サンプルを暗所で室温で10分間インキュベートします。

次に、各ナノキャリアSDSサンプルの30マイクロリットルを、臭化エチジウムで事前に染色した2%アガロースゲルにロードします。ゲルを暗闇で100ボルトで30分間泳がせます。エチジウムブロマイドフィルターを備えたゲルイメージングシステムを使用して、ゲルをイメージングします。

ゲル画像ファイルを保存し、テキストプロトコルで説明されているように、曲げ強度の定量化に進みます。両面接着剤スペーサーから紙片を取り出して、接着剤の表面を露出させます。スペーサーをガラスカバースリップに取り付けます。

ナノキャリアSDS溶液をカバースリップにピペットで移します。次に、事前に洗浄したスライドガラスをカバースリップの上に置き、接着剤スペーサーからの穴をサンプルの中央に配置します。スライドガラスを押して、スライドガラスとカバースリップがしっかりと取り付けられ、シールを形成していることを確認します。

FCS測定には、40倍の水浸型アペルクロマル対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用し、開口数が1.2です。適切な励起レーザーチャンネルを使用して、サンプルごとに10秒ずつの測定値を少なくとも30回収集します。次に、FCSからのsiRNA放出データを速度論モデルに入力して、テキストプロトコルに詳述されているように、遺伝子サイレンシング応答を予測します。

in vitro siRNA導入を調製するには、まず6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を添加します。細胞を接着させ、インキュベーター内で24時間回復させます。リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄した後、1.5ミリリットルの血清と抗生物質を含まないトランスベクション培地を添加して、トランスベクション用に細胞を準備します。

次に、各ウェルに30ピコモルのsiRNA tpを含む25マイクロリットルのナノキャリア溶液を加えます。培地を静かにピペットで上下させて混ぜます。細胞をインキュベーターに3時間置きます。

トランスベクション培地を取り出し、各ウェルをPBSで洗浄します。次に、1ミリリットルのサプリメント増殖培地を加え、細胞をインキュベーターに入れて30分間回復させます。光刺激による治療のために細胞を準備するには、補充した増殖培地を取り出します。

次に、各ウェルに1ミリリットルのトランスベクション培地を加えます。テキストプロトコルに記載されているようにUVレーザーをキャリブレーションした後、セルを摂氏37度に設定されたホットプレートに置きます。6ウェルプレートからカバーを取り外します。

200ワット/平方メートルの強度で365ナノメートルフィルターを備えたUVレーザーを使用して、プレートの上から細胞を所望の時間照射します。トランスベクション培地を取り出し、2ミリリットルのサプリメント増殖培地を追加します。さらなる分析が行われるまで、細胞をインキュベーターに入れます。

365ナノメートルの光を完全に遮断し、反射を最小限に抑えるフォトマスクを準備するには、まずフォトマスクに目的の形状をカット、パンチ、および/または機械加工します。フォトマスクを6ウェルプレートの底に接着し、パターンを細胞を含むウェルの中央に置き、反射防止面をプレートに向けます。約25メートル間隔で2つのリングスタンドを設置し、各リングスタンドにプラットフォームを取り外して、プラットフォームの高さが等しくなるようにします。

セルプレートをプラットフォームの上に置き、2つのスタンドの間にセルプレートを吊り下げます。365ナノメートルフィルター付きのUVレーザーを使用して、サンプルの下から細胞を200ワット/平方メートルの強度で所望の時間照射します。トランスベクション培地を取り出し、2ミリリットルのサプリメント増殖培地を追加します。

その後、細胞をインキュベーターに入れて、少なくとも24時間回復させます。前述のように、蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化します。ここに示されているのは、遺伝子サイレンシングダイナミクスの簡単な速度論モデリングの例です。

このモデルは、光誘起siRNA放出後の時間の関数として、mRNA、タンパク質、およびsiRNAの濃度を予測するために実行されました。異なる光量の後に放出されるsiRNAの相対量を、速度論モデルの初期siRNA濃度として入力しました。結果として得られたタンパク質発現レベルのモデル予測は、ウェスタンブロッティングによって得られた実験的に決定された発現レベルと一致していました。

可視化のために、GFP発現細胞をsiRNAを標的とするGFPで処理し、照射前にプレート上に環状フォトマスクを装着して環状パターンを作製しました。光から保護された細胞は、siRNAおよび光で処理されていない対照サンプルと区別がつかない蛍光強度を示しました。しかし、環状パターン内のほぼすべての細胞はGFP発現を示さず、効率的なsiRNAの放出と遺伝子のノックダウンを示しています。

さらに、光の使用は、細胞の長さスケールで制御されるトリガー可能な遺伝子発現です。要約すると、この方法により、siRNAの放出を時空間的に制御し、遺伝子サイレンシングを先験的に予測するための照射条件を迅速に決定できます。このプロトコルを採用することで、ナノキャリアの安定性と有効性を支配する構造機能関係を解明することができます。

この技術により、遺伝子発現の時空間制御を必要とする再生医療への応用が可能になると考えられます。これらの製剤は、皮膚がんなどの限局性障害や皮膚疾患の治療にも適しています。