中規模のショウジョウバエプロテオーム実験のための胚抽出物

この実験の全体的な目標は、中規模でショウジョウバエ胚を収集するための簡単で安価なアプローチを提供することです。また、アフィニティー精製質量分析などのダウンストリームプロテオミクスアプリケーションで使用できるタンパク質抽出物を調製します。この方法は、細胞シグナル伝達と発生生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、特定のタンパク質、タンパク質の相互作用が、生物の発生中に細胞コミュニケーションをどのように行うかなどです。この技術の主な利点は、ショウジョウバエの胚溶解を生成するための簡単で安価な方法であることです。これは、タンパク質アフィニティー精製などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

伝統的に、研究者は非常に大きな集団ケージでショウジョウバエの胚を収集していました。しかし、私たちは、どの研究室でも簡単に設置できる中型のケージに胚を収集するためのユーザーフレンドリーな手順を提示します。5リットルの容器を準備し、25 x 25センチメートル四方のナイロンメッシュをカットした後、テキストプロトコルに従って、メッシュを容器の上に置き、蓋で押し下げます。

メッシュがしっかりと締まり、蓋が傾いていないことを確認します。これで、ケージにハエを飼う準備が整いました。1リットルのプラスチックジャーと18 x 18センチメートルのナイロンメッシュスクエアを準備した後、メッシュをジャーの上部の縁に置き、蓋をねじ込んで締めます。

メッシュがしっかりと締まっていて、蓋が傾いていないことを確認してください。トランスジェニックフライラインを増幅し、目的の型指定されたタンパク質を運びます。そして、各フライラインに25〜30本のボトルが蓄積されるまで、2日ごとにボトルを移します。

同様の方法で制御ストックを増幅します。次に、リンゴジュースプレートを室温まで温めます。次に、手袋をはめた指を使用して、プレートの中央に湿ったイーストペーストを広げます。

15センチのプレートに対して約6センチの円を作ります。そして、10センチのプレートには4センチの円があります。ハエに麻酔をかけ、メッシュを下に向けて準備したケージに移した後、ケージをリンゴジュースプレートで覆います。

ハエが目を覚ますのを待ちます。次に、ケージを裏返し、ハエを室温で2〜3日間インキュベートします。プレートは1日2回、ケージを逆さまにして交換し、プレートをケージに固定したまま、プレートからテープをはがします。

ベンチのケージ全体をそっと軽くたたいて、ハエが逃げないように、古いプレートを新しいプレートにすばやく交換します。ハエが一晩中、または他の任意の時間、新鮮なリンゴジュースプレートに胚を産むのを許可します。翌朝、胚採取用のメッシュ容器に印を付けて計量します。

使用するフライラインごとに1つ。50ミリリットルのチューブに1x Lysis Bufferを調製するには、50ミリリットルのチューブに50ミリリットルの濃縮溶解バッファーを10ミリリットル加え、既製の試薬を使用して調製します。1モルDTTを50マイクロリットル、最終濃度1ミリモルで加えます。

よく混ぜて、溶液を2本の50ミリリットルチューブに分けます。チューブの1つに、プロテアーゼ阻害剤錠剤を1つ追加します。そして、チューブを摂氏4度のローテーターに30分間置きます。

錠剤が溶解している間に、ケージ上のリンゴジュースプレートに印を付けて、ハエ系統の遺伝子型を使用して胚の収集を開始します。そして、プレートを新しいものと交換します。各リンゴジュースプレートを覆うのに十分な水を追加します。

次に、柔らかい絵筆で、胚をプレートからそっと取り除きます。胚を以前に計量して印を付けたメッシュ容器に注ぎ、余分な水を排出します。次に、メッシュをペーパータオルで簡単に拭き取り、余分な水分を取り除きます。

胚を脱角化するには、6センチメートルのシャーレに半分を50%漂白剤で満たします。次に、2つの大きなシャーレを水で準備します。メッシュ容器に胚を入れ、50%漂白剤に90秒間浸します。

インキュベーション中にメッシュを数回軽くたたいて、胚を漂白剤溶液に懸濁します。インキュベーションの終わりに、水を使用して、2つの皿のそれぞれのメッシュ容器を約10秒間洗います。次に、ホヤボトルに18.2メガオームセンチメートルの水を入れて、メッシュ容器の側面と外側を含めて完全にすすぎます。

徹底的な洗浄後、漂白剤の臭いは検出されません。メッシュ容器をペーパータオルで拭き取ります。次に、メッシュ容器と胚の重量を量り、空の容器の重量を引きます。

胚の結果の重量を記録します。胚抽出物を調製するには、プロテアーゼ阻害剤を含むLysis Bufferを1ミリリットル、Dounceガラスホモジナイザーに加え、氷上に保ちます。次に、メッシュ容器からホモジナイザーに胚を移します。

1ミリリットルのLysis Bufferを使用して、メッシュ上に残っている胚を洗い流します。そして、ホモジナイザーの材料に胚と緩衝液を追加します。次に、胚をホモジナイザーの底まで落ち着かせ、上清を慎重に吸引します。

次に、プロテアーゼ阻害剤を含むLysis Bufferをホモジナイザーに添加し、胚1グラムあたり5〜6ミリリットルのLysis Bufferを目指します。次に、ゆったりとした乳棒を挿入して、4〜6回のストロークで胚を均質化します。最初のストロークでは、より多くの抵抗があります。

溶液が飛散しないように、乳棒を連続的に動かしてみてください。次に、ぴったりとフィットする乳棒に切り替えます。そして、胚を8〜10回のストロークで均質化します。

ホモゲナイドを氷上で20分間インキュベートします。次に、ホモジナイドをマイクロ遠心チューブに移します。そして、13, 000時間Gと摂氏4度で15分間遠心分離します。

最上部の脂質層のペレットを避けながら、上清を氷上の新しいマイクロ遠心チューブに移します。中心化を繰り返した後、1ミリリットルの先端を使用して上清を慎重に収集します。そして、045マイクロメートルフィルターを取り付けた冷やした10ミリリットルの注射器に移します。

すべての溶液を氷上のラベル付き2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに押し込みます。サンプルを液体窒素でスナップ凍結し、マイナス80°Cで保存します。または、タンパク質精製実験にすぐに使用してください。

このビデオで説明されているプロトコルを使用して、Lysateは、Arm-odilloプロモーターの制御下で、EGFP-ERKタンパク質を遍在的に発現するショウジョウバエ胚から調製されました。タンパク質の発現は、ウェスタンブロッティングにより、全ERKタンパク質について確認され、それぞれ42キロダルトンと69キロダルトンで移動する内因性およびトランスジェニックEGFP-ERKのレベルを同時に検出しました。黄色白色のコントロールラインでは、タグなしの内在性ERKに対応する単一のバンドが検出され、胚からのERKおよびEGFP-ERKの抽出が成功したことが確認されました。

抽出プロトコルがタグ付きタンパク質のその後の精製に適しているかどうかをテストするために、黄白色の抽出物、およびアーム−EGFP-ERKフライからの抽出物を、GFPアガロースビーズを使用してアフィニティー精製に供しました。グラジエントSDS-PAGE上で泳動したサンプルの銀染色は、ベイトタンパク質EGFP-ERKの精製に成功したことを示しています。EGFP-ERKの他に、実験レーンには対照サンプルでは観察されなかった追加のバンドが含まれていたことから、精製によってERK相互作用タンパク質の可能性が回復したことが示唆されています。

習得すれば、胚の収集と抽出ステップは約2時間で完了します。この手順を試行する際は、氷上で抽出手順を実行することを忘れないでください。また、タンパク質の分解を最小限に抑えるためにプロテアーゼ阻害剤を使用すること。

このビデオを見れば、中規模でショウジョウバエの個体数ケージを設定する方法についてよく理解できるはずです。そして、胚から全細胞タンパク質抽出物を作ります。