Name: 白蝶貝からの内生菌の抽出方法ベミシア・タバチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶ、白蝶貝Bemisia tabaciからの内生菌抽出法。組織破砕とろ過により細菌を分離し、DNA増幅とシーケンス解析で種同定を行います。昆虫と共生微生物の関係性研究に有用です。

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この研究の財政的支援は、国家主要研究開発計画（2016YFC1200601）と中国国立自然科学財団（31390421）によって提供された。

1.白蝶貝の飼育と種識別<ol><li> 27±1℃、湿度70±10％、光14時間：暗期10時間の標準条件下で、カゴGossypium hirsutum （Malvaceae）（cv。Zhe-Mian 1973）をカゴで維持する。 </li><li>個々の成熟白コショウを集め、30μLの溶解緩衝液（10mMトリス、pH8.4,50mM KCl、0.45％[wt / vol] Tween-20,0.2％[wt / vol]ゼラチン、0.45％[vol / vol]ノニデットP40,60μg/ mLプロテイナーゼK）。 </li><li>ホモジネートを65℃で1時間インキュベートし、次に100℃で10分間インキュベートする。 注：65℃でのインキュベーション時間は必要に応じて増やすことができます。 100℃でのインキュベーション時間は、Proteinase Kを十分に不活性化し、DNA損傷を避けるために厳密に制御する必要があります。 </li><li> ミトコンドリアシトクロムオキシダーゼIプライマーに基づいて、whitefly DNA（セクション1.3で得られた）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。 COI-F：5&#39;-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R：5&#39;-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol><li> 1UのTaq DNAポリメラーゼ、10μlのBuffer、0.2mMのdNTP、0.2mMの各プライマー、2μLのwhitefly DNAを含む25μLの最終容量でPCR反応を行います。 </li><li> 95℃で3分間の変性後、95℃で45秒間（変性）、50℃で45秒間（アニーリング）および72℃で1分間（伸長）の35サイクル、およびさらなる伸長のために72℃でさらに10分間。 </li></ol></li><li> DNAゲル抽出キットを使用してPCR増幅産物を推奨プロトコールで洗浄します。 </li><li>精製したDNAサンプルをDNAサンプルシークエンシングシステムで、製造者の指示に従って配列決定する。 </li><li> Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）を使用してシークエンスの潜在種を特定し、他の種の汚染を避けるために配列を分析するes。 </li></ol> 2.内分泌攪乱の同定と局在化<ol><li>白蝶状DNA（ステップ1.3で取得）にPCRを行い、白蝶内の各内毒素の特定の遺伝子を増幅する（PCRレシピはセクション1.4に記載されており、PCR手順およびプライマーは表1に記載されている ）。 </li><li>以前に公表されたプロトコール20 （1％アガロースゲル、ランニングバッファーとしてTris-アセテート-EDTA、電圧5V / cm）に従って増幅した試料をアガロースゲル電気泳動に付して、各細菌の特異的遺伝子を同定する。 </li><li>白い葉の中の細菌種を決定するために、各バンドを回収し、配列決定する（1.5-1.7節参照）。 </li><li>以前に公表されたプロトコール19に従う、内腔の位置を同定するために、ウンシュウの蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を実施する。 注：必要に応じて蛍光プローブの濃度を上げてください。 </li></o1&gt; 透過型電子顕微鏡（TEM） <ol><li> 2.5％[vol / vol]グルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）中に白鳥を4時間浸漬して固定する。 </li><li>リン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）中でサンプルを3回、毎回15分間洗浄する。 </li><li> 1％[wt / vol] OsO 4を含有するリン酸緩衝液（0.1M、pH7.0）に試料を2時間浸して再度固定する。 </li><li>毎回15分の段階的なエタノール（30％、50％、70％、80％、90％、95％および100％）で試料を脱水する。 </li><li>サンプルを100％アセトンに20分間浸して浸します。 </li><li>サンプルを100％アセトンと100％Spurr樹脂（1：1）との混合物中に室温で1時間置く。 </li><li>試料を100％アセトンと100％Spurr樹脂（1：3）の混合物に室温で3時間移す。 </li><li>サンプルを100％Spurr樹脂（70℃でインキュベート）に9時間以上浸して浸します。 </li><li>白を用いて、マイクロを用いてサンプルを切る私に。 </li><li>絶対ウラニルアセテートに5〜10分間浸漬し、続いて50％アルカリ性クエン酸鉛にさらに5〜10分間浸漬することにより、超薄膜（セクション3.9で得たもの）を染色する。 注：セクション3.1-3.10で利用されている試薬の量は、サンプルによって異なります。サンプルが試薬に浸されていることを確認してください。 </li><li>透過型電子顕微鏡（15,000X）でサンプルを観察し、さらなる使用のために細菌の局在、形状およびサイズを決定する（セクション4.6を参照）。 </li></ol> 4.白蝶菌の解剖および精製<ol><li> 1倍PBS溶液100μLを顕微鏡スライドに加える。綿の葉から3〜4齢のニンフをとり、PBS溶液に浸します。 </li><li> 実体顕微鏡下で細かい昆虫の針を使用し、白蝶身からバクテリアを引き出します。 <ol><li>ゆっくりとニンフの片側の穴を切り、もう一方を少し押してくださいバクテリオミセスを排除するための側面。 </li></ol></li><li> 0.5-10μLピペットで20μLのマイクロローダー（細菌のサイズに合うように先端を切断したもの）をマウントする。個々のバクテリオミウムをPBS溶液からマイクロローダーに抽出する。 </li><li>細菌溶液を洗浄して、細菌溶液をPBS溶液にピペッティングし、細菌を抽出することによって、他の白癬組織の汚染を除去する。 3回繰り返します。 </li><li>直ちに、洗浄した細菌を60μLの1×PBS溶液を含む遠心管にピペットで移す。 </li><li>組み立てたバクテリオロームを5μmのフィルター膜（バクテリアのバクテリアと核の大きさで確認）にシリンジでろ過する。混合液をフィルター膜に完全に移動するために複数回繰り返します。 注：増幅とシークエンシングのより良い結果を得るには、100以上の細菌を集めます。細菌の損失を減らすために1x PBS溶液を使用して最初にフィルター膜をぬらしてください膜に結合する。 </li></ol> Endosymbiontゲノムの増幅<ol><li> いくつかの改変を加えた推奨プロトコールによるDNA増幅キットを用いて、ろ液（主にコナジラミの内胞子を含む）を増幅する。 <ol><li>血液または細胞からのゲノムDNAの増幅の推奨プロトコールを選択し、その後の実験のために緩衝液D2を調製する。 </li><li> 1.5μLのろ液（セクション4.6を参照）を遠心チューブに直接添加し、続いて1.5μLのBuffer D2を加えよく混合します。 </li><li>氷上で10分間インキュベートし、停止液1.5μLを加える。 </li><li> 15μLの反応バッファーと1μLのDNAポリメラーゼを添加し、穏やかに混合する。 </li><li>混合物を30℃で16時間インキュベートし、続いて65℃で3分間インキュベートする。 </li></ol></li><li> bac用に設計された特異的プライマーを使用することにより、増幅された濾液上で直接PCRを実施する（必要に応じて増幅されたサンプルを希釈する）細菌種を確認するために使用した（2.1節参照）。 </li><li>以前に公表された方法21 （PCRレシピはセクション1.4に記載されている）に従ってwhitefly遺伝子ベータアクチンおよびEF1プライマーを使用することによって宿主ゲノムの汚染があるかどうかを確認するためにPCRを行う。 </li></ol> 6.エンドサイトーシスメタゲノム配列決定<ol><li>配列の前に増幅されたろ液を分光光度計と蛍光光度計（製造元の指示に従う）に供して、試料の品質および試料が配列決定の基準を満たすかどうかを試験する。 </li><li>増幅したものを製造者の指示に従ってゲノムシーケンサーに供する。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

コナジラミ内の内部共生生物はin vitroで培養できないため、細菌細胞の解剖と組み立ては、内部共生生物の遺伝物質を十分に得るための効果的な方法です。解剖の前に、関与するコナジラミと内部共生生物の種を明示的に確認する必要があります。コナジラミ B. tabaci は、形態学的に区別できない 35 種以上の種複合体であり、さまざまな不可解な種には異なる内部共生生物が含まれている可能性があります。ポルティエラは一様に絶対的な共生生物として保有されており22、二次共生生物は種によって異なり、個々のコナジラミ17,21,23でさえ異なります。さらに、多くの内部共生生物は細菌細胞内に抑制されていることが証明されていますが、一部はコナジラミの全身に分布している可能性があります24。したがって、バクテリオーム解剖の前に...

節足動物1では 、相対的な宿主と密接な共生関係を形成する細菌が広がっている1 。内分泌攪乱物質は、栄養代謝、繁殖、環境ストレスへの応答2,3、4などのような宿主の局面にほとんど全ての発育段階5において影響を及ぼすことが実証されている5 。しかし、協会の基盤となる仕組みはまだほとんど知られていません。ゲノミクスは、細菌の潜在的な機能と役割を研究する際に重要かつ重要です。いくつかの基本的な情報、 すなわち 、分類学的状態、機能遺伝子、代謝経路、分泌系は、共生している共生生物の潜在的役割についての光を放出するゲノム配列から推測することができる。ハイスループット配列決定の開発により、膨大な数の細菌ゲノムが配列決定されている様々な機能を明らかに6 。 内寄生虫は、アブラムシ7 、ナンキンムシ8 、オオバコ9 、褐斑病10および蝉11などの半翅類において極めて重要である。例えば、アブラムシのBuchneraは、必須の共生生物として、アブラムシのゲノム12由来の遺伝子とともに、必須のアミノ酸生合成に関与することが示されている。さらに、 ブフネラ（Buchnera）の転写調節もまた明らかにされている13 。 オオバコでは、 Carsonellaが配列決定され、今までに発見された最小の細菌ゲノムにランクされている14 。これらの内在性の特徴はすべて、ゲノム配列に基づいて推測されます。これらの内在性物質はインビトロで培養することができないので、seqのために適切な細菌を単離するためにいくつかのアプローチが適用されている覚醒する。アブラムシでは、遠心分離および濾過により内腔菌を抽出し、さらなるゲノムおよび転写分析に供する5 。褐斑病菌では、昆虫ゲノム10全体とともに内生菌が配列決定される10 。 Whitefly B. tabaciは、35種以上の形態学的に区別不能な種（潜在種）を含む種複合体であり、そのうち2種の侵略種が世界中に侵入し、農業生産に多大な害をもたらした15 。注目すべきことに、 B. tabaci種内の内在性物質は、害虫16の発生において重要であることを示している。今日まで、8種の内在性物質が、 ハリネリチア 、 リケッチア 、 アルセノフォヌス 、 カルディニウム 、em&gt; Wolbachia、 FritschaおよびHemipteriphilusは、17,18を定義した。 以前に記載された半体とは異なり、コナジラミB. tabaciはわずか1mmの非常に小さな昆虫である。ほとんどの内在性物質は、バクテリア細胞19 （B細胞において細菌をさらに形成する共生物質を含む特殊細胞）に限定される。さらに、これらの内在性物質はインビトロで培養することができない。バチルス・タバチ（ B. tabaci）から内寄生虫を得るための唯一の方法は、細菌を解剖することである。しかし、解剖が困難である。第一に、脆弱な細菌は、常に分離するのは難しい白蝶の他の組織とつながります。第二に、白蝶の小さなサイズは、十分な細菌の分離を制限する。第3に、内在性細菌は細菌の中に集まり、単一の細菌種を獲得することを非常に複雑にする。

<table><tbody><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>タカラ</td><td>R001A</td><td>、rTaqを含む、10倍;バッファーとdNTP</td></tr><tr><td>ゲル DNA抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DNAサンプルシーケンシングシステム</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>日立</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L マイクロローダー</td><td>エッペンドルフ</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>フィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>フィルター メンブレンフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &mu;m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>150033</td><td>DNA amlification kit</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Genome Sequencer</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

白蝶貝からの内生菌の抽出方法<em&gt;ベミシア・タバチ</em

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

細菌共生生物は、宿主と親密な関係を形成し、ほとんどの場合宿主に利点を与える。ゲノム情報は、宿主における細菌共生生物の機能および進化を研究するために重要である。ほとんどの共生物質はインビトロで培養できないため、ゲノム配列決定のために適切な量の細菌を単離する方法は非常に重要です。コナジラミBemisia tabaciでは、いくつかの内寄生虫が同定されており、複数のアプローチによる有害生物の発生および生殖において重要であると予測されている。しかし、協会を支える仕組みはほとんど知られていません。この障害は部分的に、白癬菌の内在性物質（ほとんどが細菌細胞に抑制されている）が宿主細胞から分離するのが困難であるという事実に由来する。ここでは、主に解剖学的検査によって白癬B. tabaciからの内在性物質の同定、抽出および精製のための段階的プロトコールを報告するオンにして濾過する。この方法によって調製された内毒素試料は、依然として異なる内毒素種の混合物であるが、その後のゲノム配列決定およびバチルス・タバチにおける内在性の可能な役割の分析に適している。この方法は、他の昆虫から内生菌を単離するためにも使用することができる。

ここでは、 B. tabaci複合体の中東アジアマイナー1（MEAM1）種を例として取り上げた。コナジラミを飼育するためのコットンおよびコナジラミのいくつかの発生段階を、 図1に示す。コットン植物、成虫コナジラミ、およびコナジラミの第1、 第 2 および第 4齢の幼虫（第3齢の幼虫は第 4齢の幼虫と同様に見える）。第4齢の幼虫は、第1齢および第2齢の幼虫よりも大きいことは明らかであった（ 図1 ）。 MEAM1内のPortieraおよびHamiltonellaの FISH分析を図2に示す。これらの2つの内在性物質はコナジラミの細菌細胞に限定され、2つの細菌の重複もまた観察される。 図3は、<html>...

ここでは、白斑Bemisia tabaciからの内胚葉を切開および濾過により単離するためのプロトコールを提示する。増幅後、DNAサンプルは、その後のシークエンシングおよび内寄生虫とコナジラミ間の共生の研究に適している。

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

この実験の全体的な目的は、さらなる実験のために微小昆虫から共生細菌を抽出することです。ほとんどの共生細菌はin vitroで培養できないため、この手法は昆虫学およびマクロ生物学的な視点における重要な疑問を解決するのに役立ちます。後続の実験に十分な量の細菌を単離する方法を提示することは非常に重要です。この手法の主な利点は、コナジラミの細菌共生体を簡便に分離できることです。これは、アブラムシ、ウンカ、アザミウマなどの他の昆虫からの共生体分離にも適用可能です。まず、成虫のコナジラミを1個体採取し、30 µLのライシスバッファー中でホモジナイズします。ホモジネートを65°Cで1時間、次いで100°Cで10分間インキュベートします。コナジラミDNAおよびミトコンドリアシトクロムオキシダーゼ1プライマーを用い、以下の試薬を使用して25 µLのPCR反応液を調製します。次に、ここに示すプログラムを用いてPCR反応を行います。続いて、推奨されるプロトコルに従い、DNAゲル抽出キットを使用してPCR産物を精製します。その後、テキストのプロトコルに従って配列解析を行います。コナジラミ内の各共生細菌の特定遺伝子を増幅させるため、コナジラミのDNAを用いてPCRを行います。既報のプロトコルに従い、増幅したサンプルをアガロースゲル電気泳動およびシーケンシングにかけ、コナジラミ内の細菌種を決定し、各細菌の特定遺伝子を同定します。コナジラミのバクテリオームを解剖・精製するため、顕微鏡スライドの上に1x PBS溶液を100 µL滴下します。次に、綿花の葉から3齢または4齢の幼虫を採取します。そして、それらをPBSに浸します。顕微鏡下で、精細な昆虫用針を用いて、コナジラミの体からバクテリオームを引き出します。バクテリオームは小さく脆弱であるため、分離の際は注意して行ってください。若虫の片側に慎重に穴を開け、反対側を軽く押してバクテリオームを放出させます。次に、0.5〜10 µLピペットに20 µLマイクロローダーを取り付け、PBS中の個々のバクテリオームをマイクロローダーへと抽出します。バクテリオームをPBSにピペッティングして抽出することで洗浄し、他のコナジラミ組織による混入を除去します。この洗浄操作を3回繰り返します。可能な限り混入物を排除するため、洗浄を繰り返すことを強く推奨します。洗浄したバクテリオームを、60 µLのPBSを含む遠心チューブに直ちにピペットで移します。組み立てられたバクテリオームを5 µmのフィルターメンブレンでシリンジろ過します。混合液をメンブレンに完全に通過させるため、ろ過を数回繰り返します。ろ液を増幅させるために、血液または細胞からのゲノムDNA増幅に推奨されるプロトコルに一部変更を加えたバッファーD2を調製します。遠心チューブにろ液1.5 µLを直接加え、続いてバッファーD2を1.5 µL加えます。十分に混合し、サンプルを氷上で10分間インキュベートします。その後、ストップ溶液を1.5 µL加えます。反応バッファー 15 µL と DNA ポリメラーゼ 1 µL を加え、穏やかに混合します。混合物を 30 °C で 16 時間、次いで 65 °C で 3 分間インキュベートします。増幅されたろ液を用いて、細菌種を確認するために設計された特異的プライマーによる PCR を直接行います。また、既報の方法に従い、コナジラミのbeta-actinおよびEF1遺伝子のプライマーを用いて、ホストゲノムからのコンタミネーションがあるかを確認するためのPCRを行う。最後に、テキストのプロトコルに従ってメタゲノムシーケンシングを実施する。この図では、コナジラミの飼育に使用した綿花と、コナジラミのいくつかの発育段階が示されている。成虫および1齢、2齢、4齢の幼虫を含む。ここでは、MEAM1の4齢幼虫内における共生細菌PortieraおよびHamiltonellaのFISH解析を示す。これら2種の細菌の重複が観察され、いずれもコナジラミのバクテリオサイト（共生細胞）内に限定して存在している。ここに、コナジラミの共生細菌Portieraの透過電子顕微鏡画像を示します。これはPortieraが細胞壁を喪失している可能性を示唆しています。アダプターや重複などのコンタミネーションデータのシーケンシングおよびクリーニング後、必須共生細菌であるPortieraの完全なゲノムが取得されました。その結果、358,232 bpの環状ゲノムが得られました。さらに、ペアエンド関係に基づいて89個のスキャフォールドにアセンブルされた138個のコンティグを含む、Hamiltonellaのドラフトゲノムが得られました。この手法を習得すれば、適切に実施することで20時間で完了させることができます。この手順を行う際は、環境細菌によるサンプルの汚染を防ぐことが重要です。本手順に続き、共生細菌の遺伝子発現や代謝といった追加の疑問を明らかにするために、RAシーケンスやマスバクテリオームなどの他の解析を行うことができます。この技術の開発により、昆虫学や微生物学の分野の研究者が、昆虫や節足動物における共生細菌の機能を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、昆虫のバクテリオームから共生細菌を抽出する方法について十分に理解できるはずです。一部の試薬の取り扱いは危険を伴う場合があるため、本手順の実施中は常に手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ、白蝶貝Bemisia tabaciからの内生菌抽出法。組織破砕とろ過により細菌を分離し、DNA増幅とシーケンス解析で種同定を行います。昆虫と共生微生物の関係性研究に有用です。

白蝶貝からの内生菌の抽出方法

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