白蝶貝からの内生菌の抽出方法ベミシア・タバチ

この実験の全体的な目標は、さらなる実験のために小さな昆虫から内部共生生物を抽出することです。この方法は、ほとんどの内部共生生物をin vitroで培養できないため、昆虫学とマクロ生物学の視点における重要な質問に答えるのに役立ちます。さらなる実験のために十分な量の細菌を分離する方法は非常に重要です。

この技術の主な利点は、コナジラミの細菌の内部共生生物を便利に分離できることです。これは、アブラムシ、植物ホッパー、アザミウマなどの他の昆虫からの内部共生生物の分離にも適用できます。まず、個々の成虫のコナジラミを採取し、30マイクロリットルの溶解緩衝液で均質化します。

ホモジネートを摂氏65度で1時間インキュベートします。その後、摂氏100度で10分間。コナジラミのDNAとミトコンジアのシトクロムオキシダーゼ1プライマーを用いて、以下の試薬を用いて25マイクロリットルのPCR反応を調製します。

次に、ここに示すプログラムを使用してPCR反応を実行します。次に、推奨プロトコルに従ってDNAゲル抽出キットを使用してPCR産物を洗浄します。次に、テキストプロトコルに従って配列解析を行います。

コナジラミ内の各内部共生生物の特定の遺伝子を増幅するには、コナジラミのDNAでPCRを実施します。以前に発表されたプロトコルに従って、増幅されたサンプルをアガロースゲル電気泳動およびシーケンシングにさらして、コナジラミ内の細菌種を決定し、各細菌の特定の遺伝子を同定します。コナジラミの細菌を解剖して精製するには、100マイクロリットルの1x PBS溶液を顕微鏡スライドに加えます。

次に、綿の葉から3番目または4番目の幼虫を選びます。そして、それらをPBSに没頭させます。顕微鏡下で、細い昆虫学的針を使用して、コナジラミの体から細菌を引き出します。

細菌は小さくて壊れやすいため、単離するときは注意してください。ニンフの片側にそっと穴を開け、反対側を少し押してバクテリオムを排出します。次に、20マイクロリットルのマイクロローダーを0.5〜10マイクロリットルのピペットに取り付け、PBSから個々の細菌をマイクロローダーに抽出します。

バクテリオムを洗浄して他のコナジラミ組織の汚染を排除するには、バクテリオームをPBSにピペッティングして抽出します。洗濯を3回繰り返します。できるだけ多くの汚染を排除するために、洗浄を繰り返すことを強くお勧めします。

洗浄したバクテリオームを60マイクロリットルのPBSが入った遠心分離チューブにすぐにピペットで移します。シリンジは、5マイクロメートルのフィルター膜を通して組み立てられた細菌をろ過します。ろ過を複数回繰り返して、混合した液体をメンブレンを通して完全に移動させます。

濾液を増幅するには、血液または細胞からのゲノムDNAを増幅するための推奨プロトコルで使用するバッファーD2を調製します。遠心分離管に1.5マイクロリットルの濾液を直接加え、続いて1.5マイクロリットルのバッファーD2を加えます。よく混合し、サンプルを氷上で10分間インキュベートします。次に、1.5マイクロリットルの停止溶液を追加します。

15マイクロリットルの反応バッファーと1マイクロリットルのDNAポリメラーゼを加え、穏やかに混合します。混合物を摂氏30度で16時間インキュベートし、続いて摂氏65度で3分間インキュベートします。バクテリア用に設計された特定のプライマーを使用して、増幅した濾液上で直接PCRを行い、バクテリア種を確認します。

また、宿主ゲノムからの汚染の有無を確認するため、コナジラミの遺伝子であるβ-actinとEF1のプライマーを用いて、先に発表した方法に従ってPCRを行います。最後に、テキストプロトコルに従ってメタゲノムシーケンシングを行います。この図では、コナジラミを飼育するための綿と、コナジラミのいくつかの発達段階が示されています。

成虫と1番目、2番目、4番目の幼虫を含みます。MEAM1の第4幼虫内の内部共生生物PortieraとHamiltonellaのFISH分析がここに示されている。2つの細菌の重なりが観察され、どちらもコナジラミの細菌細胞に限定されています。

ここに示されているのは、コナジラミのポルティエラ内部共生生物の透過型電子顕微鏡画像であり、ポルティエラが細胞壁を失う可能性があることを示しています。アダプターと重複の汚染データのシーケンシングとクリーンアップを行った後、obligate symbiont Portiera の完全なゲノムを取得しました。その結果、358, 232塩基対の環状ゲノムが得られます。

さらに、138個のコンティグを含むハミルトネラのドラフトゲノムが取得され、ペアエンドの関係に基づいて89個の足場に組み立てられました。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば20時間で完了できます。この手順を試みるときは、サンプルを環境細菌の汚染から守ることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、RA配列や質量バクテリオームなどの他の解析を行い、内部共生生物の遺伝子発現や代謝などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、昆虫学と微生物学の分野の研究者が昆虫や節足動物の内部共生生物の機能を調査する道を開きました。このビデオを見た後、昆虫のバクテリアから共生生物を抽出する方法をよく理解しているはずです。

一部の試薬での作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。