切り替え可能な音響光学分解能光音響顕微鏡インビボ小動物の血管系イメージング

この手順の全体的な目標は、in vivo 小動物の血液血管系イメージングのための切り替え可能な音響および光学分解能の光音響顕微鏡システムを実証することです。光音響顕微鏡は、光学と超音波を組み合わせた急速に成長しているin vivoイメージングモダリティであり、光路を超えたイメージング深度を高解像度で提供します。この研究は、in vivoで同じサンプルの浅い深さでの高解像度イメージングと低解像度の深部組織イメージングが可能な、切り替え可能な音響光学分解能の光音響顕微鏡システムです。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるMohesh Moothanchery博士と、私の研究室の博士課程の学生であるArunima Sharmaです。まず、ダイオード励起固体Nd:YAGレーザーと559〜576ナノメートルの範囲のディッタブルレーザーから、ナノ秒のチューナブルレーザーシステムを構築します。ディタブルレーザーを570 nan に設定します。

光学テーブルに、タンクの床に7cmのポリエチレンイメージングウィンドウを備えたアクリルタンクを取り付けます。イメージングステージをイメージングウィンドウの下の光学ポストに固定します。タンクの上には、AR-OR-PAMイメージングシステムを含む光学ケージを、コンピューター制御の3軸電動トランスレーションステージに固定されたスイッチングプレートに取り付けます。

AR-PAM用にシステムを構成するには、電動連続回転ステージに取り付けられた直角エンジェルプリズムを使用して、可変NDフィルターを介してビームを25NAファイバーカプラーを備えたマルチモードファイバーケーブルに導きます。ファイバー出力をイメージングシステムのXY変換ステージに接続します。ビームを出力から25ミリメートルの平凸レンズに向け、次に円錐形のレンズにビームを通してリング状のビームを作成します。

リング状のビームを50メガヘルツの超音波トランスデューサーの周りの光学コンデンサーに集束させ、トランスデューサー出力に音響レンズを取り付けます。次に、OR-PAM用にシステムを構成するには、最初の直角プリズムを90度回転させて、レーザービームをアイリス、可変減光フィルター、コンデンサーレンズ、およびコンデンサーレンズから75mmに設定されたピンホールに向けます。1 NAシングルモードファイバーカプラーとシングルモードファイバーを使用して、イメージングシステムのZ変換ステージにビームを送ります。

ファイバー出力から50mmのところに取り付けられたアクロマティックダブレットレンズにビームを向けます。キネマティックで制御可能な楕円形ミラーでビームをレンズチューブ内の2番目のアクロマティックダブレットレンズに迂回させます。菱形プリズムからシリコンオイルの層で分離された直角プリズムにビームを集束させ、音響レンズと50メガヘルツの超音波トランスデューサーを装着してOR-PAMスキャンヘッドを形成します。

システムの位置合わせを開始する前に、アクリルタンクに脱気水を入れます。次に、3軸電動ステージを使用して、スキャンアセンブリをタンク上に移動します。両方のシステムの音響レンズが水没するまで、アセンブリを下げます。

レーザーをオンにします。超音波トランスデューサを2つの25デシベルの固定ゲインアンプに接続します。AR-PAMスキャンヘッドをイメージングウィンドウ上に置きます。

黒い電気テープで包んだスライドガラスをイメージングステージに置き、ステージを持ち上げてスライドをイメージングウィンドウに接触させます。スライドから生成される光音響信号の振幅が最大に達するまで円錐レンズを調整し、光学レンズと音響レンズが共焦点であることを示します。その後、手動でOR-PAMシステムに切り替えます。

テープで覆われたスライドからの光音響信号の振幅を最大化することによって示されるように、光学レンズと音響レンズが共焦点になるまで、アクロマティックダブレットレンズを調整します。各システムの横方向の分解能を決定するには、まず、100ナノメートルの金ナノ粒子の希薄溶液1ミリリットルをカバースリップに水に入れます。スライドをイメージングステージに置きます。

ナノ粒子溶液がイメージングウィンドウに接触するまでステージを上げます。レーザーとスキャニングヘッドをAR-PAMシステムに切り替えます。AR-PAMスキャン用に装置ソフトウェアを設定し、1つのラスタースキャンを実行します。

OR-PAM システムに対してこのプロセスを繰り返します。次に、スライドを取り外し、アルコール綿棒でイメージングウィンドウを清掃します。取得した画像から決定された点像分布関数をガウス曲線に当てはめます。

半値での全幅は、対応するスキャンシステムの横方向の解像度です。次に、組織内の最大イメージング深度を決定するために、まず、黒いテープで包まれた鋭利な金属プレートを鶏組織の小さな部分に浅い角度で挿入します。ティッシュをスキャナーヘッドの下の水タンクに入れます。

システムごとに 1 つの B スキャン画像を取得します。黒いテープがはっきりと識別できなくなった組織表面の下の深さを測定します。イメージングの前に、ポリエチレンイメージングウィンドウと動物イメージングステージの両方がきれいであることを確認してください。

次に、マウスを麻酔した後のイメージング手順のために、25グラムの4週齢の雌マウスを入手します。脱毛クリームで耳の表面から髪を取り除きます。マウスの眼に滅菌眼軟膏を塗布して乾燥を防ぎ、レーザー光線の散乱を遮断します。

マウスをイメージングステージに置き、耳を私に位置決めするためのプレートを画像化します。マウスの尾または脚に固定されたパルスオキシメータでマウスの生理学的状態をモニターします。画像化する耳に超音波ジェルを塗布します。

イメージングステージをゆっくりと上げて、耳をポリエチレンイメージングウィンドウにそっと接触させます。マウスの耳のAR-PAMおよびOR-PAMラスタースキャンを取得し、マウスの生理学的状態を全体を通して監視します。イメージング後、マウスが完全に回復するのを待ちます。

ここでのマウスの血液血管系は、切り替え可能なAR-OR-PAMシステムを使用してin vivoでイメージングされました。AR-PAM画像には、45マイクロメートルを超える太さの血管がはっきりと見えました。幅約5マイクロメートルの単一の毛細血管をOR-PAMイメージングで分離しました。

組み合わせたAR-OR-PAMシステムの横方向の分解能は約4ミクロンです。また、OR-PAMでは4mm、AR-PAMでは横方向の解像度が約45μm、イメージングは7.8mmとなっています。切り替え可能な複合型AR-OR-PAMシステムにより、異なるイメージングシステム間でサンプルを移動させることなくイメージングが可能です。

開発したシステムは、前臨床イメージングに使用することができます。主な前臨床アプリケーションには、アンドロジェネシス、腫瘍微小環境、微小循環、薬物応答、脳機能、バイオマーカー、および遺伝子活性のイメージングが含まれます。