細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作
August 4th, 2017
蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2 つの異なるモデルのセルラインを使用して評価されます。
この方法論の全体的な目標は、細胞培養アプリケーション向けにさまざまな孔径のマクロ多孔質ハイドロゲルを作成することです。この方法は、3D細胞培養アプリケーション用の新しいハイドロゲル材料の原理的な実現可能性など、3D細胞培養の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法論の主な利点は、さまざまな種類の細胞の要件に合わせて新しい材料を最適化および調整するためのさまざまな手法を提供することです。
まず、1ミリグラムのRGDペプチドまたは同等の細胞接着ペプチドを100マイクロリットルの滅菌水で希釈して、1ミリグラム/ミリリットルの溶液を得ます。次に、96ウェルプレートの底を取り外し、取り外し用プラスチックラップと交換します。100マイクロリットルのBSAストック溶液と100マイクロリットルのTHPCストック溶液を96ウェルプレートに混合して、200マイクロリットルのヒドロゲルを取得します。
ピペッティングで5回以上上下に繰り返して成分を混合し、重合後に均一なヒドロゲルが得られるようにします。96ウェルプレートを室温で約10分間、すべてのヒドロゲルが適切に重合するまで置きます。重合後、プレートの底からラップを慎重にゆっくりと取り除きます。
小さな刺し傷を使用して96ウェルプレートからハイドロゲルを押し出し、滅菌PBS pH 7.4の1.5ミリリットルチューブに移します。ヒドロゲルを4°Cのリン酸緩衝生理食塩水に最大数ヶ月間保存します。ハイドロゲルを凍結乾燥するには、まず1.5ミリリットルのチューブに500マイクロリットルの滅菌脱イオン水を入れ、キャップを取り外します。
鉗子を使用して、ハイドロゲルを1.5ミリリットルの反応チューブに移します。1.5ミリリットルのチューブをパラフィンフィルムでしっかりと包み、バイアルごとに少なくとも3層使用します。針を使用してフィルムの小さな穴を開け、チューブからガスを放出できるようにします。
水とヒドロゲルが完全に凍結することを保証するために、バイアルを液体窒素溶液に5分間移します。液体窒素から取り出した直後に、バイアルを凍結乾燥機に移し、材料の融解を防ぎます。別の凍結手順として、バイアルを摂氏マイナス20度に一晩保ち、ヒドロゲルをゆっくりと凍結します。
マイナス20°Cから取り出した直後は、バイアルを凍結乾燥機に移し、材料の融解を防ぎます。24時間後、ヒドロゲル内および周囲の水が完全に蒸発した後、材料を凍結乾燥機から取り出して解凍します。粒子の浸出には、以前と同様にハイドロゲルの成分を混合します。
混合後、飽和するまで直ちに塩化ナトリウムを加えます。塩の結晶が溶液中に白い沈殿物として見えるまで塩を加えます。細孔径は、使用前に塩の結晶を粉砕することで変更できます。
96ウェルプレートをシェーカーに移し、重合が行われるまで振とうします。約10分後、前回と同様にハイドロゲルをプレートから取り出します。ハイドロゲルをローテーター上の滅菌水で室温で少なくとも24時間インキュベートし、ハイドロゲルテンプレートからすべての塩を溶出します。
ハイドロゲルを摂氏4度でPBSに最大数ヶ月間保存します。穏やかな形成のためには、説明されているようにハイドロゲルを調製します。次に、ペンチを使用して溶液からヒドロゲルを取り除きます。
吸収性の高い紙で余分な水分を取り除き、ドライアイスのブロックの上に置きます。ヒドロゲルを30秒間凍結し、ブロックから慎重に取り出します。ハイドロゲルを傷つけないでください。
へらを慎重に使用して、ブロックからこすり落とします。ハイドロゲルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏37度で一晩乾燥させます。ローダミンBストック溶液と、テキストプロトコルに記載されている段階希釈液を調製します。
保存した溶液からヒドロゲルを取り出し、1ミリリットルあたり0.01ミリグラムのローダミンB溶液を1ミリリットル入れた1.5ミリリットルのチューブに移します。ハイドロゲルをローダミンB溶液で室温で一晩染色します。翌日、視覚化するヒドロゲルを10ミリリットルのPBSに移し、少なくとも3時間洗浄します。
ブレードを使用してハイドロゲルから小さなスライスを切り取ります。次に、ハイドロゲルを8ウェルの顕微鏡スライドに移し、PBSで覆います。共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、514ナノメートルの波長でヒドロゲルを視覚化します。
滅菌 0.45ミクロンのフィルターですべてのストック溶液をろ過します。ハイドロゲルの調製を開始し、ヒドロゲル重合の前に細胞接着ペプチドを含めます。成分を混合した後、底が完全に覆われるまで、混合物を直ちに8ウェルの顕微鏡スライドにピペットで移します。
細胞を、ウシ胎児血清、ペニシリンストレプトマイシン、および非必須アミノ酸溶液を添加した予熱滅菌DMEM細胞培養培地に移します。ノイバウアー計数チャンバーで細胞を計数した後、必要な数の細胞200マイクロリットルをヒドロゲル表面に慎重にピペットで移します。8ウェル顕微鏡スライドを蓋で覆い、インキュベーターに移します。
細胞接着から少なくとも4時間経過した後、200マイクロリットルの滅菌細胞培養PBSで細胞を2回洗浄します。次に、細胞を200マイクロリットルの3.7%ホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSで2回洗浄します。200マイクロリットルの0.1%Triton Xで細胞を5分間透過処理した後、PBSでさらに2回洗浄します。
トルイジンローダミンで細胞を染色するには、5マイクロリットルのメタノールストックと195マイクロリットルのPBSを混合し、室温で細胞に加えます。細胞を暗所で20分間染色した後、PBSで2回洗浄します。514ナノメートルの共焦点顕微鏡を使用して細胞接着特性を調査します。
テキストプロトコルに記載されているように、ヒドロゲルの特性を分析します。ここに示すように、重合して染色されたハイドロゲルには特徴的な構造はありません。ハイドロゲルを異なる温度で凍結乾燥した後、ハイドロゲル内の細孔の平均サイズを最大60ミクロンまで拡張できます。
塩浸出により、細孔径が約10ミクロンの均一なネットワークが得られます。使用前に塩の結晶を粉砕することで、さらにサイズを調整することができます。ドライアイスのブロックに勾配凍結アプローチを使用すると、直径約20ミクロン、長さ数百ミクロンのチャネルが形成されます。
細胞接着部分による官能基化の前に、細胞はハイドロゲルの表面に接着できず、丸い形態を示します。細胞接着ペプチドを材料に供給した後にのみ、細胞は、細胞を材料に適切に接着することを可能にする焦点接着点を見つけます。これは、3D細胞培養アプリケーションで新しい材料を使用するために重要です。
このビデオを見れば、簡単な方法でハイドロゲルの構造を操作する方法を十分に理解できるはずです。この方法は、ほとんどの新規なハイドロゲルシステムに適用でき、細胞培養での使用について学び、使用目的に応じてハイドロゲルの構造を最適化することができます。
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概要
この研究は、タンパク質ベースのハイドロゲルの三次元構造を操作する様々な方法を評価し、その材料特性と細胞培養への適合性に焦点を当てています。ハイドロゲルは細胞接着ペプチドで機能化され、異なるモデル細胞株でテストされています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生体材料
- 細胞培養
- ハイドロゲル工学
背景
- 三次元細胞培養は、in vivo環境を模倣するために重要です。
- ハイドロゲルは細胞成長のための支持マトリックスを提供できます。
- 細胞接着ペプチドは細胞接着と増殖を促進します。
- マクロポラス構造は栄養と廃棄物の交換に影響を与えることができます。
研究目的
- 細胞培養用に異なる孔径のマクロポラスハイドロゲルを作成すること。
- 3D細胞培養応用のための新しいハイドロゲル材料の実現可能性を評価すること。
- 異なる細胞種のためにハイドロゲルの性質を最適化すること。
使用した方法
- 細胞接着溶液を作成するためにRGDペプチドを無菌水で希釈すること。
- ハイドロゲル調製のための96ウェルプレートの改修。
- BSAとTHPCのストック溶液を混合してハイドロゲルを形成すること。
- モデル細胞株を用いてハイドロゲルの性能を評価すること。
主な結果
- 調整可能な特性を持つマクロポラスハイドロゲルの成功的な作成。
- ハイドロゲルは細胞培養との互換性を示しました。
- 細胞接着ペプチドは細胞接着を改善しました。
- 異なる孔径は細胞の挙動と成長に影響を与えました。
結論
- この方法論はハイドロゲル開発のための多目的アプローチを提供します。
- 最適化されたハイドロゲルは特定の細胞種に合わせて調整できます。
- この研究は3D細胞培養技術の進歩に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Protein-based hydrogels with tunable macroporous architectures enable systematic evaluation of 3D cell culture conditions, supporting target validation through physiologically relevant microenvironments. Adjustable pore sizes and channel formation allow de-risking of lead candidates by modeling nutrient diffusion and cellular response variability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by bridging reductionist assays with tissue-like complexity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in 3D contexts that better reflect in vivo tissue architecture and cell-ECM interactions.
- Operational Value: Provides a tunable platform to assess target engagement across varying microenvironmental conditions, reducing false positives from 2D systems.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking hydrogel architecture to cellular phenotypes, improving target confidence before lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantifiable hydrogel substrates with defined pore sizes (10–70 µm radius) for standardized compound screening.
- Operational Value: Enables assay scalability through simple salt-leaching and gradient-freezing methods compatible with 96-well formats.
- Assay Readiness: Produces stable, cell-adhesive (RGD-functionalized) hydrogels suitable for long-term culture and imaging via confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical testing by maintaining consistent hydrogel properties across workflow stages.
- Disease-Relevant Modeling: Allows evaluation of cell lines (e.g., A549, MCF7) in engineered microenvironments that mimic stromal barriers and interstitial flow.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables porosity-dependent screening to identify compounds effective under diffusion-limited conditions, improving clinical translatability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, offering a tunable extracellular matrix mimic for iterative design-test cycles.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how matrix porosity influences signaling, proliferation, and drug response in cancer models.
- Screening: Delivers pore-size-graded hydrogels enabling dose-response analysis under varied mass transport conditions.
- Analytics: Provides confocal-readable, Rhodamine B-stained architectures for quantitative pore characterization and correlation with functional outcomes.
- Translational Research: Supports biomarker-aligned studies by maintaining hydrogel integrity during prolonged culture and fixation steps.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular hydrogel platform adaptable to multiple cell types and pore specifications without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in 3D cell responses to pharmacological perturbations.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hydrogel fabrication, storage (4°C in PBS), and visualization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds effective in diffusion-limited, tissue-like microenvironments.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of leads based on performance across hydrogel architectures with varying pore sizes and channels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel formulation, peptide functionalization, and confocal microscopy for structural analysis.
- Depends on access to freeze-dryers, liquid nitrogen or -20°C storage, and shakers for salt leaching and hydrogel maturation.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel preparation steps to ensure batch-to-batch consistency in pore size and swelling behavior.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to other protein-based systems beyond BSA, particularly regarding gelation kinetics and peptide compatibility.
- Practical limitations include mechanical fragility of macroporous hydrogels, necessitating careful handling during transfer and imaging steps.
