細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

この方法論の全体的な目標は、細胞培養アプリケーション向けにさまざまな孔径のマクロ多孔質ハイドロゲルを作成することです。この方法は、3D細胞培養アプリケーション用の新しいハイドロゲル材料の原理的な実現可能性など、3D細胞培養の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法論の主な利点は、さまざまな種類の細胞の要件に合わせて新しい材料を最適化および調整するためのさまざまな手法を提供することです。

まず、1ミリグラムのRGDペプチドまたは同等の細胞接着ペプチドを100マイクロリットルの滅菌水で希釈して、1ミリグラム/ミリリットルの溶液を得ます。次に、96ウェルプレートの底を取り外し、取り外し用プラスチックラップと交換します。100マイクロリットルのBSAストック溶液と100マイクロリットルのTHPCストック溶液を96ウェルプレートに混合して、200マイクロリットルのヒドロゲルを取得します。

ペッティングで5回以上上下に繰り返して成分を混合し、重合後に均一なヒドロゲルが得られるようにします。96ウェルプレートを室温で約10分間、すべてのヒドロゲルが適切に重合するまで置きます。重合後、プレートの底からラップを慎重にゆっくりと取り除きます。

小さな刺し傷を使用して96ウェルプレートからハイドロゲルを押し出し、滅菌PBS pH 7.4の1.5ミリリットルチューブに移します。ヒドロゲルを4°Cのリン酸緩衝生理食塩水に最大数ヶ月間保存します。ハイドロゲルを凍結乾燥するには、まず1.5ミリリットルのチューブに500マイクロリットルの滅菌脱イオン水を入れ、キャップを取り外します。

鉗子を使用して、ハイドロゲルを1.5ミリリットルの反応チューブに移します。1.5ミリリットルのチューブをパラフィンフィルムでしっかりと包み、バイアルごとに少なくとも3層使用します。針を使用してフィルムの小さな穴を開け、チューブからガスを放出できるようにします。

水とヒドロゲルが完全に凍結することを保証するために、バイアルを液体窒素溶液に5分間移します。液体窒素から取り出した直後に、バイアルを凍結乾燥機に移し、材料の融解を防ぎます。別の凍結手順として、バイアルを摂氏マイナス20度に一晩保ち、ヒドロゲルをゆっくりと凍結します。

マイナス20°Cから取り出した直後は、バイアルを凍結乾燥機に移し、材料の融解を防ぎます。24時間後、ヒドロゲル内および周囲の水が完全に蒸発した後、材料を凍結乾燥機から取り出して解凍します。粒子の浸出には、以前と同様にハイドロゲルの成分を混合します。

混合後、飽和するまで直ちに塩化ナトリウムを加えます。塩の結晶が溶液中に白い沈殿物として見えるまで塩を加えます。細孔径は、使用前に塩の結晶を粉砕することで変更できます。

96ウェルプレートをシェーカーに移し、重合が行われるまで振とうします。約10分後、前回と同様にハイドロゲルをプレートから取り出します。ハイドロゲルをローテーター上の滅菌水で室温で少なくとも24時間インキュベートし、ハイドロゲルテンプレートからすべての塩を溶出します。

ハイドロゲルを摂氏4度でPBSに最大数ヶ月間保存します。穏やかな形成のためには、説明されているようにハイドロゲルを調製します。次に、ペンチを使用して溶液からヒドロゲルを取り除きます。

吸収性の高い紙で余分な水分を取り除き、ドライアイスのブロックの上に置きます。ヒドロゲルを30秒間凍結し、ブロックから慎重に取り出します。ハイドロゲルを傷つけないでください。

へらを慎重に使用して、ブロックからこすり落とします。ハイドロゲルを1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏37度で一晩乾燥させます。ローダミンBストック溶液と、テキストプロトコルに記載されている段階希釈液を調製します。

保存した溶液からヒドロゲルを取り出し、1ミリリットルあたり0.01ミリグラムのローダミンB溶液を1ミリリットル入れた1.5ミリリットルのチューブに移します。ハイドロゲルをローダミンB溶液で室温で一晩染色します。翌日、視覚化するヒドロゲルを10ミリリットルのPBSに移し、少なくとも3時間洗浄します。

ブレードを使用してハイドロゲルから小さなスライスを切り取ります。次に、ハイドロゲルを8ウェルの顕微鏡スライドに移し、PBSで覆います。共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、514ナノメートルの波長でヒドロゲルを視覚化します。

滅菌 0.45ミクロンのフィルターですべてのストック溶液をろ過します。ハイドロゲルの調製を開始し、ヒドロゲル重合の前に細胞接着ペプチドを含めます。成分を混合した後、底が完全に覆われるまで、混合物を直ちに8ウェルの顕微鏡スライドにピペットで移します。

細胞を、ウシ胎児血清、ペニシリンストレプトマイシン、および非必須アミノ酸溶液を添加した予熱滅菌DMEM細胞培養培地に移します。ノイバウアー計数チャンバーで細胞を計数した後、必要な数の細胞200マイクロリットルをヒドロゲル表面に慎重にピペットで移します。8ウェル顕微鏡スライドを蓋で覆い、インキュベーターに移します。

細胞接着から少なくとも4時間経過した後、200マイクロリットルの滅菌細胞培養PBSで細胞を2回洗浄します。次に、細胞を200マイクロリットルの3.7%ホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSで2回洗浄します。200マイクロリットルの0.1%Triton Xで細胞を5分間透過処理した後、PBSでさらに2回洗浄します。

トルイジンローダミンで細胞を染色するには、5マイクロリットルのメタノールストックと195マイクロリットルのPBSを混合し、室温で細胞に加えます。細胞を暗所で20分間染色した後、PBSで2回洗浄します。514ナノメートルの共焦点顕微鏡を使用して細胞接着特性を調査します。

テキストプロトコルに記載されているように、ヒドロゲルの特性を分析します。ここに示すように、重合して染色されたハイドロゲルには特徴的な構造はありません。ハイドロゲルを異なる温度で凍結乾燥した後、ハイドロゲル内の細孔の平均サイズを最大60ミクロンまで拡張できます。

塩浸出により、細孔径が約10ミクロンの均一なネットワークが得られます。使用前に塩の結晶を粉砕することで、さらにサイズを調整することができます。ドライアイスのブロックに勾配凍結アプローチを使用すると、直径約20ミクロン、長さ数百ミクロンのチャネルが形成されます。

細胞接着部分による官能基化の前に、細胞はハイドロゲルの表面に接着できず、丸い形態を示します。細胞接着ペプチドを材料に供給した後にのみ、細胞は、細胞を材料に適切に接着することを可能にする焦点接着点を見つけます。これは、3D細胞培養アプリケーションで新しい材料を使用するために重要です。

このビデオを見れば、簡単な方法でハイドロゲルの構造を操作する方法を十分に理解できるはずです。この方法は、ほとんどの新規なハイドロゲルシステムに適用でき、細胞培養での使用について学び、使用目的に応じてハイドロゲルの構造を最適化することができます。