E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

このプロトコルの主な目標は、大腸菌O157:H7などの細菌汚染物質を検出できるデュアルモーダルナノセンサーを設計し、合成することです。磁気蛍光ナノセンサーは、酸化鉄ナノ粒子を2段階の手順で官能基化することにより合成されます。まず、ターゲティング抗体をナノ粒子の表面に結合させます。

次に、蛍光色素がそのコーディングにロードされます。これらのモダリティをペアリングすることで、低濃度溶液と高濃度溶液の両方で細菌汚染物質を迅速かつ高感度に検出できます。少量の細菌が存在すると、ナノセンサーは標識抗体の標的化により細菌の周囲に群がります。

この群れは、ナノセンサーの磁気コアと周囲の水プロトンとの相互作用を変化させ、磁気緩和値の変化を高感度に検出することを可能にします。溶液中の細菌汚染物質の濃度が増加すると、スウォーミングが減少し、汚染を定量化する磁気モダリティの能力が低下します。しかし、細菌濃度が増加すると、バイオナノセンサーの蛍光透過も増加します。

このため、磁気モダリティと蛍光モダリティの組み合わせが重要です。この組み合わせにより、大腸菌O157:H7のコロニー形成単位をわずか1つでも数分以内に検出することが可能になりました。磁気蛍光ナノセンサーの合成における最初のステップは、鉄と塩化第二鉄の両方からなる鉄塩溶液の調製です。

鉄は、磁気緩和プラットフォームへの適応を可能にする磁気コアをナノセンサーに提供します。必要な追加の解決策は、ポリアクリル酸と水酸化アンモニウムです。塩酸を鉄塩溶液に導入し、次いでボルテックスしながら水酸化アンモニウム溶液に添加する。

最後にポリアクリル酸溶液を添加し、得られた混合物をさらに1時間ボルテックスし、反応を継続させます。得られた溶液を遠心分離して、より大きな分子を沈殿させ、サイズが100ナノメートル未満のナノ粒子を単離します。その後、溶液を精製のために一晩透析します。

次のステップは、新たに合成された鉄酸ナノ粒子のポリアクリル酸コードに対する標的抗体の結合です。必要な材料には、MESバッファー、EDC、NHS、および選択した抗体が含まれます。まずEDCをナノ粒子溶液に添加し、次にNHS、最後に抗体を添加します。

次に、混合物を卓上ミキサーに3時間置き、反応を続けます。溶液は磁気カラムを使用して精製されます。磁化されたカラムがナノ粒子を捕捉し、遊離抗体のみが排出されます。

その後、カラムをPBSバッファーで洗浄し、結合したナノセンサーを収集します。その後、ナノ粒子は蛍光色素を添加する準備ができており、検出に使用される2番目の重要なモダリティを提供します。当社のナノセンサーの最も重要な特徴の1つは、磁気モダリティと蛍光モダリティの組み合わせであり、これはいくつかの理由で重要です。

まず、モダリティの組み合わせにより、それぞれが他のモダリティをクロスチェックすることができるため、今日使用されているさまざまな診断プラットフォームが直面する最大のハードルの1つである偽陽性や偽陰性のリスクが大幅に減少します。そして第二に、モダリティの組み合わせにより、細菌汚染を検出するだけでなく、定量化できる範囲が大幅に広がります。ナノセンサーの調製における最後のステップは、ナノ粒子のコード化における蛍光色素のカプセル化です。

これは、ボルテックスしながら溶液に色素を添加し、その後、色素がナノセンサーのコーディングに拡散するのをさらに時間をかけることによって簡単に達成されます。その後、完全に機能化されたナノセンサーは、精製のために最後にもう一度透析されます。ナノセンサーの特性評価のために、サイズと蛍光の提出物は、ゼータサイザーと蛍光プレートリーダーを使用して記録されます。

ナノセンサーの小さなサンプルをキュベット水溶液に加え、サイズを記録するためにゼータサイザーに入れます。蛍光分析のために、ナノセンサーのサンプルを96ウェルプレートに置き、蛍光プレートリーダーに挿入します。理想的には、ナノセンサーの直径は約70ナノメートルで、蛍光サブレーションは575ナノメートルです。

ナノセンサーの合成に加えて、実験室で細菌の標的を提供するためには、細菌の培養が必要です。バクテリアのグリセロールストックを使用して、栄養ブロスで培養物を調製します。その後、この溶液をインキュベートします。

最初のインキュベート期間に続いて、広範囲の細菌濃度を達成するために段階希釈が行われます。各濃度の100マイクロリットルを栄養オーガープレートに播種し、次いで24時間インキュベートする。このインキュベーションに続いて、各プレート上のコロニーをカウントして、コロニー形成単位、または各希釈ストックのミルあたりのCFUカウントを決定します。

バクテリアストック溶液が調製されたので、調製したナノセンサーと組み合わせて使用することができます。そして、この特定の血清型の細菌が他の血清型と区別する重要な側面の一つは、他の血清型に感染した場合、感染するためには多くのコロニー形成単位が必要だと仮定することです。しかし、この特定の大腸菌では、10〜100のCFUまたはコロニー形成ユニットがあなたに感染を与えるのに十分です。

私たちの技術は、細菌汚染が1つのコロニーでも見逃せないように確立されています。磁気弛緩計で読み取るための溶液を調製するために、まず300マイクロリットルのPBSをエッペンドルフチューブにピペットで移します。次に、細菌ストックのサンプルを添加し、続いてナノセンサーを添加します。

次に、溶液をガラス管に移し、蒸発を防ぐためにパラフィルムを上に置きます。次に、ガラス管をより大きなNMRチューブの中に入れ、磁気リラクソメーターに挿入します。図のように、バクテリアを含まず、ナノセンサーとPBSのみを含むベースライン溶液を使用して、ベースラインT2の読み取り値を取得します。

次に、さまざまな濃度の細菌を含む溶液を分析のために磁気弛緩計に挿入し、ナノセンサーと細菌との間の結合によってT2値の変化を引き起こします。示されているように、このモダリティを使用すると、わずか1つの細菌CFUの存在を数分以内に検出できます。しかし、細菌濃度が上昇すると、MRの読み取り値は定量化しにくくなるため、蛍光サブミッションデータの使用も正確な細菌の定量

蛍光データを収集する前に、まずサンプルを遠心分離する必要があります。溶液をガラス管からエッペンドルフ管に移し、遠心分離します。これにより、細菌とそれに結合したナノセンサーが、溶液中の自由に浮遊するナノセンサーから分離されます。

上清は廃棄され、細菌ペレットはPBSに再懸濁されます。最後に、サンプルは蛍光提出によって分析できます。発光の強度は、溶液中に残っているナノセンサーの量、したがって存在する細菌の量にも比例します。

ご覧の通り、蛍光の入射は細菌濃度が増加すると強化され、感度も高くなります。これが、磁気モダリティと蛍光モダリティの両方を組み合わせることで、初期および後期の発達段階における細菌汚染の検出と定量化を可能にする理由です。これらのナノセンサーは、PBSなどの単純な溶液中の細菌の検出に加えて、湖の水や牛乳などのより複雑な媒体でも機能する能力も備えています。

さらに、これらのナノセンサーは、非標的細菌の存在下での特異性、および熱不活化標的細菌の存在下での特異性について試験されています。図に示すように、磁気蛍光ナノセンサーは、標識抗体の特異性により、非標的細菌または非生物細菌とはほとんどまたはまったく反応しません。これは、他の種の存在下での特定の細菌の検出に対するそれらの有効性を示しています。

最後に、これらのナノセンサーは、他の病原体の検出にも簡単にカスタマイズできることに注意してください。私たちの研究室で行ったこれらのナノセンサーを合成することも、1ヶ月以内に配合することもできます。あなたは1ヶ月以内にそれを行うことができ、その製品の1ヶ月はあなたに10年のような適用を与えることができます。