Name: E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ磁気蛍光ナノセンサーの設計と合成法。E. coli O157:H7などの病原菌を迅速かつ高感度に検出するデュアルモーダルアプローチを用い、鉄酸化物ナノ粒子に抗体と蛍光色素を導入する手法を解説します。

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この作品は、K INBRE P20GM103418、カンザス大豆委員会 (KSC/PSU 1663 年)、ACS PRF 56629 UNI7 と SS にすべて電源ユニット高分子化学スタートアップ資金によってサポートされます。ビデオと彼の顕著な仕事のため大学のビデオグラファー、ジェイコブ アンセルミ氏に感謝いたします。我々 もありがとう氏のロジャー ・ Heckert と夫人カタ Heckert 研究のための彼らの寛大なサポート。

1. 合成と多パラメトリック磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) の機能化。
<ol><li>超常磁性酸化鉄の合成ナノ粒子 (IONPs) <ol><li>IONP 合成に備えて準備次の 3 ソリューション: ソリューション 1: した FeCl 3 (0.70 g) とした FeCl 2 H 2 O (2 mL)、ソリューション 2: NH 4 ああ (2.0 mL、13.4 M) H 2 O (15 mL)、ソリューション 3: ポリアクリル酸 (0.855 g) H 2 O (5 mL).</li>
		<li>は、ソリューション 1 に 2 M 塩酸 (HCl) の 90 μ l 添加しすぐに 875 rpm でボルテックスしながらソリューション 2 を混ぜます。解決策 3 を追加します。60 分のボルテックスを続ける</li>
		<li>1,620 x g に 20 分間遠心遠心 2,880 x g に 20 分間清</li>
		<li>は、透析による最終的な上澄みを浄化します。透析バッグに上澄みを追加 (MWCO 6 &#8722; 8 K)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) が含まれているビーカーに配置 (pH = 7.4) とスピン バー。それはすべて 2-3 h. 新鮮なバッファーに置き換えて、12 時間浸してみましょう</li>
	</ol></li> <li>IONPs の表面にターゲット固有の抗体の共役 <ol><li>次の 4 つのソリューションを準備: ソリューション a: 5 mg 1-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) 250 μ L MES のカルボジイミド塩酸塩 (EDC) [2-(N-morpholino) ethanesulfonic 酸] バッファー (0.1 M、pH = 6.8)、ソリューション b: 3 mg N-(NHS) の MES バッファーの 250 μ L (0.1 M、pH = 6.8)、IgG1、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4) の 225 μ L で、大腸菌 mAb のソリューション c: 5 μ g、IONP ソリューション d: 4 ml (5.0 m モル) を 1 mL の PBS (pH 7.4)。</li>
		<li>追加 2 (N Morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー溶液をすぐに追加溶液ソリューション d 15 内の小さな単位で s、混合の各付加の後でソリューションを反転します</li>。
		<li>はすぐに 3 分間にわたって少しずつソリューション d ソリューション B を追加する開始します。各付加の後でソリューションを反転してミックスします</li>。
		<li>混合の各付加の後でソリューションを反転ソリューション C を 5 μ L の単位でソリューションに追加します</li>。
		<li>反応室温で 3 時間して一晩 4 ° C で孵化を続行するを許可します</li>。
		<li>PBS を使用する磁気の列を介して結果 Ab 共役 IONPs を浄化する (pH 7.4、決勝 [Fe] を = = 3.5 mmol) 任意の非抗体を削除します。
		<ol><li>PBS (1 mL) で洗浄磁気の列。磁気プレートに列を添付し、IONP ソリューションを追加します</li>。
			<li>は、PBS (1 mL) の磁気コラムを再度洗浄します。磁気プレートから磁気の列を削除します。PBS を列に追加し、ソリューションを収集します。4 ° C でストア</li></ol></li></ol></li> <li>カプセル化蛍光 1, 1 の &#39; - Dioctadecyl - 3,3,3 &#39; 3、&#39;-Tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 色素標識抗体 IONPs を使用してのポリアクリル酸 (PAA) のコーティングに、溶媒拡散法。
	<ol><li>、IONPs の 4 mL に追加滴 2.0 μ L で 1100 rpm 連続混合 DMSO の 100 μ L の DiI 色素 (2 mmol) の</li>。
		<li>[Fe] の最終的な鉄濃度を最終的な MFnS ソリューションの作成、PBS に対して得られた溶液 (12 h MWCO 6-8 KDa) を dialyze = 2 モル</li>。
	</ol></li> <li>MFnS 特性 <ol><li>吸光光度分析用プレート リーダー 595 で蛍光性の放出でカプセル化された DiI 染料を検出する nM</li>。
		<li>動的光散乱法による <ol><li>が平均サイズとは MFnS の表面電荷を決定する zetasizer に MFnS ソリューションのサンプルを配置します 。
			注: ここでは、平均サイズと機能 MFnS の表面電荷ことがわかった 77.09 nm と-22.3 mV、それぞれします</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 2。細菌の培養とストックに調製した溶液 <ol><li>細菌培養 <ol><li>水和物の凍結乾燥ペレット (E. 大腸菌 o157: h7) 栄養流体培養基の 1 mL にし、スープの追加 5 mL を追加します</li>。
		<li>寒天培地と連勝するには、このソリューションの適用 100 μ L を使用して滅菌接種ループ、37 ° C 24 時間で孵化が続く</li>
		<li>後 24 h、寒天板から隔離されたコロニーを選択し、15 mL の培養液を追加します。光学濃度値を監視しながら 4-6 時間、37 ° C で孵化させなさい (吸光度 600 nm).</li>
		<li>0.1 の光学密度値を取得した後、培養を停止し、シリアル希薄を実行します</li>。
	</ol></li> <li>シリアル希薄 <ol><li>8 つの滅菌遠心チューブに栄養流体培養基の追加 900 μ L.</li>
		<li>初の管 (希釈 10 -1) に細菌懸濁液の追加 100 μ L.</li>
		<li>最初から取る 100 μ L チューブ 10 -2 の希釈を取得する、2 番目に追加.残りのチューブ、最終希釈 10 -8 で終わるこのパターンを続ける</li>。
		<li>寒天培地プレートを分離し、37 で 24 時間インキュベート各チューブから転送 100 μ L ° C</li>
		<li>次の日は、各プレート上 (CFUs) の単位を形作っているコロニーをカウントします。〜 100 CFUs のプレートを選択します。さらに実験のための対応する希釈を使用 (100 μ L = 100 ~ CFUs). 
		注: ここにそれは 〜 100 CFUs の結果 10 -6 希釈します</li>。
	</ol></li></ol> 3。迅速な検出の E. 大腸菌 o157: h7 MFnS を使用して <ol><li>スパイク 1 ~ 100 CFU 範囲の結果 10 -6 細菌の在庫の増加額で様々 な PBS ソリューション (1 X、pH 7.4 では、300 μ L)。MFnS の一貫した量を追加 (100 μ L) これらのソリューションにします</li>。
	<li>PBS (1 X、pH 7.4 では、300 μ L) のみが含まれている 1 つのベースライン ソリューションを作成し、MFnS (100 μ L).</li>
	<li>37 ° C で 30 分のためのソリューションをインキュベートし、部屋の温度を冷ますします</li>。
	<li>磁気 relaxometer (0.47 テスラ) と各ソリューションの CFUs 基準緩和時間 (T2) の変更を記録する個々 のソリューションを転送します。
	<ol><li>T2 値の変化を記録、PBS と MFnS のみを含むベースライン ソリューションの T2 値を測定することによって開始します。
		<ol><li>磁気でソリューションの場所 relaxometer。それぞれのソフトウェアを開き、選択、&#34; T2 緩和 &#34; 設定を押し &#34; 測定 &#34;</li></ol></li> <li>様々 なスパイクが追加のソリューションの T2 値を測定基準 T2、のコレクションを次。細菌の濃度. 
		注意: T2 に変更、ベースライン スパイク T2 から減算 T2 に相当します</li>。
	</ol></li> <li>磁気 relaxometer からのサンプルを削除し 2880 x g で 10 分間のチューブを遠心分離</li>
	<li>上清を捨て、100 μ L の PBS (1 X、pH 7.4) の細菌のペレットを再懸濁します</li>。
	<li>96 ウェル プレートと 595 でのレコードの蛍光強度をそれぞれの巻き上がりを追加 80 μ L nM 。
	注: テスト繰り返すことができる結果のセクションで説明するように、湖の水、ミルクなど、異なる溶媒を用いた</li></ol>

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</ol>

このナノテクノロジーの実証済みのアプリケーションは、まだ FDA によって承認されていません。

このプロトコルは、単に完全に機能の MFnS を生成する設計されている可能な限り。ただし、プロトコルの変更、ユーザーの目的に応じて、役に立つかもしれない多くの重要なポイントがあります。たとえば、異なった抗体の使用は他の多くの病原体の対象になります。さらに、このプロトコルは抗体分子をターゲットとしての使用に限定ではありません。ホスト細胞受容体などのターゲットの病原体の特定の結合親和性のある分子は、分子をターゲットとして使用する場合があります。ターゲット分子第一次アミンまたはアルコール グループ、または 1 つが機能することができます、限りは、プロトコルに記載されている EDC/NHS 共役化学によると酸化鉄ナノ粒子の表面に共役があります。第二に、各検出ソリューションで使用される MFnS の量は変わるかもしれない。(溶剤と対象病原体なしナノセンサーのみ含む) ベースライン ソリューションの T2 値は 100-250 ミリ秒の範囲で基準値が 100、以下の場合、T2 値の変化は敏感になりますので、十分を使用することが重要です。、ナノセンサーの過剰による。ベースライン T2 ...

両方の細菌汚染度の永続的な発生市販食品と水の源はますます急速なと特定の診断プラットフォームの必要性を作成しました。1,2より一般的な細菌汚染食料と水の汚染のための責任の一部はサルモネラ、黄色ブドウ球菌、リステリア菌、腸炎ビブリオ、赤痢菌、細菌、大腸菌属です。3,4多くの場合これらの病原体が細菌汚染の結果熱、コレラ、胃腸炎、下痢などの症状。4しばしば水源の汚染が十分にろ過された水へのアクセスなしでコミュニティに抜本的な不利な影響と食品汚染が病気や製品のリコールの努力の偉大な数につながっています。5,6
細菌汚染に起因する病気の発生を減らすために、水と食品を効率的にスキャン販売または消費する前に方法を開発する努力の数がずっとあります。1,7,8,9,10 12ループ lamp 法 (11,, elisa 法、PCR などの3手法ランプ)13,14 15、16,17,18,19,20,21、 22,23,24は、最近様々 な病原体の検出に使用されています。伝統的な細菌の培養方法と比較して、これらの技術、特異性と時間に関してはるかに多く効率的です。しかし、これらの技術はまだ偽陽性とネガ、複雑な手順、コストと戦います。1,3,25細菌検出のための代替方法として多重磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) を提案する、まさにこの理由のためです。
これらナノセンサーでの磁気緩和と迅速かつ適確なデュアル検出プラットフォームを可能にする蛍光のモダリティのペアリング方法一緒に一意に。E. 大腸菌o157: h7 を使用すると、サンプルの汚染物質として、分以内として少し 1 CFU を検出する MFnS の能力を発揮します。病原体特異抗体は特異性を上げるため、磁気や蛍光灯のモダリティの組み合わせにより、検出の両方の低と高の汚染範囲の細菌汚染の定量化。16細菌汚染の場合、ナノセンサー、細菌病原体特異的抗体のターゲットの能力のため周辺群発地震します。磁気ナノセンサーと細菌の間のバインドは、磁気鉄のコアと周辺の水のプロトン間の相互作用を制限します。これは磁気 relaxometer で記録された T2 緩和時間の増加を引き起こします。ソリューションにおける細菌の濃度が上昇すると、T2 値が小さい結果、細菌数の増加など、ナノセンサーを分散します。逆に、病原体を直接バインド ナノセンサーの数が増えたため、細菌の濃度に比例した蛍光性の放出が増えます。サンプルの遠心分離と分離細菌のペレットのみ任意の浮遊ナノセンサーを取り外して直接関連付けの数と蛍光性の放出、細菌に直接接続されているナノ粒子を節約します。ソリューションに存在する細菌。このメカニズムの概略は、図 1で表されます。
この MFnS プラットフォームは、ポイント ・ オブ ・ ケア スクリーニング低コスト ・ ポータブルの特性で、心で設計されています。MFnS は常温で安定しているし、細菌汚染の正確な検出のための非常に低濃度で必要なだけです。さらに、合成後に、、MFnS の使用は簡単、分野で訓練を受けた専門家の使用を必要としません。最後に、この診断プラットフォームにより高度なカスタマイズをターゲットに、さまざまな設定のすべての種類の病原体を検出する 1 つのプラットフォームを使用可能性があります、この手段を提供します。

<table><tbody><tr><td>塩化第一鉄四水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>I90-500</td><td></td></tr>塩化<tr><td>第二鉄六水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>I88-500</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A669S-500</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>ポリアクリル酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157270250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O111 抗体&nbsp;</td><td>sera care</td><td>5310-0352</td><td></td></tr><tr><td>抗大腸菌 O157:H7 抗体 [P3C6]&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab75244</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Difco</td><td>233000</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥大腸菌 O157:H7 ペレット</td><td>ATCC</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Relaxomteter&nbsp;</td><td>ブルカー</td><td>mq20</td><td></td></tr><tr><td>ゼータサイザー</td><td>マルバーン</td><td>NANO-ZS90</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックカラム&nbsp;</td><td>QuadroMACS</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804 シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 (accuSpin Micro 17)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>フロアモデル 振とうインキュベーター</td><td>SHEL LAB</td><td>SSI5</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>Metler Toledo</td><td>ME104E</td><td></td></tr><tr><td>デジタルボルテックスミキサー</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>オープンエアロッキングシェーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02-217-765</td><td></td></tr></tbody></table>

e. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

腸管出血性大腸菌o157: h7 は、水性の両方にリンクされている媒介する病気と食料と水上映方法にも関わらず脅威は現在使用されるまま。従来の細菌検出方法、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)、酵素抗体法 (ELISA) 特に病原性の汚染物質を検出できるよう彼らが豊富なサンプル準備と待機時間が長く必要です。さらに、これらのプラクティスは洗練された実験室の器械と設定、要求し、訓練を受けた専門家によって実行される必要があります。ここで、ナノ粒子ベースのプラットフォームの磁気および蛍光パラメーターの一意の組み合わせを備えて簡単診断技術のためのプロトコルを提案します。提案多重磁気蛍光ナノセンサー (MFnS) は、大腸菌o157: h7 汚染としてはほとんど 1 コロニー形成単位未満 1 時間以内のソリューションに存在を検出できます。牛乳など複雑なメディアで高機能を維持する MFnS の能力をさらに、湖の水を確認します。その他特異性アッセイも同じような細菌種の存在下でも、特定のターゲット細菌のみを検出する MFnS の能力を発揮する使用されました。検出の両方の初期と後期段階の汚染検出でその高性能を出展、濃度の広い範囲の病原体汚染の定量化により、磁気や蛍光灯のモダリティのペアリングします。有効性、手頃な価格、および、MFnS の移植性から作ることがポイント ・ オブ ・ ケア スクリーニング細菌汚染のための理想的な候補の設定の広い範囲で市販加工食品に水生の貯水池。

MFnS の作用機序は、図 1で表されます。細菌汚染物質の表面周囲の MFnS のクラスタ リングは、MFnS の magnetic cores と周囲の水素原子核の相互作用を妨げます。このクラスタ リング、磁気緩和の結果として値が増加します。細菌汚染の濃度が増えると、クラスタ リングが縮小し、T2 値の変動が減少します。したがって、蛍光のモダリティの追加が重要です。細菌の濃度が増えると、MFnS によって生成される蛍光信号の強度が増加し、両方の低と高濃度範囲内の細菌汚染の高感度の検出を可能にします。
次のプロトコルは、16 MFnS を合成し、まず PBS (1 X、pH 7.4) のソリューションでテストします。検出、磁気緩和のため初期のモダリティは、T2 値の変化を記録する使用されました。プロトコルに従ってサンプル遠心し、ペレットが再停止され、蛍光のデータが収集されました。対応する ΔT2 と蛍光発光値は、図 2</strong...

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

本プロトコルの主な目的は、E.coli O157:H7などの細菌汚染物質を検出可能なデュアルモードナノセンサーを設計および合成することです。磁性蛍光ナノセンサーは、2段階の手順を経て酸化鉄ナノ粒子を機能化することにより合成されます。まず、標的抗体をナノ粒子の表面に結合させます。次に、蛍光染料をそのコーティングにロードします。これらのモダリティを組み合わせることで、低濃度および高濃度の両方の溶液中において、細菌汚染物質を迅速かつ高感度に検出することが可能になります。少量の細菌が存在する場合、結合した抗体のターゲティングにより、ナノセンサーが細菌の周囲に集結します。この群泳（スウォーミング）により、ナノセンサーの磁性コアと周囲の水プロトンとの相互作用が変化し、磁気緩和値の変化を感度良く検出することが可能になります。溶液中の細菌汚染物質の濃度が高くなると群泳が減少し、磁気モードによる汚染定量能が低下します。しかし、細菌濃度が高くなるにつれて、バイオナノセンサーの蛍光放出量も増加します。このような理由から、磁気および蛍光という2つのモダリティを組み合わせることが重要となります。この組み合わせにより、わずか1 CFUのE.coli O157:H7を数分以内に検出することが可能になりました。磁気蛍光ナノセンサ合成の最初のステップは、塩化第一鉄と塩化第三鉄の両方からなる鉄塩溶液を調製することです。鉄を添加することで、ナノセンサーに磁性コアが付与され、磁気緩和プラットフォームへの適応が可能になります。さらに、ポリアクリル酸と水酸化アンモニウムの溶液が必要です。塩化水素を鉄塩溶液に導入し、その後、ボルテックスミキサーで撹拌しながら水酸化アンモニウム溶液に加えます。最後にポリアクリル酸溶液を添加し、反応を継続させながら、得られた混合物をさらに1時間ボルテックスします。その後、大きな分子を沈殿させ、サイズが100 nanometers未満のナノ粒子を単離するために、得られた溶液を遠心分離します。最後に、精製のために溶液を一晩透析します。次のステップは、新たに合成した鉄酸ナノ粒子のポリアクリル酸コーティングに、標的抗体をコンジュゲートすることです。必要な材料は、MESバッファー、EDC、NHS、および選択した抗体です。まずナノ粒子溶液にEDCを加え、次にNHSを、最後に抗体を加えます。その後、混合物を卓上ミキサーにかけ、反応を継続させながら3時間撹拌します。続いて、磁気カラムを用いて溶液を精製します。磁気カラムでナノ粒子を捕捉することで、遊離抗体のみを回収します。その後、カラムをPBS緩衝液で洗浄し、接合させたナノセンサーを回収します。これでナノ粒子に蛍光色素を添加する準備が整い、検出に使用する2つ目の重要なモダリティが付加されます。本ナノセンサーの最も重要な特徴の一つは、磁気モダリティと蛍光モダリティを組み合わせていることであり、これは多くの理由から重要です。第一に、これらの手法を組み合わせることで、それぞれが相互に検証し合うことが可能になり、今日のさまざまな診断プラットフォームが直面している最大の課題の一つである偽陽性および偽陰性のリスクを大幅に低減できます。第二に、手法を組み合わせることで、細菌汚染を検出するだけでなく定量化できる範囲を大幅に広げることができます。ナノセンサー調製の最終ステップは、ナノ粒子のコーティング内に蛍光染料を封入することです。これは、ボルテックス操作を行いながら溶液に染料を添加し、染料がナノセンサーのコーティングに拡散するまでさらに時間を置くことで簡単に達成できます。その後、完全に機能化したナノセンサーを精製するために、最後にもう一度透析を行います。ナノセンサーを特性評価するため、ゼタサイザーと蛍光プレートリーダーを用いて、サイズと蛍光強度を記録します。ナノセンサーの少量サンプルをキュベット内の水溶液に加え、ゼタサイザーにセットしてサイズを測定します。蛍光分析では、ナノセンサーのサンプルを96ウェルプレートに分注し、蛍光プレートリーダーに挿入します。理想的なナノセンサーの直径は約70 nanometersであり、575 nanometersの蛍光放出を示します。ナノセンサーの合成に加えて、ラボ内で細菌標的を確保するために細菌の培養が必要です。栄養ブイヨンで培養液を調製するために、細菌のグリセロールストックを使用します。その後、この溶液をインキュベートします。初期培養期間の後、広範囲の細菌濃度を得るために段階希釈を行います。各濃度の溶液100 µLを栄養寒天培地に塗抹し、24時間培養します。この培養後、各プレート上のコロニー数を計測し、各希釈ストック1 mLあたりのコロニー形成単位（CFU数）を決定します。細菌のストック溶液が調製されましたので、これらを調製済みのナノセンサーと共に使用することが可能です。この特定の血清型の細菌において、他の血清型と区別される重要な点があります。例えば、他の血清型に感染した場合、感染が成立するには多くのコロニー形成単位（CFU）が必要になります。しかし、この特定のE.coliの場合、10から100 CFUのコロニー形成単位があれば、感染を引き起こすのに十分です。当社の技術は、単一のコロニーであっても細菌汚染を見逃さないように確立されています。磁気リラクソメーターで測定するための溶液を調製するには、まず300 µLのPBSをエッペンドルフチューブにピペットで分注します。次に、細菌ストックのサンプルを加え、続いてナノセンサーを添加します。次に、溶液をガラス管に移し、蒸発を防ぐために上にパラフィルムを貼ります。その後、このガラス管をより大きなNMRチューブに入れ、磁気リラクソメーターに挿入します。図に示すように、細菌を含まず、ナノセンサーとPBSのみを含むベースライン溶液を用いて、ベースラインのT2値を測定します。次に、さまざまな濃度の細菌を含む溶液を磁気リラクソメータに挿入して分析します。T2値の変化は、ナノセンサーと細菌の結合によって生じます。図に示されているように、この手法を用いることで、わずか1 CFUの細菌であっても数分以内に検出可能です。しかし、細菌濃度が高くなるとMR測定値の定量性が低下するため、正確な細菌定量には蛍光放出データの利用も同様に重要となります。蛍光データを収集する前に、まずサンプルを遠心分離する必要があります。溶液をガラスチューブからエッペンドルフチューブに移し、遠心分離を行います。これにより、細菌およびそれに結合したナノセンサーを、溶液中の遊離ナノセンサーから分離させます。上清を捨て、細菌ペレットをPBSで再懸濁します。最後に、蛍光測定によりサンプルを分析します。放出される蛍光強度は、溶液中に残っているナノセンサーの量、したがって存在する細菌の量に相関します。見ての通り、細菌濃度が高くなるにつれて蛍光信号が強まり、感度も向上します。そのため、磁気および蛍光の両方のモダリティを組み合わせることで、初期および後期の両方の発生段階における細菌汚染の検出と定量が可能になります。これらのナノセンサーは、PBSのような単純な溶液中の細菌検出だけでなく、湖水や牛乳などのより複雑な媒体においても機能する能力を備えています。さらに、これらのナノセンサーを用いて、非標的細菌および熱不活化させた標的細菌が存在する場合の特異性を検証しました。結果に示されている通り、結合した抗体の特異性により、磁性蛍光ナノセンサーは非標的細菌または非生存細菌に対してほとんど、あるいは全く反応しませんでした。このことは、他の菌種が存在する環境下においても、特定の細菌を検出する上での有効性を示すものです。最後に、これらのナノセンサーは、他の病原体の検出に向けても容易にカスタマイズが可能であるという点も重要です。当研究室で作成したこのようなナノセンサーの合成および調製は、現在では1ヶ月以内に行うことができます。1ヶ月で作成した製品を、その後10年間にわたって活用することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

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