Name: 細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節アフリカツメガエル胚発生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶ光遺伝学によるMAPK経路の可逆的制御法。Xenopus胚発生における細胞分化とシグナル伝達動態を高時空間分解能で解析し、発生生物学の理解を深める強力なツールを提供します。

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この研究は、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校（UIUC）および国立衛生研究所（NIGMS R01GM111816）の支援を受けました。

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

ライトボックスを構築するときは、個々のLEDのパワーを測定する必要があります。以前の経験に基づいて、出力のばらつきは、製造ばらつきのために個々のLEDによって異なることがあります。お互いの電力出力が10％以内のLEDセットを選択します。 LEDの数、電流制限抵抗、および電源入力は、異なるタイプの細胞培養容器（ 例えば、 6ウェルまたは24ウェルプレート）に対して変更することができる。 0.2mW / cm 2の出力での24時間の光照射は、検出可能な光毒性44を誘発しない。より高い電力が使用される場合は、間欠的な光を使用して発熱と光毒性を低減することを検討してください。このプロトコールで導入された光発生系は、2つの隣接する光パルスの間の暗い間隔が45分未満である場合、連続的な光刺激に匹敵する断続的光刺激下でのPC12細胞における神経突起伸長を誘導する44 。支払期日タンパク質の会合および解離の動力学における本質的な相違に対して、光パルス間の持続時間は、各固有のタンパク質対について調整されなければならない。...

増殖因子は、増殖、分化、遊走、およびアポトーシスを含む広範囲の細胞機能に関与し、胚発生、老化および精神状態の調節1,2,3,4,5などの多くの生物学的事象において中心的な役割を果たす。 5 。多くの増殖因子は、複雑な細胞内シグナル伝達カスケードを介してシグナル伝達する。これらのシグナル伝達事象は、しばしば可逆的なタンパク質リン酸化によって正確に制御された様式で操作される6,7。従って、タンパク質リン酸化を担うプロテインキナーゼのシグナル伝達結果の理解は基本的に重要である。 異なる成長因子は、それらがdistを刺激するにもかかわらず、むしろ一般的な細胞内シグナル伝達ネットワークを介して作用するinct細胞応答8,9 。レセプターチロシンキナーゼの一般的な細胞内メディエーターには、Ras、Raf、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）/ ERKキナーゼ（MEK）、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）、AktおよびホスホリパーゼCガンマ（PLCγ） 10,11 。シグナリングの多様性および特異性は、シグナル伝達活性の空間的および時間的調節に依存することが示唆されている12 。例えば、ラット褐色細胞腫細胞（PC12）において、細胞増殖をもたらす表皮成長因子（EGF）刺激は、ERK経路を一時的に活性化する9 。一方、細胞分化につながる神経成長因子（NGF）による刺激は、ERK経路を持続的に活性化させる9,13。培養rにおいて海馬ニューロンでは、脳由来神経栄養因子（BDNF）による一過性シグナル伝達が原発性神経突起伸長を促進するが、持続シグナル伝達は神経突起分岐の増加14につながる。初期胚発生の間、リン酸化されたERK活性は時間的に動的であり、胚6に広がっている。初期のアフリカツメガエル胚発生中の最近の遺伝子スクリーニングでは、下流の原発性増殖因子経路の2つのERKおよびAktシグナル伝達カスケードがステージ特異的活性化プロファイルを示すことが示された7 。したがって、キナーゼシグナル伝達結果の理解は、十分な分解能でキナーゼ活性の空間的および時間的特徴を調べることができるツールを必要とする。 開発中のシグナル伝達の動的性質を調べるための従来の実験的アプローチは、望ましい空間的および時間的解像度を欠く。例えば、薬理学的アプローチは、細胞または組織中のシグナル伝達を刺激または抑制するための生体分子または生体分子である。これらの小分子の拡散性は、その作用を特定の関心領域15に制限することを困難にする。遺伝的アプローチ（ 例えば、遺伝子導入、Cre-Loxシステム、または突然変異誘発）は、しばしば標的遺伝子発現またはタンパク質活性の不可逆的な活性化または抑制を導く16,17,18。 Tet-On / Tet-Offシステム19は、遺伝子転写の改善された時間的制御を提供するが、テトラサイクリンの拡散に依存するため、厳密な空間制御を欠いている。化学的に誘導されたタンパク質二量体化20または光未結合化21,22,23,24の最近の進展は、シグナリングネットワークの時間的制御を可能にする。しかしながら、空間制御は、ケージド化学物質の拡散性のために依然として困難である。 タンパク質 - タンパク質相互作用を制御するために光のパワーを利用する最近の出現するオプトジェネティックアプローチは、高い時空間精度および可逆性を有するシグナル伝達経路の調節を可能にする。ニューロンの発火を制御する初期の成功の直後に、遺伝子の転写、翻訳、細胞遊走、分化、およびアポトーシスなどの他の細胞プロセスを制御するためにオプトジェネティクスが拡張されている28,29,30,31,32,33 、 34 。 pを使った戦略（CRY2）タンパク質とクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインは、最近、哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル胚のRaf1キナーゼ活性を制御するために開発された35 。 CRY2は、青色光刺激によりCIBNに結合し、CRY2 / CIBNタンパク質複合体は暗所で自発的に解離する。青色光は、CRY2補因子、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を励起し、これはCRY2の構造変化およびその後のCIBNへの結合をもたらす。 CRY2 W374A突然変異体は光とは無関係にCIBNに結合するが、CRY2 D387A突然変異体は青色下でCIBNに結合しないが、CRY2の構成的に活性な（W374A）突然変異体およびフラビン欠損（D387A）突然変異体は、軽い刺激36,37 。私が記述した光発生系このプロトコールは、野生型CRY2およびCIBNを用いて、生存細胞におけるタンパク質転位置媒介性Raf1活性化を誘導する。 Raf1の膜動員がその活性を増強することが知られている38 。このシステムでは、タンデムCIBNモジュールが原形質膜に固定され、CRY2-mCherryがRaf1 35の N末端に融合される。青色光が存在しない場合、CRY2-mCherry-Raf1は細胞質にとどまり、Raf1は不活性である。青色光刺激は、CRY2-CIBN結合を誘導し、Raf1が活性化される原形質膜にRaf1を動員する。 Raf活性化は、Raf / MEK / ERKシグナル伝達カスケードを刺激する。 CRY2-およびCIBN-融合タンパク質の両方は、バイシストロン性の遺伝子系においてコードされる。この戦略は、Aktのような他のキナーゼを制御するために一般化することができ、その活性化状態は細胞39内のタンパク質転座によってもターンオンすることができる。この研究は、哺乳動物細胞培養におけるこの光発生戦略を実施するための詳細なプロトコールを提示するresおよび多細胞生物である。

<table><tbody><tr><td>ガラスカバースリップ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 230</td><td>ライブセルイメージング用基板</td></tr><tr><td>カバースリップホルダー&nbsp;</td><td>ニューカマーサプライ</td><td>6817B</td><td>カバースリップ用ホルダー</td></tr><tr><td>洗剤&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16 000 104</td><td>カバースリップのクリーニング用</td></tr><tr><td>ホウ酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td>PLLバッファー製造用</td></tr>四<tr><td>ホウ酸二ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71996-250G</td><td>製造用&nbsp;PLLバッファー</td></tr><tr><td>プラスチックビーカー</td><td>Nalgene</td><td>1201-1000</td><td>カバースリップのクリーニング用</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2.5KG</td><td>pH調整用</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン臭化水素酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274-500MG</td><td>コーティング用 カバースリップ</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック750024</td><td>DNA調製用</td></tr><tr><td>カバーガラス鉗子</td><td>テッド・ペラ</td><td>5645</td><td>カバーガラスの取り扱い</td></tr><tr><td>ティッシュカットルアーディッシュ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12565321</td><td>細胞培養皿</td></tr><tr><td>滅菌遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-565-271</td><td>バッファー保存</td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>R0534</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>CO2非依存培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>18045088</td><td>ライブセルイメージング用</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>エルスワース 接着剤</td><td>184 SILエラストキット 0.5KG</td><td>フォームメイクセルチャンバー</td></tr><tr><td>プラスミド Maxiprepキット</td><td>Qiagen</td><td>12965</td><td>プラスミド調製</td></tr><tr><td>DMEM培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11965-084</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>F12K培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21127022</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16050122</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Signa-Aldrich</td><td>12303C-500 mL</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10378016</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>トリプシン (0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15050065&nbsp;</td><td>哺乳類細胞の解離に</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP1356-100</td><td>DNA調製用</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>胚緩衝液用</td></tr><tr><td>L-システイン塩酸塩一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.02839.0025</td><td>卵母細胞調製</td></tr><tr><td>ApaI</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1414</td><td>プラスミドの直鎖化用</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2222</td><td>in vitro転写アッセイにおけるDNAテンプレートの除去用</td></tr><tr><td>インデックスマッチ材料(液浸油)</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-20LN</td><td>サンプル基板と対物レンズとの間のインデックスマッチング用</td></tr><tr><td>青色LED</td><td>Adafruit</td><td>301</td><td>光遺伝学的刺激用光源</td></tr><tr><td>抵抗器キット</td><td>Amazon</td><td>EPC-103</td><td>電流制限抵抗器</td></tr><tr><td>アルミボックス</td><td>バドインダストリー</td>ズ <td>AC-401</td><td>ライトボックス&nbsp;</td></tr><tr><td>ブレッドボード</td><td>Jekewin</td><td>837654333686</td><td>LEDアレイ作成用</td></tr><tr><td>フックアップワイヤー</td><td>Electronix Express</td><td>27WK22SLD25</td><td>LEDアレイ作成用</td></tr><tr><td>リレーモジュール</td><td>Jbtek</td><td>SRD-05VDC-SL-C</td><td>間欠光制御用</td></tr><tr><td>DC電源&nbsp;</td><td>TMS</td><td>DCPowerSupply-LW-(PS-305D)</td><td>LEDシリコン用電源</td></tr><tr><td>&nbsp;電源&nbsp;ヘッド</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td>光量測定用</td></tr><tr><td>パワーメーター</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D&nbsp;</td><td>光強度測定用</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>DMI8</td><td>ライブセルイメージング用</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>1300 シリーズ A2</td><td>哺乳類細胞の取り扱い用</td></tr><tr><td>CO2インキュベーター サー</td><td>モフィッシャー</td><td>アイソテンプ</td><td>哺乳類細胞培養用</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M60</td><td>胚のマイクロマニピュレーション用</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>ナリシゲ</td><td>IM300</td><td>胚マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments</td><td>P87</td><td>ニードルプラー</td></tr><tr><td>in vitro転写キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM1340</td><td>in vitro転写用。このキットには、ヌクレアーゼフリーの水、SP6 RNA&nbsp;ポリメラーゼ、リボヌクレオチド混合物、キャップアナログ、チョライドリチウム沈殿液、スピンカラム&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA精製キット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>合成RNAの精製用シリカ膜スピンカラム&nbsp;</td></tr><tr><td>コンベクションオーブン</td><td>MTI株式会社</td><td>&nbsp;EQ-DHG-9015</td><td>PDMS硬化</td></tr>型<tr><td>遠心ミキサー・テフロン容器</td><td>THINKY</td><td>AR310</td><td>PDMS混合用</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>UniversityWafer</td><td>452</td><td>PDMS製造用ベース&nbsp; デバイス</td></tr><tr><td>ブレード</td><td>テクニエッジ</td><td>01-801</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>キャピラリーガラス</td>切断<td>用 サッター機器</td><td>BF100-58-10</td><td>注入針の製作用&nbsp;</td></tr></tbody></table>

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

キナーゼ活性は、細胞増殖、分化、移動、およびアポトーシスを含む多数の細胞機能にとって重要である。初期胚発生の間、キナーゼ活性は非常に動的であり、胚全体に広がっている。薬理学的アプローチおよび遺伝的アプローチは、キナーゼ活性をプローブするために一般的に使用される。残念なことに、これらの戦略を使用して優れた空間的および時間的解像度を達成することは困難です。さらに、生細胞および多細胞生物において可逆的様式でキナーゼ活性を制御することは実現可能ではない。そのような制限は、発達および分化の間のキナーゼ活性の定量的理解を達成するためのボトルネックのままである。この研究は、光活性化可能タンパク質シロイヌナズナクリプトクローム2（CRY2）およびクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインを含むバイシストロン系を利用する光発生戦略を提示する。リバーシマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路の活性化は、生細胞における光媒介タンパク質転位を介して達成される。このアプローチは、哺乳類の細胞培養物および生きている脊椎動物の胚に適用することができる。このバイシストロン系は、類似の活性化機構を有する他のキナーゼの活性を制御するために一般化され、他のモデル系にも適用することができる。

光活性化可能なタンパク質対のレシオメトリックな発現： 図1Aは、ブタ・テスコビルム（teschovirum）由来の二重特異性光学原性構築物であるCRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（CRY2-2A-2CIBNと呼ばれる） 1 2A（P2A）ペプチドであり、哺乳動物細胞株42の中で最も高いリボソームスキッピング効率を示す。以前の研究では、CIBN-GFP-CaaX：CRY2-mCherry-Raf1の最適比は2：1であることが判明した35 。この構成は、CRY2-mCherry-Raf1（ 図1B ）の十分な膜補充および活性化を可能にする。 CRY2-2A-2CIBNを単独でトランスフェクトした細胞は、落射照明下（ 図1C ）または共焦点顕微鏡下（ <stro...

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

本実験の全体的な目的は、光を用いて、生細胞およびアフリカツメガエル（Xenopus）胚におけるミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路を制御することです。この手法は、キナーゼ活性の時間的な変調が細胞分化や胚発生における自己決定をどのように調節しているかなど、細胞生物学および発生生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、生細胞や発生中の胚のような多細胞生物において、MAPK活性を可逆的に制御できることです。この手法により、Xenopusの胚発生におけるシグナリングキネティクスに関する知見を得ることができます。また、本手法はsocotra、ゼブラフィッシュ、マウスなどの他のモデルシステムにも適用可能です。本日は、私の研究室の大学院生であるVishnu Krishnamurthyが、その手順を実演します。そして、私の研究室のポストドクターであるAurora Turgeonが、Xenopus胚を用いたすべての手順を実演します。まず、60 mmのペトリ皿の中にあるステリルPLLコートカバーガラス上に、オートクレーブ滅菌済みのPDMSチャンバーを1つ配置し、細胞培養デバイスを組み立てます。次に、0.25% trypsimを0.5 mL使用し、6ウェル組織培養プレートの1ウェルからpHK21細胞を剥離させます。ヘモサイトメーターで細胞密度を計測した後、200 µLの細胞培養液を用いて、チャンバーに20,000個の細胞を播種します。細胞播種から24時間後、製造元のプロトコルに従い、50〜100 ngのCRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG of PCaA Xプラスミドを細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションの3時間後、培地を200 µLの新鮮な培養液に交換し、37 °C、5% CO2インキュベーター内で培養して、一晩細胞を回復させます。翌日、まず細胞培養液を200 µLのCO₂インディペンデント培地に交換し、光遺伝学的誘導とイメージングを開始します。次に、データ収集プロトコルを設定します。光遺伝学的刺激には488 nm励起のFITCチャネルを、mCherry標識タンパク質の細胞内局在の追跡には561 nm励起のCRITCチャネルを選択します。パワーメーターを対物レンズの窓の近くに配置し、青色光の強度を測定します。CIBNとCRY2-PHRの結合を誘導するには、2 µWの総出力で十分です。5秒間隔でタイムスタンプ取得を設定します。合計の取得時間は2分です。対物レンズの窓に適切な屈折率整合材を塗布してください。セルチャンバーを顕微鏡ステージに設置し、明視野モードを使用して、接眼レンズでカバーガラス表面の細胞に焦点を合わせます。次に、顕微鏡ステージを移動させ、緑色光の下で形質導入された細胞を探します。FITCおよびCITCの両チャンネルで、タイムスタンプ付きの一連の画像を記録します。基本サンプル画像では、CIBNGPCAAXが細胞膜に局在している様子が示されています。こちらは青色光刺激前のCRY2 mCherry raf1のスナップショットであり、一方こちらの画像は、10回の青色光刺激パルス後のCRY2 mCherry raf1のスナップショットを示しています。2枚のブレッドボードに青色LEDを挿入し、電流制限抵抗で接続してLEDアレイを作成します。その後、ブレッドボードをアルミボックスに入れます。2本の金属線を挿入し、基板と電源を接続します。ライトボックスを二酸化炭素インキュベーター内に設置した際に、電線の長さが十分であることを確認してください。その後、ライトボックスのカバーとして機能する透明な光拡散板を設置します。最後に、さまざまな入力電圧における各LEDの出力電力を校正します。24時間のPC12細胞分化アッセイでは、0.2 mW/cm²の電力を使用してください。LEDアレイを、5% CO₂を補充した37 °Cのインキュベーター内に設置します。金属線を用いて電源に接続し、LEDの出力を0.2 mW/cm²に設定します。トランスフェクションしたPC12細胞を含む12ウェルプレートをLEDアレイのウィンドウ上に配置します。すべてのウェルが十分に照射されるようにプレートの位置を調整してください。24時間連続で光照射を行います。分化した細胞をイメージングするため、シングルスナップショットでのデータ収集を設定します。GFPチャンネルとTexasRedチャンネルの両方で200ミリ秒を使用してください。GFPおよびTexasRedの両方のチャンネルで形質導入細胞の画像を撮影し、データ解析用にファイルを保存します。まず、キャピラリープラーを用いてガラスキャピラリーを引き伸ばし、RNAマイクロインジェクション用の針を作製することから始めてください。胚を0.2 XMMRで希釈した3%システインで15分間処理し、ゼリーコートを除去します。胚を、マイクロインジェクション用の3% ポリスクロースおよび0.5X MMR溶液に転移させます。各胚に500 pgから1 ngのCRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNAを正確に注入します。その後、マイクロインジェクション後の胚をマイクロインジェクション溶液中で室温にて培養します。胚が中原腸陥入期に達したら、0.2x MMR溶液に移し、目的の発生段階まで培養を続けます。その後、12ウェルプレートを自作のLEDアレイに設置し、青色光照射を行います。胚に青色光が十分に照射されるよう、12ウェルプレートの上にミラーを配置してください。所定の時間、青色光に曝露した後、組織学的解析、ウェスタンブロット、または遺伝子発現解析のために胚を回収します。この画像は、0.2 mW/cm² の青色光で 24 時間刺激した後の、CRY2-2A-2CIBN を導入した PC12 細胞のマルチチャンネルスナップショットを示しています。GFP および mCherry の両方のリポーターが確認できます。円は分化した細胞を、四角は未分化の細胞を示しています。ここでは、青色光刺激を除いて、前の画像と同じ方法で細胞を処理しました。分化は見られません。これらの細胞は、恒常活性型raf1であるraf1 GFPCaaXをトランスフェクションした後の代表的な結果を示しています。円と四角形は、それぞれ分化した細胞と未分化の細胞を示しています。このヒストグラムは、CA-Raf1をトランスフェクションしたPC12細胞、CRY2 mCherry raf1とCIBN GFP Caaxを共トランスフェクションした細胞、およびCRY2A 2CIBNを単独でトランスフェクションした細胞の分化率を示しています。青色光に曝露された細胞のみが有意な分化を示しました。この画像は、mRNA注入および光処理を行っていない正常なアフリカツメガエル（Xenopus）胚の形態を示しています。この画像は、CRY2 2A2CIBN mRNAを注入し、青色光刺激を与えた胚を示しています。CRY2 2A2CIBNを注入した胚に青色光を照射してraf1を活性化させると、頭部領域に異所的な尾のような構造が誘導されます。この手順を用いることで、例えば、どの段階におけるmitogen activated protein kinase経路の活性化が遺伝子発現を制御しているかなど、さらなる疑問を明らかにすることができます。この光遺伝学的手法は、同様の活性化メカニズムを持つ他のシグナル伝達経路の制御にも一般化して適用することが可能です。

light-mediated-reversible-modulation-mitogen-activated-protein-kinase

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。...

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

簡単な方法は、種々の細胞型における間葉移行（EMT）上皮の誘導のために記載されている。免疫細胞化学によるEMT状態にある細胞の分析のための方法が含まれる。...

間葉転換を誘導し、上皮の分析

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。...

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

この作業では、活性エンハンサーがどのように特定され、実験的に検証されるかについての実験的なワークフローを提供します。...

レチノイン酸誘導された胚性幹細胞分化の間に活性化された予測と遺伝子調節要素の検証

ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。...

ハイスループットインヒビタースクリーニングによる胚性幹細胞の多能性を調節するキナーゼを同定するための簡単な方法

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング...

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。...

浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析

シグナル伝達経路の光遺伝学的操作は、発生、再生、恒常性、および疾患においてシグナル伝達がどのように解読されるかを調べるための強力な戦略となり得ます。このプロトコルは早いゼブラフィッシュの胚の光酸素電圧感知の領域基づかせていた節および骨のmorphogenic蛋白質(BMP)のシグナリングの活性剤を使用するための実用的な指針を提供する。...

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。...

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

私たちは、Xenopus laevisの未熟卵子の操作方法、卵子の卵子へのin...

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

学ぶ光遺伝学によるMAPK経路の可逆的制御法。Xenopus胚発生における細胞分化とシグナル伝達動態を高時空間分解能で解析し、発生生物学の理解を深める強力なツールを提供します。

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節

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