細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節アフリカツメガエル胚発生

この実験の全体的な目標は、無傷の細胞およびXenopus胚におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路を制御するために光を使用することです。この方法は、キナーゼ活性の時間的調節が細胞分化や胚発生中の自己決定をどのように制御するかなど、細胞生物学および発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性を、無傷の細胞や発生中の胚などの多細胞生物において可逆的に制御できることです。

この方法は、Xenopusの胚発生中のシグナル伝達速度に関する洞察を得ることができます。また、ソコトラ、ゼブラフィッシュ、マウスなどの他のモデルシステムにも適用できます。今日は、私の研究室の大学院生、ヴィシュヌ・クリシュナムルティが手順を実演します。

そして、私の研究室のポストスターであるオーロラスタージョンは、Xenopus胚に関連するすべての手順を実演します。まず、オートクレーブ滅菌済みPDMSチャンバー1つを、60 mmシャーレの滅菌PLLコーティングカバースリップ上に置いて、細胞培養デバイスを組み立てます。次に、0.25%トリプシン0.5mLを使用して、6ウェル組織培養プレートの1ウェルからpHK21細胞を分離します。

血球計算盤で細胞密度を数えた後、細胞培養培地の200マイクロリットルに20, 000個の細胞をチャンバーに播種します。細胞プレーティングの24時間後、メーカーのプロトコルに従って、50〜100ナノグラムのCRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMGのPCaA Xプラスミドを細胞にトランスフェクションします。トランスフェクションの3時間後、培地を200マイクロリットルの新鮮な培養培地に変更し、細胞を一晩回復させます 摂氏37度と5パーセントの二酸化炭素インキュベーターで培養物をインキュベートします。

翌日、まず細胞培養培地を200マイクロリットルの二酸化炭素非依存培地に置き換えることにより、光遺伝学的誘導とイメージングを開始します。次に、データ集録プロトコルを設定します。光遺伝学的刺激には488ノメートル励起FITCチャネルを、mCherry標識タンパク質の細胞局在を追跡するには561ナノメートル励起CRITCチャネルを選択します。

ブルーライトのパワーを測定するには、対物レンズの窓の近くにパワーメーターを設置します。CIBN CRY2-PHRの会合を誘発するには、2マイクロワットの総電力で十分です。タイムスタンプ取得を 5 秒間隔で設定します。

そして、合計取得時間は2分です。目標ウィンドウに適切なインデックスマッチング資料を適用します。細胞チャンバーを顕微鏡ステージに置き、明視野モードを使用して、アイピースを使用してカバーガラス表面の細胞に焦点を合わせます。

次に、顕微鏡ステージを動かして、緑色の光の下でトランスフェクションされた細胞を見つけます。FITCチャネルとCITCチャネルの両方で一連のタイムスタンプ付き画像を記録します。基本的なサンプル画像は、原形質膜に局在したCIBNGPCAXを示しています。

これは、ブルーライトシミュレーション前のCRY2 mCherry raf1のスナップショットですが、この画像は、10パルスのブルーライト刺激後のCRY2 mCherry rafのスナップショットを示しています。2つのブレッドボードに同調の青色LEDを挿入し、電流制限抵抗で接続して、LEDアレイを作成します。ブレッドボードをアルミ製の箱に入れます。

2本の金属線を挿入して、ボードを電源に接続します。ライトボックスを二酸化炭素インキュベーター内に置くときは、ワイヤーの長さが十分であることを確認してください。次に、透明なライトディフューザーを配置して、ライトボックスのカバーとして機能します。

最後に、電圧入力の範囲で各LEDの電力出力を較正します。24時間のPC12細胞分化アッセイには、ゼロポイント2ミリワット/平方センチメートルの電力を使用します。LEDアレイを、5%の二酸化炭素を補給した摂氏37度のインキュベーターに置きます。

金属線を使用して電源に接続し、LEDの電力を1平方センチメートルあたり2ミリワットのゼロポイントに設定します。トランスフェクションされたPC12細胞を含む12ウェルプレートをLEDアレイのウィンドウに置きます。すべてのウェルが完全に照らされるようにプレートを位置合わせします。

24時間連続して光を当てます。分化した細胞をイメージングするには、シングルスナップショットデータ取得を設定します。GFP チャネルと TexasRed チャネルの両方に 200 ミリ秒を使用します。

GFPチャネルとTexasRedチャネルの両方でトランスフェクションされた細胞の画像を取得し、データ解析のためにファイルを保存します。この手順は、キャピラリープーラーでガラスキャピラリーを引っ張ることにより、RNAマイクロインジェクション用の針を作製することから始めます。胚からゼリーコートを取り出し、0.2 XMMRで希釈した3%システインで15分間処理します。

胚を3%ポリスクロースおよびマイクロインジェクション用のゼロポイント5 XMMR溶液に移します。1ナノグラムのCRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNAに500ピコグラムを正確に各胚に注入します。次に、マイクロインジェクションした胚を室温のマイクロインジェクション溶液で培養します。

胚が中原腸期に到達したら、0.2倍MMR溶液に移し、所望の発生段階まで培養を続けます。次に、12ウェルプレートを自作のLEDアレイに置き、青色光処理を行います。12ウェルプレートの上に鏡を置き、胚の完全なブルーライト照明を確保します。

組織学的、ウェスタンブロット、または遺伝子発現解析のために、青色光に所望の時間曝露した後、胚を採取します。この画像は、ゼロ点2ミリワット/平方センチメートルで24時間の青色光刺激の後にCRY2-2A-2CIBNにトランスフェクションされたPC12細胞のマルチチャンネルスナップショットを示しています。GFPとmCherryの記者の両方が見られます。

円は分化したセルを示し、四角は未分化のセルを示します。ここでは、細胞は前の画像と同じように処理されましたが、青色光刺激は使用されていません。区別は見られません。

これらの細胞は、恒常的に活性なraf1であるraf1 GFPCaaXによるトランスフェクション後に代表的な結果を示します。円と長方形は、それぞれ分化したセルと未分化のセルを示します。このヒストグラムは、CA-Raf1をトランスフェクトしたPC12細胞、CRY2 mCherry raf1およびCIBN GFP Caaxを同時トランスフェクトした細胞、およびCRY2A 2CIBNを単独でトランスフェクトしたPC12細胞の分化率を示しています。

青色光に曝露された細胞のみが有意な分化を示しました。この画像は、MRNA注射なし、および光治療なしの正常なXenopus胚の形態を示しています。この画像は、CRY2 2A2CIBN mRNAを注入し、青色光刺激を受けた胚を示しています。

CRY2 2A2CIBN注入胚を青色光で処理することによるraf1の活性化は、頭部領域に異所性の尾状構造を誘導する。この手順に従うと、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路のステージ特異的な活性化が遺伝子発現をどのように制御するかなど、追加の質問に答えることができます。この光遺伝学的手法は、同様の活性化メカニズムを持つ他のシグナル伝達経路を制御するために一般化することができます。