Name: 炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学ぶ血管内皮細胞における新規レギュレーターのスクリーニングアッセイ。炎症反応における白血球遊走の調節メカニズムを解明し、炎症性疾患に対する新規治療戦略の開発に貢献する。MLEC-04細胞を用いた実験的手法を解説。

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この仕事に支えられた Ministerio デ Economía y Competitividad (MINECO)、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス III (ISCIII) (許可番号 IERPY 1149/16 アダムローリー; にMPY 1410/09 s. Hortelano に);で、フォンド ・ デ ・危惧サラッド (FIS) (S. Hortelano に番号 PI11.0036 および PI14.0055 を付与) を介して MINECO。S. エランス ・ ISCIII から IERPY 1149/16 に対応しました。

1 です血管内皮細胞培養 37 ° C で 30 分間 <ol><li><ol><li>2.5 mL ゼラチンでコート 100 mm 組織培養プレートを 培養処理板 のソリューション (蒸留水のオートクレーブ、ゼラチン 0.1%); これ。必要な井戸のフォーマットに推測することができます。ゼラチン溶液を吸引し、ティッシュ文化フードで風乾するプレートのままにします</li>。
	</ol></li> <li>組織培養条件 <ol><li>(37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 生物インキュベータ内 MLEC 04 細胞を養います。ダルベッコの完全なメディアのセルを育てる &#39; s 修正イーグル培地: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12) 10% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 100 単位/ml ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL (P/S) と補完</li>。
		<li>標準ノイバウアー チャンバー法によるセルをカウントし、MLEC 04 セルを 10 mL の完全なメディア、2-11 × 10 4 セル/cm 2 の低密度で 100 mm のゼラチン処理版に追加します。合流点に達すると 1:3 のセルを分割します 。
		注: 通常これは文化で 2 〜 3 日後に発生します</li>。
		<li>サブカルチャー 10 ml 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mL のトリプシン-EDTA 溶液 (0.25% トリプシン、5 ミリメートルの EDTA) を追加することによって続いて、37 で 3 分間インキュベート プレートを洗浄することによりセル ° C</li>
		<li>は、トリプシン-EDTA 反応を停止し、10 mL の完全なメディアを追加することによって浮遊細胞を回復します。スピン ・ ダウン (300 × g、5 分) 細胞、上澄みを廃棄、適切に完全なメディアとサブカルチャーの細胞のペレットを再懸濁します</li>。
	</ol></li></ol> 2。LPS 処理とメディエーター <ol><li>プレートの次の井戸のフォーマットにサブの合流点での完全なメディアの MLEC 04 細胞: 細胞/ウェル 6 ウェル プレートで 2.5 10 5 細胞/ウェルの 96 ウェル プレート x 7 x 10 5</li>。
	<li>では、6 h (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) セルのインキュベーターでの培養を孵化させなさい。不完全なメディア (DMEM f12 キー、P/S) にセルを切り替え、同期して細胞の活動を抑える (上) 一晩を残しています</li>。
	<li>メディアを取り出し、培養内皮細胞 (またはしない) 新規の薬理学的化合物をテスト薬物問題の (例えば DT 10) 不完全なメディア (30 分、37 ° C) で希釈した; 1.4 mL を追加/6 ウェル プレートまたは 0.14 のよくmL/ウェルの 96 ウェル プレート).</li>
	<li>分析では各指定期間インキュベーション メディア (100 ng/mL、最終濃度) に組合を追加してセルに挑戦します。コントロールとして PBS を使用します</li>。
</ol> 3。RT qPCR による活性化血管内皮細胞の転写プロファイルの評価 <ol><li>6 も培養でサブの合流でシード MLEC 04 セル板 (7 x 10 5 細胞/ウェル)。(37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 6 時間インキュベートし、その後血清飢餓に進みます (の孵化).</li>
	<li>メディアを取り出し、興味の薬剤と文化 (37 ° C、30 分インキュベート) 不完全なメディアで希釈した; 1.4 mL を追加/6 ウェル プレート (30 分、37 ° C) にも血管内皮細胞を治療 (または治療しない).</li>
	<li>(2.3 の手順で説明) の培養メディアを 100 ng/mL LPS を追加することによって、細胞に挑戦し、孵化 6 h 冷 PBS で 2 回洗浄することにより反応を停止するため、サンプル処理まで-80 ° C でプレートを維持します</li>。
	<li>RNA の抽出 <ol><li>プレートを解凍し、1 mL/ウェル RNA 抽出バッファー (38% フェノールと 0.8 M ためイソチオ シアン酸; 材料の表を参照) を追加します。1.5 mL チューブ内の攪拌と収集ホモジネートの下で室温 (RT) で 30 分残す</li>。
		<li>200 μ L のクロロホルムを追加し、RT と遠心分離機 (11,600 × g、15 分間、4 ° C) で 3 分間 15 s. 加温のため軽く揺り動かす</li>。
		<li>は、別 1.5 mL チューブに液相を転送します。RT し遠心分離 (11,600 x g、4 ° C) で、10 分で 500 μ L のイソプロパノールを追加することによって RNA を沈殿します</li>。
		<li>上澄みを廃棄し、渦攪拌と (7,500 × g, 4 ° C)、遠心分離による 75% のエタノールの餌を洗浄します</li>。
		<li>ペレットを風乾、サンプル処理まで-80 ° c 55 ° C 続ける RNA で 10 分間インキュベートし、25 μ L 純粋な H 2 O の RNA を可溶化します</li>。
	</ol></li> <li>量と RNA の純度 <ol><li>260 でサンプルの吸光度を測定することにより RNA 濃度を定量化する nm の分光光度計 (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>メジャー 230 nm と 280 nm の RNA の純度を決定する 。
		注: 260/280 の比率はタンパク質またはフェノールの汚染を示します。2 に近い比率は許容されます。260/230 では、EDTA、炭水化物またはフェノールの汚染物質を示します。2.0 2.2 までの値が許容します</li>。
	</ol></li> <li>RNA のチェックの整合性 <ol><li>総 RNA、RNA の実行 2 μ g agarose のゲルを変性剤濃度 1.5% のはしご; ゲルのドキュメンテーション システムの可視化 (材料の表 を参照してください). 
		注: 鮮明 28 s、18 s rRNA バンドの 2:1 の比率はそのまま RNA を示します。部分的にまみれて外観として RNA 解決を低下します</li>。
	</ol></li> <li>RT qPCR <ol><li>標準に従って一本鎖 RNA から相補的 DNA (cDNA) を合成プロトコル (参照 材料表) 11.</li>
	</ol></li> <li>RT qPCR による評価遺伝子発現 <ol><li>各サンプルの反応混合物の準備: ミックス 2 μ L cDNA、7 μ L 蛍光化合物、300 nM 前方プライマー、300 nM 逆プライマー (表 1) で、13 μ L の最終巻、96 ウェル リアクション プレートに追加 (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>光学接着カバー、遠心分離機 (300 × g, 1 分) でプレートをシールし、リアルタイム PCR システムの反応を実行 (ホット スタート 95 ° C、20 s に続いて 40 サイクル: 95 ° C 3 s の 60 ° C、30 s) (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>は、比較メソッド 2 を使用して相対定量による結果を分析 -ΔΔCt ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH) または酸性リボソーム リン蛋白質 P0 (36B4) 12.</li>
	</ol></li></ol> 4。フローサイトメトリーによる内皮細胞の活性化を評価する <ol><li>以下のセクション 2 で説明されている条件 MLEC 04 細胞を治療し、フローサイトメトリーによる内皮細胞表面タンパク質の変化を評価します</li>。
	<li>デタッチ 6 h に記載されているトリプシン-EDTA による LPS 刺激後の細胞ステップ 1.2.3, と 4 で不完全なメディアで洗って ° C</li>
	<li>は、ノイバウアー チャンバー法を用いたセルをカウントし、u 下 96-ウェル プレートに 10 x 10 の 4 セルを配置します。遠心分離機 (300 × g、5 分) と 180 ° によって上澄み破棄下の元の位置を素早く回復に上から手首のスナップします</li>。
	<li>セルに不完全なメディア (10 μ G/ml、最終濃度) で希釈した選択した抗体の 50 μ L を追加し、(30 分、4 ° C) をインキュベートします</li>。
	<li>洗浄 2 回 w不完全なメディアに記載されている手順に従うステップ 4.3, と対応する二次抗体の 10 μ G/ml で 50 μ L で孵化させなさい ith FITC または類似した共役 (30 分、暗い空間で 4 ° C) に結合します</li>。
	<li>は、PBS 洗浄続いて不完全メディアで一度セルを洗ってください。1 mL ピペット チップを使用して 300 μ L の PBS のセルを回復し、フローサイトメトリー管を配置します</li>。
	<li>流れの cytometry 中のサンプルの評価 (材料の表 を参照してください)。前方および側散乱パラメーターによってセル人口を調整します。ゲート興味の人口。アイソタイプ コントロールと培養細胞から負の制御に基づくゲートを調整します。陽性細胞の割合として結果を分析または蛍光強度 8 を意味します</li>。
</ol> 5。西部のしみのによる内皮細胞の活性化を評価 <ol><li>6 ウェル培養皿 (7 x 10 5 細胞/ウェル) サブ合流で内皮細胞を播く、セクション 2 の説明に従って、LPS と扱います。次の西部のしみのプロトコルによって炎症性蛋白質の表現を分析します</li>。
	<li>内皮細胞応答のさまざまな側面を明らかにする異なる時点で lps を停止: <ol><li>LPS 刺激の 6 h 後炎症性蛋白質のプロファイルを確認します</li>。
		<li>セルシグナ リング 60 分の期間で 15 分毎を決定します</li>。
	</ol></li> <li>両方のケースで冷 PBS で 2 回洗浄することにより、反応を停止し、サンプル処理まで-80 ° c のサンプルを保存します</li>。
	各ウェル (1% 非イオン性界面活性剤、トリス-HCl、10 mM 1 mM EDTA、塩化ナトリウム 150 mM、30 mM ピロりん酸ナトリウム、フッ化ナトリウム 50 mM、2.1 mM ナトリウム バナジンで <li>Lyse 細胞や蛋白質の抽出 <ol><li>追加 200 μ L の換散バッファーpH 7.6, プロテアーゼ抑制剤のカクテルを補充) (資料の表を参照).</li>
		<li>動揺、4 ° C で 15 分ピペット チップと井戸をこすり、1.5 mL チューブの磨砕液を収集をインキュベートします</li>。
		<li>4 の 11,600 x g でチューブを遠心分離機 ° C</li>
		<li>処理まで-80 ° C できれいな 1.5 mL チューブに上清を保存します</li>。
	</ol></li> <li>標準に従ってビシンコニン酸法による蛋白質の集中のプロトコル (材料の表参照) のメジャー 13.</li>
	<li>は、10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 14 ドデシル硫酸ナトリウム 0.1% の標準法による総蛋白ライセート サンプルごとに 30 μ g を解決します。10 mM β-メルカプトエタノール (還元条件) 付きまたはなしサンプルを実行 (非還元条件) 興味の蛋白質を検出するために使用する抗体によって異なります</li>。
	<li>標準的な手順を使用して 0.45 μ m 孔径 (PVDF) 転送ブロッティングにポリアクリルアミドゲルから分けられた蛋白質を転送します</li>。
	<li>移転後、0.1% ポリソルベート 20 (PBS-T)、PBS で 2 回膜を洗浄し、PBS-T 検出されたリン蛋白質または撹拌 (90 分、下の総蛋白質のため PBS t 5% 脱脂乾燥したミルクの希釈 20 mL 2 %bsa を追加することで非特異的結合部位をブロックRT).</li>
	<li>10 mL の推奨濃度で適切なブロック バッファーで選択した抗体を希釈し、撹拌 (ON, 4 ° C) の下で膜を孵化させなさい。また、密封されたポリ袋の膜を配置し、5 mL の希釈を使用します</li>。
	<li>次の日、(余分な PBS ユニット-T、15 分、RT) 回 3 つの膜を洗浄する.</li>
	<li>1: 10,000 適切なブロック バッファー内で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 行きの特派員の二次抗体の 10 ml (30 min, RT) 攪拌下膜加温します</li>。
	<li>3 回攪拌 (余分な PBS ユニット-T、15 分、RT) の下で膜の洗浄です</li>。
	<li>ペルオキシダーゼ基質強化化学発光 (ECL) の 0.1 mL/cm 2 で 1 分の膜を孵化させなさい。2 つの透明なプラスチック シートの間に排水膜を置き、Charged-Coupled デバイスのカメラ (CCD) を含む化学発光検出装置にそれを挿入します。
	<ol><li>CCD カメラを使用して、信号と累積プログラムで画像を記録するソフトウェアを検出 (画像は、合計 15 分間、すべての 30 秒露出で蓄積された信号を表示) します</li>。
	</ol></li> <li>デンシトメトリーによるユーザー ガイド 15 に記載されているプロトコルに従う ImageJ ソフトウェアを使用してバンド強度を定量化します。
	<ol><li>ImageJ ソフトウェアでサンプルを開き、長方形選択ツールで興味のバンドを選択します</li>。
		<li>最初のレーンとプレス プロットの輪郭のプロットを取得するレーンを選択します</li>。
		<li>直線の選択のピークの領域を区切るです</li>。
		<li>各ピークの内側をクリックして各バンドのサイズを測定します</li>。
		<li>制御タンパク質 (β-アクチン、チューブリン、等) の読み込みに関する結果を表します</li>。
	</ol></li></ol> 6。内皮因子は、付着の試金による白血球活性化からの解放を評価 <ol><li>内皮付きメディアを入手します。
	<ol><li>2 のセクションで示されているように、MLEC 04 細胞を扱うし、後 24 h LPS 刺激培養上清を収集 (100 ng/mL).</li>
		<li>は、扱われた MLEC 04 セルおよび遠心分離機 (600 x g) からエアコンのメディアを収集します。使用するまで-80 ° C で 0.5 ml の上澄みを維持します</li>。
	</ol></li> <li>白血球粘着試験 <ol><li>コート (0.1 M 酢酸の希釈はコラーゲン) を除いて PBS で希釈した選択した細胞外マトリックス蛋白質の 50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート: フィブロネクチン (1 ~ 10 μ g/mL)、ラミニン (1 〜 10 μ g/mL) とコラーゲン タイプ I (10-40 μ g/mL)。4 ° C でのままに</li>
		<li>コーティングされたメディアを破棄し 150 μ L の PBS、1 %bsa 熱不活化 (1 分、100 ° C)、90 分の室温で井戸の非特異的結合サイトをブロック</li>
		<li>PBS で 2 回洗浄し、井戸に 100 μ L の以前に収集された内皮付きメディア (セクション 6.1 を参照) を追加します 。
		注: プレート接着アッセイを実行する準備ができている</li>。
		<li>文化 (37 ° C、湿度 95%、5% CO 2) 生物のインキュベーターでマウスの単球マクロファージ細胞株 J774 とロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI)、10% 1% FBS P/s. 
		注: J774 細胞懸濁液に成長していく</li>。
		<li>は、15 mL の管および遠心分離機 (300 × g、5 分) に J774 細胞を収集します。上澄みを廃棄し、10 mL の血清無料メディアで細胞のペレットを再懸濁します。ノイバウアー区域のセルをカウントします。(300 × g、5 分) 細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、50 μ L メディアあたり 15 × 10 4 J774 細胞血清自由な媒体の細胞を再懸濁します</li>。
		<li>追加 15 × 10 4 J774 セルそれぞれに 50 μ L の血清無料メディアでよく、CO 2 セル インキュベーターで 37 ° C で 1 時間後 4 ° C で 15 分間インキュベートします</li>。
		<li>は、暖かい PBS を追加することによって井戸を 2 回、軽く洗う; (300 x g、5 分) を遠心し、下の元の位置を素早く回復にトップから手首のスナップを 180 ° で上澄みを廃棄します。接続されたセルを修正します。PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 100 μ L/ウェルを追加することによって s (10 min, RT) を孵化と</li>。
		<li>優しくメディアを破棄、優しくした破棄メディアで 2 分間 PBS で 2% メタノールでセルを permeabilize し、90 の 20% メタノールで 0.5% クリスタル バイオレットの 50 μ L/ウェルを追加することによって、細胞を染色した s</li>
		<li>は豊富な実行している水を洗浄、余分な液体を破棄し、空気乾燥させておきます。デジタル カメラの光学顕微鏡に結合によって接続されたセルを報告します</li>。
		<li>では、0.1 M クエン酸ナトリウム、50% エタノールの 100 μ L/ウェルを追加することによって染色細胞を薄くしなさい。545 nm で吸光度または細胞接着として 100% を考慮した付着率の任意の単位として結果に井戸に到達を表す吸光度コーティング リガンド濃度の増加とともにメジャー</li></ol></li></ol> 7。白血球内皮共同接着アッセイによる内皮活性化をテスト <ol><li>セクション 2 の説明に従って、96 ウェルプレート上 MLEC 04 セルを扱うし、組合 (6 h、37 ° C) incubate</li>。
	<li>J774 細胞と Carboxyfluorescein 染色エステル (CSFE) の蛍光ラベルします。
	<ol><li>洗浄、J774 6.2.5 の手順に従って PBS のセルします。カウント、ノイバウアーによるセルの部屋の方法と 1 × 10 6 セル/mL の pbs は、0.1 %bsa で再懸濁します</li>。
		<li>37 ° c. を追加 5 mL 不完全メディアで 20 分 CFSE (5 μ M、最終濃度) で細胞をインキュベートし、(5 分、4 ° C) をインキュベートします</li>。
		<li>6.2.5 で説明したように、不完全なメディアで 1 回洗浄. 15 × 10 4 セル/100 μ L で再懸濁します、共同接着アッセイに進みます</li>。
	</ol></li> <li>内皮治療後不完全なメディアで 3 回洗浄します。内皮コートもそれぞれに CFSE J774 細胞 (15 × 10 4 セル/100 μ L) を追加します。37 で 60 分間続く 4 ° C で 10 分間プレートをインキュベート ° C</li>
	<li>6.2.7 で説明するよう、優しく洗浄します、温めた PBS を使用する、次の 2 つの方法によって内皮層に J774 接着のレポート: <ol><li>溶解 0.1 M トリス-HCl pH 8.8, 1% SDS のセル (100 μ l/ウェル) 測定と、。蛍光分析による CFSE J774 信号 (励起/蛍光 = 492 nm/517 nm)。蛍光強度の任意の単位または肯定的な制御に関して付着の割合として結果を表す (追加合計のセルから信号を各ウェル).</li>
		<li>蛍光顕微鏡下で可視化によって 4 %pfa とレポートのセル CFSE J774 細胞の内皮細胞への愛着を修正 (励起/蛍光 = 492 nm/517 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

この内皮細胞のプロトコルでは、炎症反応の調節に関与する探索機構のための基礎を確立する段階的な技術について説明します。これらのアプローチ LPS 刺激血管内皮の活動の研究に基づいており、具体的には炎症性応答の間に白血球動員に関与する重要なステップの評価: 内皮細胞のサイトカインのリリースでは、内皮細胞の接着血管層に分子式と白血球接着。内皮のパラメーターを確立すると、システムの内皮機能の調節に関与する新規な化合物が検索でき、その結果、炎症の進行。それらの規制薬物は医薬品市場に関心の可能性のあるできます。このシーケンシャル プロトコルの主要な投影は、相対血管活動パラメーターを調整することにより内皮細胞の種類と刺激条件にこれらの研究を拡張するための基盤を確立することです。
このスクリーニングによって選択された薬は炎症性疾患に対する新規治療戦略の設計の興味深い候補を構成します。一方、内皮細胞の応答を支持し白血球動員に貢献化合物は免疫不全の条件16,17のために有望になります。...

炎症が感染性病原体、病原体を排除し、損傷した組織を修復する主要な目的に対して有益な生物学的反応です。炎症は慢性感染症や自己免疫疾患など、特定の条件下では解決しません。代わりに、連続浸潤白血球、組織の損傷、線維化、損失関数、および全体的な障害者と患者のいくつかの例の死につながる長期免疫応答の結果の異常な反応があります。これらの人間の疾患、炎症性疾患としてカタログ化すべては白血球の血管外漏出1,2の制御のための血管を含みます。
血管内皮細胞は、白血球が人身売買を制御することによって炎症反応の調節に基本的な役割を果たします。安静時の内皮をアクティブにし、炎症性サイトカイン(Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1 等)と接着分子 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 表現内皮層が LPS など炎症性メディエーターにさらされて、その好意感染部位に白血球の循環の募集。リリースされたサイトカインによってプライミング白血球ローリングと特派員の接着対応による内皮層との相互作用を仲介する: セレクチン VCAM 1 α4β1 インテグリン、icam-1 へ αLβ2 インテグリン PSGL 1。最後に、白血球は炎症3の焦点に向かって血管間で移行します。
炎症性応答の調節における血管内皮細胞の重要な役割は、LPS 受容体、toll 様受容体 4 (TLR4) 内皮細胞でのみ表現する遺伝的に変更されたマウスで実証されています。これら内皮 TLR4 の動物が lps の炎症と菌接種後に生成される感染症を検出する対応し、その結果感染解像度と野生型マウス4と同等のレベルで生存を達成することができます。,5。
炎症性応答の内皮規制経路のためと仮定されている白血球の血管内皮細胞の相互作用のいくつかの段階で抑制が内皮の移行とのより良い予後の削減になること炎症関連疾患。実際には、炎症性疾患6、7のための治療として免疫細胞の血管外漏出を妨げるため内皮細胞活性化と白血球の血管内皮細胞の相互作用を対象とするいくつかの戦略を設計されています。
本報告では、炎症性刺激の lps 応答の内皮の活動と白血球の活性化と血管の層への接着におけるその役割を完全に特徴づける培養技術の徹底したグループを表します。Hortelano et al.による記述で、この原稿で使用される内皮細胞モデルはマウス肺血管内皮細胞ライン (MLEC-04)8.、MLEC 04 セルラインは内皮活性化9,10を勉強する適切なシステムであるため文献で検証されています。研究に基づいて、これらのアプローチが容易に推定する、血管内皮に白血球のシステムや炎症性プロファイル。選択した条件で血管内皮のパラメーターを定義した後、システムは血管の活性化を評価する提案の実験に新薬をテストできます。炎症性の中で、セルの条件を制御する目的の化合物をテストする内皮細胞を比較できます、任意の結果の違いは薬の開発と炎症の進行に予後の結果を通知可能性があります。最後に、血管内皮細胞炎症関連疾患に対する新規血管特定薬剤の設計に影響を与える新しい創薬ターゲットの特性に関連するシステムを提案する.

<table><tbody><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>ロンザ</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>シグマ</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ロンザ</td><td>BE17-160E</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>シグマ</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>RNA抽出バッファー</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマ</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアブsoluto</td><td>Panreac</td><td>1,310,861,612</td><td></td></tr><tr><td>Pure H2O</td><td>Qiagen</td><td>1017979</td><td>RNAseフリー</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>プロナディサ</td><td>8020</td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル用染色</td><td>Invitrogen</td><td>s33102</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synth</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>試薬 RT-PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385610</td><td>蛍光染色</td></tr>剤 <tr><td>MicroAmp Fast Optical 96ウェル</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906 10</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>U-bottom 96ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>サイトメトリーチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>TX100</td><td>パンレアック</td><td>212314</td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>トリスHCl</td><td>パンレアック</td><td>1,319,401,211</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>1,064,041,000</td><td></td></tr><tr><td>ピロリン酸ナトリウム</td> シ<td>グマ</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>ビシンコニン酸アッセイ用試薬</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>メルク</td><td>805,740</td><td></td></tr><tr><td>PVDF トランスファー メンブレン、0.45 &micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Panreac</td><td>1,623,121,611</td><td>ポリソルベート 20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>ミリポア</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td></td><td>Sigma F1141</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I 型</td><td>Σ</td><td>c8919</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Panreac</td><td>1,310,081,611</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td></td><td>Σ P6148</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Panreac</td><td>1,310,911,612</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td></td><td>Sigma HT90132</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>C7254</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%</td><td>Panreac</td><td>1,410,851,212</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-115F</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>M200</td><td>マルチモードマイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad</td><td>2000</td><td>ゲルドキュメンテーションシステム</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems</td><td>StepOnePlus</td><td>qPCR system</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Analyzer 10</td><td>サイトメトリー装置</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Bio-Rad</td><td>MP</td><td>化学発光検出システム</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>10 & microで使用;g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-2</td><td>Biolegend</td><td>1054602</td><td>10 μ で使用。g/mL</td></tr><tr><td>E-セレクチン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>553749</td><td>10 μmで使用。g/mL</td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>BD Biosciences</td><td>553330</td><td>10 & micro で使用。g/mL</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>553250</td><td>10 & micro で使用;g/mL</td></tr><tr><td>抗ラット IgG-FITC Jackson</td><td>Immuno Research</td><td>112-095-006</td><td>10 & micro;g / mL</td></tr><tr><td>抗アルメニアハムスター-FITC</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>127-095-160</td><td>10 & microで使用;g/mL</td></tr><tr><td>ラット IgG アイソチオペコントロール</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td>10 & micro;g/mL</td></tr><tr><td>アルメニアハムスター IgG アイソタイプコントロール</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-33220</td><td>10 & micro;g / mL</td></tr><tr><td>P-I&κ;&ベータ;-&アルファ;</td><td>Cell Signaling</td><td>2859</td><td>10 & micro で使用。g/mL</td></tr><tr><td>&beta;-Actin</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td>10 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>P-ERK</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9101</td><td>10 μ;g/mL</td></tr><tr><td>抗マウス HRP</td><td>GE ヘルスケア</td><td>LNXA931/AE</td><td>1:10,000 で使用</td></tr><tr><td>抗ウサギ</td><td>HRP GE ヘルスケア</td><td>LNA934V/AG</td><td>1:10,000 で使用</td></tr><tr><td>抗ラット HRP</td><td>サンタクルーズ</td><td>Sc-3823</td><td>1:10,000 で使用</td></tr></tbody></table>

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

内皮層は、多くの異なる機能を制御することによって体内の恒常性を維持するために不可欠です。内皮層による炎症反応の調節は、効率的に有害な入力との戦いや、被災地の回復の援助に不可欠です。Ccl5、Cxcl1、Cxcl10 など水溶性の炎症性サイトカインを表現してトリガー内皮細胞がリポ多糖 (LPS)、グラム陰性の細菌膜の外側のコンポーネントなど、炎症性の環境にさらされる、循環白血球の活性化。さらに、内皮細胞表面に接着分子 E セレクチン、VCAM 1 と icam-1 の発現は相互作用および内皮層と最終的に炎症を起こしている組織へ漏出する活性化白血球接着できます。このシナリオで、過剰なまたは欠陥のある活性化白血球動員は炎症関連疾患につながる可能性がため血管内皮機能はしっかりと調整されなければなりません。これらの疾患の多くは効果的な治療法はありません、ので血管の層を中心に新しい戦略を調べる必要があります。白血球機能を変更新規の内皮レギュレータの検索に有用な包括的な試金を提案します。含むいくつかのテクニック (など、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子) 白血球動員に関与する特定の表現ターゲットを用いた内皮活性化分析: リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT-qPCR)、西部のしみ方、フローサイトメトリーおよび接着アッセイの流れ。これらのアプローチは、炎症における血管内皮機能を決定して新しい治療戦略の設計の潜在的価値のある小説の内皮炎症性の規制当局を特徴付けるためのスクリーニングアッセイを実行する非常に便利です。

RT qPCR による内皮細胞の LPS 誘導性活性化の評価
飢えた血清 MLEC 04 細胞が 100 ng/mL LPS の 6 時間によって刺激され、内皮細胞の遺伝子発現は、休憩状態に活性化マーカーの発現を比較することによって RT qPCR を使用して査定されました。図 1 aのように、LP 培養 MLEC 04 細胞は炎症性応答 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 中に白血球動員に関与する選択した接着分子の発現を誘導しました。この実験的な治療下式は変更されていないので、PECAM 1 は内部統制として使用されました。図 1 bは、Ccl5、Cxcl10、および Cxcl1 サイトカインの mRNA 発現の増加によって測定される組合による内皮活性化を表します。これらの分子は、白血球、内皮層と炎症のサイトに後で漏出に、...

血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

このスクリーニングアッセイの全体的な目標は、炎症性疾患に対する新しい治療戦略を設計するために、関心のある炎症反応に関与する新規の内皮調節因子を特徴付けることです。この方法は、炎症関連疾患を軽減できる新しい内皮標的薬の定義など、病理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この内皮プロトコルの主な利点は、炎症反応の調節に関与する新しいメカニズムを探索するための基礎を確立するアッセイ技術を説明することです。この方法論を実証するのは、私たちの研究室のポスドクであるMaria Angeles Higuerasと、私たちの研究室の技術者であるSandra Herranzです。まず、MLEC-04細胞を10%FBSとPen-Strepを添加した完全なDMEM F12培地で細胞を培養します。細胞を生物学的インキュベーターで37でインキュベートします

screening-assays-to-characterize-novel-endothelial-regulators

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。...

オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

ここでは、免疫調節活性物質の同定を目指した新規な高含有化学的に誘発される炎症アッセイを説明します。我々は正常、炎症反応だけでなく、さらに、データ処理、解析、マイニング、およびストレージの自動定量化を可能にするカスタム開発したソフトウェアのスクリプトで自動化された顕微鏡を組み合わせています。...

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載...

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

管形成アッセイは、 インビトロ血管新生を測定するための高速、定量可能な方法である。内皮細胞は、馴化培地と混合し、基底膜抽出物でメッキされる。管形成は容易に定量時間と新たに形成された細管内で発生する。...

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

人間の血管血液相互作用を調査するための信頼性のあるモデルへのアクセス性が欠けています。私たちは、血液中(ELISA)と血管コンパートメント内(顕微鏡)の両方の細胞相互作用を調査するために、培養された初代ヒト内皮細胞とヒト全血を組み合わせたin...

小説インビトロヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル

我々は、検出し定量化およびリガンドの血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーの活性を監視するための単純な細胞ベースのバイオアッセイを説明します。アッセイは、リガンドによる受容体結合および架橋の半定量的または定量的評価を提供するために、因子依存性細胞株において発現されたキメラ受容体を使用します。...

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

この原稿は、制御された環境で内皮細胞のチューブ形成を使用して、特定の化合物または状態が血管新生に及ぼす影響を定量化するチューブ形成アッセイについて説明しています。...

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。...

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in...

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

このステップ バイ ステップのプロトコルによる ECs...

ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

学ぶ血管内皮細胞における新規レギュレーターのスクリーニングアッセイ。炎症反応における白血球遊走の調節メカニズムを解明し、炎症性疾患に対する新規治療戦略の開発に貢献する。MLEC-04細胞を用いた実験的手法を解説。

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

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