Name: 前庭シュワン細胞腫研究のための統一方法論的枠組み (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ前庭シュワン細胞腫研究のための一次細胞培養と腫瘍分泌物収集の標準化手法。最小侵襲的な培養法により細胞生存性を保持し、治療薬候補の直接評価を可能にする統一方法論を確立する。

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この作業は、国立難聴者協会のR01DC015824（KMS）およびT32DC00038（JESおよびSDをサポート）、国防総省のグラントW81XWH-14-1-0091（KMS）、Bertarelli財団（KMS） 、ナンシーセイレスデー財団（KMS）、ラウアー耳鳴り研究センター（KMS）、およびバーンズ財団（KMS）が含まれます。

<ol><li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+schwannomas+in+the+modern+era%3A+epidemiology%2C+treatment+trends%2C+and+disparities+in+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management.</a> J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).</li>
<li>Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+epidemiology+and+management+trends+in+acoustic+neuroma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).</li>
<li>Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descriptive+epidemiology+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas.</a> Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((True+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">True incidence of vestibular schwannoma?</a> Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).</li>
<li>Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+real+incidence+of+vestibular+schwannoma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">What is the real incidence of vestibular schwannoma?</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).</li>
<li>Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+natural+history+of+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas.</a> Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).</li>
<li>Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+patterns+of+care+of+brain+tumor+patients+in+the+United+States%3A+a+study+of+the+Brain+Tumor+Section+of+the+AANS+and+the+CNS+and+the+Commission+on+Cancer+of+the+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS.</a> Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).</li>
<li>Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+sporadic+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Management of sporadic vestibular schwannoma.</a> Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+vestibular+schwannomas+associated+with+good+hearing+secrete+higher+levels+of+fibroblast+growth+factor+2+than+those+associated+with+poor+hearing+irrespective+of+tumor+size%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+VEGF+receptor-1+concentration+in+vestibular+schwannoma+homogenates+correlates+to+tumor+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate.</a> Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).</li>
<li>Koutsimpelas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VEGF%2FVEGF-R+axis+in+sporadic+vestibular+schwannomas+correlates+with+irradiation+and+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22ORL+J+Otorhinolaryngol+Relat+Spec%22%5BJournal%5D)">The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence.</a> ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).</li>
<li>Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+VEGF-A+and+cMET+signaling+in+human+vestibular+schwannomas+and+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells.</a> Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+medications+are+cytostatic+against+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas.</a> Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+validation+of+anti-nuclear+factor-kappa+B+therapy+to+inhibit+human+vestibular+schwannoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth.</a> Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Blakeley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+drug+treatments+for+neurofibromatosis+type+2-associated+vestibular+schwannoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).</li>
<li>Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF2%2Fmerlin+in+hereditary+neurofibromatosis+2+versus+cancer%3A+biologic+mechanisms+and+clinical+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations.</a> Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).</li>
<li>Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human vestibular schwannomas.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Dilwali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+Schwann+and+schwannoma+cells%3A+improved+and+simplified+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol.</a> Hear Res. , 25-33 (2014).</li>
<li>Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+expression+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).</li>
<li>Cioffi, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+overexpression+contributes+to+vestibular+schwannoma+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival.</a> Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).</li>
<li>Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB+and+Nrg%3A+potential+molecular+targets+for+vestibular+schwannoma+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy.</a> Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).</li>
<li>Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+between+the+growth+fraction+of+bilateral+vestibular+schwannomas+in+neurofibromatosis+2+%28NF2%29+and+unilateral+vestibular+schwannomas+using+the+monoclonal+antibody+MIB+1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1.</a> Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).</li>
<li>Cattoretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+recombinant+parts+of+the+Ki-67+antigen+%28MIB+1+and+MIB+3%29+detect+proliferating+cells+in+microwave-processed+formalin-fixed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections.</a> J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).</li>
<li>Hung, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+study+of+human+vestibular+nerve+schwannoma+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation.</a> Glia. 38 (4), 363-370 (2002).</li>
<li>Archibald, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+expression+in+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 expression in vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforaphane%2C+a+natural+component+of+broccoli%2C+inhibits+vestibular+schwannoma+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 36215(2016).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).</li>
<li>Lysaght, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+human+perilymph%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome of human perilymph.</a> J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).</li>
<li>Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+genes+in+sporadic+vestibular+schwannomas%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas.</a> Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+nerve+microenvironment+for+schwannoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The importance of nerve microenvironment for schwannoma development.</a> Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).</li>
<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

この原稿は、VS研究のための統一された方法論的枠組みを記述し、下流の研究の応用のためにヒトVSとGAN標本の同時処理を概説している。 VS研究が精密医学の時代に入っても、多数の研究問題に答えることができる形で同じサンプルを調製することで、個々の患者に特有の分子、細胞、遺伝子、プロテオームの洞察を発見することができます。 ヒトSchwann細胞およびVS培養物の純度は、S100マーカーについて陽性である細胞とDAPI核染色で陽性である細胞の比を用いて、免疫細胞化学法により経時的に徹底的に評価された19 。したがって、これらの細胞の純度がこの期間中最高であるため、細胞をプレーティングした後最初の2週間以内に初代ヒトシュワン細胞培養物について実験を行うことが推奨される。その後、線維芽細胞様細胞が優勢となる。あなたgh VS細胞培養物もまた培養中2週間で最大限に純粋であり、VS細胞は接触媒介性阻害を欠き、後期段階で増殖を継続する。さらに、VS組織からのタンパク質発現（セクション4）および同じ腫瘍由来の培養におけるVS細胞（セクション5）の直接...

前庭神経鞘腫（VS）は小脳門角の最も一般的な新生物であり、10万人に1人と診断されている。非転移性ではあるが、これらの腫瘍は、患者の生活の質に1,2,3,4,5,6に深刻な影響を与える。冒された個人は、通常、難聴、耳鳴り、および聴覚充満の感覚で生きる。腫瘍が成長するにつれて症状がますます衰弱し、バランスの問題、顔面の麻痺、および他の脳神経機能の障害を引き起こす。脳幹圧迫による生命を脅かす複雑な合併症も起こり得る7 。 VSの管理オプションは、本質的に静的腫瘍および定位放射線療法または成長する腫瘍のための外科的切除を待つことに制限されている VSは末梢感覚神経（ すなわち、前庭神経）から生じるので、VS関連の観察を、人間の大耳神経（GAN）などの適切な制御神経から得られたものと比較することが重要である。健康なGANは、胸腺摘除術または頸部切開の間に定期的に屠殺され、健康なシュワン細胞生理学の頑強なモデルとして使用することができる9 。 散発性VSの治療または予防のためのFDA認可の薬物は存在しないため、研究者は根底にある分子メカニズムを解明することが不可欠です治療標的を同定するために疾患の病因を同定する。 VEGF、シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）、核因子κB（NF-κB）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、胃腸管壊死因子α（TNF-α）などのVS病因に役割を果たすことが示されているタンパク質は、 、表皮成長因子受容体（EGFR）、および関連するシグナル伝達分子10,11,12,13,14,15,16,17が含まれる。 最近の進歩は、初代ヒト前庭神経鞘腫および健康な神経組織の収集、処理、培養、および下流の調査のためのプロトコールを拡大および改良した18,19 。しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、単一の下流の研究適用（ すなわち、細胞培養のみ）のためのそのような組織の導入。この記事では、細胞型特異的培養、タンパク質抽出、RNA保存、腫瘍分泌回収、および組織固定など、複数の下流アプリケーションのための単一の初代ヒトVSまたはGANサンプルの同時処理のための統一された方法論的フレームワークを提示します。これらの密接に関連した組織は、VSに対するバイオマーカーの重要な供給源として役立つ可能性があるので、この研究は、トランスアライントリンVS切除の間のヒト脳脊髄液（CSF）および外リンパ球の外科的採取および処理について詳述する。最後に、このプロトコールは、遺伝子治療に使用するためのこの組織の新規適用として、培養における初代ヒトVS細胞のウイルス形質導入のためのステップを提示する。

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>または、Corning Laminin (CB-40232) と Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)</td></tr> <tr><td>CELLSTAR 15 mL 遠心分離チューブ、円錐形底部、目盛り、滅菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL 遠心分離チューブ、円錐形底部、目盛り、滅菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish、60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum、滅菌ろ過</td><td>済み Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates、Sterile</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸、グルタミンなし、500 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12、500 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #3 鉗子、デュモクセル</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11231-30</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子、標準チップ、イノックス</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-20</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定済み、USDA承認地域、500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>50 mLチューブ入り、-20°Cで保存。</td></tr><tr><td>ウシ精巣からのC冷凍庫ヒアルロニダーゼ、I-S型、凍結乾燥粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GPシリンジフィルターユニット、0.22 &micro;m、ポリエーテルスルホン、33 mm、滅菌</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>使用前: オンラインで利用可能なプロトコルに基づいて標準操作手順を確立する</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4、500 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010-023</td><td>オートクレーブ 使用前に</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)、100 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP ホスファターゼ阻害剤錠剤</td><td>ロシュ</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>ピアス プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>ピペットおよびピペットチップ、5/10/25 mL</td><td></td><td></td> 1.5/2.0 mL マイクロチューブ用可変<td></td></tr><tr><td>プラスチック均質化乳棒</td><td>E&K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (RNA 安定化溶液)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave 使用前</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave before to use</td></tr><tr><td>生理食塩水 - 0.9% 塩化ナトリウム注射液, 静菌剤, 20 mL</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Schuknecht Suction Tube 24 gauge</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>外科的アプローチ(一般的な耳科手術器具に加えて)および例えば青い手術マーカー</td></tr><tr><td>標本容器、または滅菌、4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C 実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ/針の組み合わせ、ルアーロックチップ、5mL、22 G x 1インチ。</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>ツベルクリンシリンジのみ、スリップチップ、1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>ツベルクリンシリンジのみ、スリップチップ、3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>超音波ホモジナイザー、4710 シリーズ、CV18 プローブ</td><td>コールパーマー</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

前庭シュワン細胞腫研究のための統一方法論的枠組み

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

前庭神経鞘腫は、脳脊髄の角度の最も一般的な新生物であり、すべての頭蓋内成長の6-8％を占める。これらの腫瘍は、冒された個体の最大95％において感音難聴を引き起こすが、この難聴の根底にある分子メカニズムは依然として分かり難い。この資料では、前庭神経鞘腫の研究に不可欠な下流の研究アプリケーションのための様々な初代ヒト組織サンプルの収集と処理を容易にするために、私たちの研究室で確立された手順を概説します。具体的には、この研究は、外科用試料からのシュワン細胞およびシュワン細胞腫細胞の収集、処理および培養のための統一された方法論的枠組みを記載する。これは、現在の研究にとって不可欠である平行処理工程と統合されています：腫瘍および神経分泌の収集、RNAの保存および収集された組織からのタンパク質の抽出、切片の調製のための組織の固定、d遺伝子療法への適用のためのアデノ随伴ウイルスへの一次ヒト細胞の曝露。さらに、この研究は、内耳および外リンパからヒトの感覚上皮を得る独特な機会として、この腫瘍を採取するためのトランスアラインメント手術アプローチを強調している。実験的品質を改善するためのヒントが提供され、一般的な落とし穴が強調表示されます。

セクション5で確立されているように、培養中の初代ヒトVS細胞は、多くの下流の研究アプリケーション（ 図1 ）において疾患関連プロセスの有益なモデルとして扱うことができる。第6節で培養された健康なシュワン細胞は、直接的で教示的な比較点を提供する。以下に概説するように、統一された方法論的フレームワークに従って処理されたVSおよびGANからの広範なデータは、以前に公開された12,13,14,15,27の複数の記事で利用可能である。 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスによる初代VS細胞の形質導入が初めて成功した（ 図2 ）。一次VS細胞を培養液で形質導入した<html>アデノ随伴ウイルスの予測祖先であるGFP発現Anc80 28 。 Anc80は、インビトロおよびイン...

このプロトコールの目的は、前庭神経鞘腫およびシュワン細胞研究における複数の下流適用のためのヒト外科用サンプルの収集および処理を概説することである。

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

この手順の全体的な目的は、手術室から提供されたヒト前庭神経鞘腫のサンプルを処理し、初代細胞培養および腫瘍分泌物の回収を行うことです。この手法は、複数のバイオ分子アッセイに使用することを目的としたヒト原発性腫瘍サンプルの最適な受領、保存、および処理方法など、前庭神経鞘腫研究における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、最小限の操作による培養法を用いて、ヒト前庭神経鞘腫の初代細胞を増殖させることができる点にあります。この手法の意義は、有望な治療候補物質を培養細胞で直接的に検証できるため、前庭神経鞘腫の治療への応用へと広がります。まず、手術室からの搬送に使用した氷から、採取したばかりの前庭神経鞘腫または大耳介神経の検体容器を、研究室のラミナーフローフードへと移動させます。滅菌鉗子を用いて、検体を1.4 mLのPBS（1×）が入った3本の1.5 mLチューブの1本目に慎重に移します。検体を注入後、各チューブを密閉し、軽く振って洗浄します。サンプルを乾燥した60 mmのシャーレに入れ、ピンセットを用いて血管が顕著な領域にある死組織をすべて取り除きます。ピンセットまたはメスを用いて、RNA保存、タンパク質抽出、分泌物の回収、固定、および細胞培養用にサンプルを分割します。細胞培養用に指定した検体の一部を、5〜8 mLの冷やしたサプリメント添加DMEM F12培地を含む新しい60 mm培養皿に移します。分泌物の回収用に指定した前庭神経鞘腫または大耳介神経の一部を、空の1.5 mLチューブに入れます。まず、FBSを添加していないDMEM 500 µLを2本の1.5 mLチューブにピペッティングします。1本目のチューブを腫瘍分泌液の回収に使用し、2本目のチューブを対照群として使用します。DMEMが入ったチューブの1本を校正済みのデジタル電子天秤に載せます。天秤を風袋引きし、分泌液回収用に指定した検体片をチューブに入れ、重量を測定します。結果を記録します。これは組織のみの重量となります。ラミナーフローフード内で、チューブ内のDMEMの量を、検体10 mgあたり100 µLになるように調整してください。組織サンプルとそれに対応するコントロールを入れたチューブをインキュベーターに入れます。腫瘍または神経分泌物を生物学的に有用な量まで回収するため、少なくとも72時間インキュベートします。72時間のインキュベート後、1 mLピペットを使用して、検体から分泌物を含む培地を回収します。凍結融解の繰り返しを避けるため、計画している後続の解析に合わせて培地を新しいチューブに分注してください。後続のアプリケーションを開始するまで、元の組織片、分泌液、およびコントロールDMEMを−80°Cのフリーザーで保存します。両手にピンセットを持ち、前庭神経鞘腫組織を約1mm³の断片に分けることで、培養手順を開始します。次に、10mmのセロファンピペットで培地と腫瘍片を吸引し、すべての内容物を15mLコニカルチューブに移します。25°Cで1000Gにて3分間遠心分離します。遠心分離の間、60mm培養ディッシュに4.7mLの補充済みDMEM F12培地、250µLのコラゲナーゼ、および50µLのヒアルロニダーゼを合わせて、組織分散培地を調製します。遠心分離後、腫瘍片がコニカルチューブの底にペレットとして形成されます。上清を慎重にピペットで吸い出し、廃棄します。次に、調製したばかりの酵素含有崩壊培地 2 mL を腫瘍パレットに加えます。ピペッティングを数回繰り返し組織を遊離させ、その後 60 mm 培養皿に移します。培養皿をインキュベーターに18時間入れ、翌日、10% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM F12培地を37 °Cのウォーターバスで加温します。前庭神経鞘腫の培養物が入った皿をインキュベーターから取り出し、フローフードへ移動させます。6 mLシリンジに取り付けた22ゲージの針を用いて、培地を含む培養物を吸引し、新しい15 mmコニカルチューブに移します。37 °Cで1000Gにて5分間遠心分離します。その間に、滅菌済みピンセットを使用して、必要数のポリデシンおよびラミニンコート済みガラスカバースリップを24ウェル培養プレートに配置します。1 cm³の腫瘍から24〜32ウェル分を培養できるため、ほとんどの小さな腫瘍では、8〜16ウェルの培養細胞を計画することが適切です。遠心分離後、上清を捨て、あらかじめ温めておいた培地で残った細胞ペレットを再懸濁し、予定しているウェル1つあたり1 mLの細胞懸濁液となるように調整します。5 mLのセロロジカルピペットを用いて細胞懸濁液を2 mL吸引し、24ウェルプレートのウェルに1 mLずつ分注します。同様に、腫瘍細胞を含む培地を2 mLずつ吸引し、1 mLずつ予定の各ウェルに分注する操作を繰り返し、すべての準備済みウェルに腫瘍細胞懸濁液が均等に分かれるようにします。24ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内に一晩置きます。翌日プレートを確認し、ウェルの底に顕著なデブリが認められる場合は、接着細胞を剥離させないよう注意しながら、各ウェルの培地を新しいサプリメント添加DMEM F12培養培地に慎重に交換してください。デブリがない場合は、プレートをインキュベーターに戻し、5日目に初めて培地を交換し、その後は3日ごとに交換します。この明視野像は、培養された前庭神経鞘腫細胞の典型的な組織化パターンを示しています。これらの一次ヒト前庭神経鞘腫培養の免疫蛍光画像は、緑色で示されるGFP発現ink 80に48時間曝露させた後に撮影されました。赤色蛍光は細胞骨格を染色するファロイジンFアクチン免疫染色によるものであり、青色蛍光は核を染色するDAPIによるものです。挿入図は、低倍率像の特定領域を高倍率で撮影したものです。この手順を行う際は、後の工程を正確な培養期間を経て実施できるよう、分泌物サンプルと培養サンプルをインキュベーターに入れた時間を記録しておくことが重要です。この手順に続き、ウイルス導入、固定、免疫蛍光染色、薬剤処理、RNA抽出などの他の手法を行うことで、異なるウイルスが細胞内でどのように発現しているか、あるいは薬剤処理後に遺伝子発現がどのように変化するかといった追加の疑問を検討することが可能です。この手法の開発により、前庭神経鞘腫研究分野の研究者が、手術を受けた生存患者において、ヒト一次細胞がさまざまな薬剤にどのように反応するかを探索する道が開かれました。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

方法は、6自由度（6DF）モーションシミュレータを用いて、ヒトにおける三次元前庭眼用反射を（3D VOR）を測定するために記載されている。...

フリーダムモーションプラットフォーム度6を使用した三次元前庭眼反射テスト

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主観的視覚的垂直パラダイムを用いたロールプレーンにおける静的なグラビゼーション知覚の評価

本稿では、7テスラ磁気共鳴断層撮影(7T-MRT)スキャナーで、磁気前庭刺激下での反射眼球運動、自己運動知覚、認知課題、および前庭器官の解剖学的方向を評価するための実験設定、材料、および手順について説明します。...

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学ぶ前庭シュワン細胞腫研究のための一次細胞培養と腫瘍分泌物収集の標準化手法。最小侵襲的な培養法により細胞生存性を保持し、治療薬候補の直接評価を可能にする統一方法論を確立する。

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