前庭シュワン細胞腫研究のための統一方法論的枠組み

この手順の全体的な目的は、手術室から提供されたヒト前庭神経鞘腫のサンプルを処理し、初代細胞培養および腫瘍分泌物の回収を行うことです。この手法は、複数のバイオ分子アッセイに使用することを目的としたヒト原発性腫瘍サンプルの最適な受領、保存、および処理方法など、前庭神経鞘腫研究における重要な課題の解決に寄与します。本技術の主な利点は、最小限の操作による培養法を用いて、ヒト前庭神経鞘腫の初代細胞を増殖させることができる点にあります。

この手法の意義は、有望な治療候補物質を培養細胞で直接的に検証できるため、前庭神経鞘腫の治療への応用へと広がります。まず、手術室からの搬送に使用した氷から、採取したばかりの前庭神経鞘腫または大耳介神経の検体容器を、研究室のラミナーフローフードへと移動させます。滅菌鉗子を用いて、検体を1.4 mLのPBS（1×）が入った3本の1.5 mLチューブの1本目に慎重に移します。

検体を注入後、各チューブを密閉し、軽く振って洗浄します。サンプルを乾燥した60 mmのシャーレに入れ、ピンセットを用いて血管が顕著な領域にある死組織をすべて取り除きます。ピンセットまたはメスを用いて、RNA保存、タンパク質抽出、分泌物の回収、固定、および細胞培養用にサンプルを分割します。

細胞培養用に指定した検体の一部を、5〜8 mLの冷やしたサプリメント添加DMEM F12培地を含む新しい60 mm培養皿に移します。分泌物の回収用に指定した前庭神経鞘腫または大耳介神経の一部を、空の1.5 mLチューブに入れます。まず、FBSを添加していないDMEM 500 µLを2本の1.5 mLチューブにピペッティングします。

1本目のチューブを腫瘍分泌液の回収に使用し、2本目のチューブを対照群として使用します。DMEMが入ったチューブの1本を校正済みのデジタル電子天秤に載せます。天秤を風袋引きし、分泌液回収用に指定した検体片をチューブに入れ、重量を測定します。

結果を記録します。これは組織のみの重量となります。ラミナーフローフード内で、チューブ内のDMEMの量を、検体10 mgあたり100 µLになるように調整してください。組織サンプルとそれに対応するコントロールを入れたチューブをインキュベーターに入れます。

腫瘍または神経分泌物を生物学的に有用な量まで回収するため、少なくとも72時間インキュベートします。72時間のインキュベート後、1 mLピペットを使用して、検体から分泌物を含む培地を回収します。凍結融解の繰り返しを避けるため、計画している後続の解析に合わせて培地を新しいチューブに分注してください。

後続のアプリケーションを開始するまで、元の組織片、分泌液、およびコントロールDMEMを−80°Cのフリーザーで保存します。両手にピンセットを持ち、前庭神経鞘腫組織を約1mm³の断片に分けることで、培養手順を開始します。次に、10mmのセロファンピペットで培地と腫瘍片を吸引し、すべての内容物を15mLコニカルチューブに移します。

25°Cで1000Gにて3分間遠心分離します。遠心分離の間、60mm培養ディッシュに4.7mLの補充済みDMEM F12培地、250µLのコラゲナーゼ、および50µLのヒアルロニダーゼを合わせて、組織分散培地を調製します。遠心分離後、腫瘍片がコニカルチューブの底にペレットとして形成されます。

上清を慎重にピペットで吸い出し、廃棄します。次に、調製したばかりの酵素含有崩壊培地 2 mL を腫瘍パレットに加えます。ピペッティングを数回繰り返し組織を遊離させ、その後 60 mm 培養皿に移します。

培養皿をインキュベーターに18時間入れ、翌日、10% FBSおよび1% ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したDMEM F12培地を37 °Cのウォーターバスで加温します。前庭神経鞘腫の培養物が入った皿をインキュベーターから取り出し、フローフードへ移動させます。6 mLシリンジに取り付けた22ゲージの針を用いて、培地を含む培養物を吸引し、新しい15 mmコニカルチューブに移します。

37 °Cで1000Gにて5分間遠心分離します。その間に、滅菌済みピンセットを使用して、必要数のポリデシンおよびラミニンコート済みガラスカバースリップを24ウェル培養プレートに配置します。1 cm³の腫瘍から24〜32ウェル分を培養できるため、ほとんどの小さな腫瘍では、8〜16ウェルの培養細胞を計画することが適切です。

遠心分離後、上清を捨て、あらかじめ温めておいた培地で残った細胞ペレットを再懸濁し、予定しているウェル1つあたり1 mLの細胞懸濁液となるように調整します。5 mLのセロロジカルピペットを用いて細胞懸濁液を2 mL吸引し、24ウェルプレートのウェルに1 mLずつ分注します。同様に、腫瘍細胞を含む培地を2 mLずつ吸引し、1 mLずつ予定の各ウェルに分注する操作を繰り返し、すべての準備済みウェルに腫瘍細胞懸濁液が均等に分かれるようにします。

24ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内に一晩置きます。翌日プレートを確認し、ウェルの底に顕著なデブリが認められる場合は、接着細胞を剥離させないよう注意しながら、各ウェルの培地を新しいサプリメント添加DMEM F12培養培地に慎重に交換してください。デブリがない場合は、プレートをインキュベーターに戻し、5日目に初めて培地を交換し、その後は3日ごとに交換します。

この明視野像は、培養された前庭神経鞘腫細胞の典型的な組織化パターンを示しています。これらの一次ヒト前庭神経鞘腫培養の免疫蛍光画像は、緑色で示されるGFP発現ink 80に48時間曝露させた後に撮影されました。赤色蛍光は細胞骨格を染色するファロイジンFアクチン免疫染色によるものであり、青色蛍光は核を染色するDAPIによるものです。

挿入図は、低倍率像の特定領域を高倍率で撮影したものです。この手順を行う際は、後の工程を正確な培養期間を経て実施できるよう、分泌物サンプルと培養サンプルをインキュベーターに入れた時間を記録しておくことが重要です。この手順に続き、ウイルス導入、固定、免疫蛍光染色、薬剤処理、RNA抽出などの他の手法を行うことで、異なるウイルスが細胞内でどのように発現しているか、あるいは薬剤処理後に遺伝子発現がどのように変化するかといった追加の疑問を検討することが可能です。

この手法の開発により、前庭神経鞘腫研究分野の研究者が、手術を受けた生存患者において、ヒト一次細胞がさまざまな薬剤にどのように反応するかを探索する道が開かれました。