生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

このリアルタイムのハイスループットサイクリックAMPアッセイの全体的な目標は、匂い物質受容体に対する匂い物質をスクリーニングすること、またはその逆です。マウスは、匂い受容体の機能を調べるのに有用であるため、匂い受容体とリガンドの両方の大規模なスクリーニング、および目的の受容体-リガンドペアの薬理学的カルテル化が可能になります。この手法の主な利点は、匂い物質から受容体への活性化を効率的かつ確実に評価できることです。

生細胞を用いた匂い物質から受容体への異種発現系。まず、位相差顕微鏡でHana3A細胞を観察し、細胞の生存率を確認し、コンフルエンスを推定します。次に、細胞培養皿からすべての培地を吸引します。

そして、10ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水をプレートに加え、皿を渦巻き、PBSを吸引して細胞を洗浄します。次に、0.5%トリプシン-EDTAの3ミリリットルをプレートに加えます。トリプシンを細胞に1分間、またはすべての細胞が浮かぶまで放置します。

10%FBSで5ミリリットルのMEMを加え、ピペッティングで上下に動かして細胞塊のチャンクを分解することにより、トリプシンを不活性化します。細胞数を行った後、15ミリリットルチューブにトランスフェクトする96ウェルプレートごとに2x10を6番目の細胞に移します。刺激前に細胞の過成長または下生長を避けるために、96ウェルプレートに調製する細胞の正しい数を計算することが重要です。

チューブをGの200倍で5分間遠心分離します。そして、セルパレットを乱さずに上清を吸引します。96ウェルプレートごとに抗生物質を含まない6ミリリットルの培地を加え、気泡を作らずにピペットで上下させて細胞塊をバラバラにします。

懸濁した細胞をリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで挿入します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。

トランスフェクションの前に、位相差顕微鏡でプレーティングされた細胞を観察し、ウェルあたり約30〜50%の適切なコンフルエンスを確認してから、インキュベーターに戻します。タグ付けされた行の匂い物質から受容体へのコンストラクト、アクセサリーファクターコンストラクト、およびサイクリックAMPバイオセンサーバリアントコンストラクトに従ってください。次に、96ウェルプレートごとに500マイクロリットルのMEMに血漿トランスフェクション混合物を調製します。

次に、500マイクロリットルのMEM中に18マイクロリットルの脂質媒介トランスフェクション試薬を含むトランスフェクション混合物を調製します。トランスフェクション混合物を血漿混合物とピペッティングで上下させて混合します。その後、室温で15分間インキュベートします。

インキュベーション後、トランスフェクションミックスに5ミリリットルのMEMと10%FBSを加えて反応を停止します。次に、細胞培養フードに滅菌ペーパータオルの厚い層を広げます。インキュベーターから細胞を入れた96ウェルプレートを取ります。

ペーパータオルの山にプレートを逆さまに軽くたたいて、メディウムがペーパータオルに完全に吸収されるように、そっと繰り返します。組み合わせたトランスフェクション混合物50マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で18〜24時間一晩インキュベートします。トランスフェクションは管理でき、刺激スケジュールは1回の実験で複数の96ウェルプレートが試験されるため、装置上で持続し、すべてのプレートが同じトランスフェクションおよび蒸留器の曝露間隔でミラーリングされるようにする必要があります。

刺激する前に、トランスフェクションされた細胞を位相差顕微鏡で観察し、インキュベーターに戻る前にウェルあたり50〜80%の適切なコンフルエンスを確認します。次に、ハンクスのバランス塩溶液に10ミリモルのヒープと5ミリモルのグルコースを加えて刺激培地を準備します。氷上で55マイクロリットルのリアルタイムサイクリックAMPアッセイ基質試薬アロコートを解凍します。

基質試薬の55マイクロリットルと刺激媒体の2、750マイクロリットルを混合することにより、2%等しいアブレーション溶液を調製します。ベンチに厚手のペーパータオルを敷き詰めた後、トランスフェクション培地がペーパータオルに吸収されるように、プレートを逆さまにして優しく繰り返し叩きます。各ウェルに50マイクロリットルの刺激培地をピペッティングして細胞を洗浄します。

96ウェルプレートから刺激培地を優しく繰り返しタップアウトします。25マイクロリットルの2%等価溶液を各ウェルにピペットで移し、暗所で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション時間が終了する前に、解凍した臭気剤ストック溶液を作業濃縮および刺激媒体に希釈します。

匂い物質を添加する前に、化学発光プレートリーダーを使用して、プレートの基礎発光レベルを測定します。プレートリーダーからプレートをすばやく取り外し、各ウェルに25マイクロリットルの臭気希釈液を追加します。その後、直ちに全ウェルの連続発光測定を30分以内に20サイクル

379のユニークなヒト匂い受容体を、リアルタイムのサイクリックAMPアッセイを使用して、30マイクロモルの筋肉に対してスクリーニングしました。X軸に沿った色付きのブロックは、さまざまな人間の匂い受容体ファミリーを示しています。Y軸は、匂い物質添加の30分後、応答がポジティブコントロールの最大に達したときの正規化された発光を表します。

OR5AN1の応答を示します。この図は、異なる濃度のムスコーンによるOR5AN1活性化のリアルタイム測定と、無臭ネガティブコントロールの結果を示しています。矢印はオデラント加算の時点を示します。

ここでは、オデラント添加の30分後のムスコーンに対するOR5AN1の濃度応答曲線が示されている。ここで説明する手法は、初日に培養層のストックプレートから開始して合計3日かかります。一度習得すれば、最終日のプロセスは、適切に実行されれば、各96ウェルプレートで3時間で完了することができます。

このビデオを見れば、サイクリックAMPアッセイを使用してオデラント受容体の活性化を管理し、結果を活用する方法について十分に理解できるはずです。