Name: 生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ生細胞を用いたリアルタイム高スループットcAMPアッセイによる嗅覚受容体活性化評価法。Hana3A細胞のヘテロロガス発現系を活用し、オドラントと受容体のスクリーニングを効率的かつ信頼性高く行う薬理学的アプローチを習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

仕事に支えられ中国国立科学財団 (31070972)、科学技術委員会の上海の自治体 (16ZR1418300)、革新的な研究チームの上海市教育委員会、上海の東のためのプログラム学者プログラム (J50201) と中国 (2012CB910401) の国民の基礎研究プログラム。

1 です Hana3A 細胞のメンテナンスと養殖 <ol><li>10% 牛胎児血清 (FBS)、100 で最低限必要な媒体 (MEM) 10 mL に維持セル μ G/ml ペニシリン-ストレプトマイシン、および 1.25 μ g/mL アムホテリシン B 100 mm。5% CO 2 と 37 ° C 細胞文化のインキュベーターで細胞培養ディッシュ。すべての他の通路に追加プラスミド (を参照してください 導入) の安定したトランスフェクションを維持するために 1 μ g/mL ピューロマイシン 。
	メモ: クラス II 生物学的安全キャビネット滅菌環境を確保するために細胞培養に関連するすべての手順を実行します</li>。
	<li>100 mm 料理 2-3 日毎に 10 〜 20% の割合でサブカルチャー</li>。
</ol> 2。Transfection のため細胞をめっき <ol><li>Hana3A 細胞細胞生存率を確保し、合流を推定する位相差顕微鏡下で観察します</li>。
	<li>細胞培養ディッシュからすべての媒体を吸い出しなさい</li>。
	<li>プレートの上にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加し、料理を旋回、PBS を吸引洗浄セル</li>。
	<li>は、0.05% トリプシン - エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、プレートの 3 mL を加えます。1 分またはすべてのセルが海上までミックス 。
	注: セルに応じて顕微鏡下にプレートの底からデタッチの進行状況を観察します</li>。
	<li>MEM 10 %fbs と上下のチャンクを分割するピペット 5 mL を追加することで不活性化トリプシン携帯マサチューセッツ州 
	注: トランスフェクション前めっきに使用される媒体を含めないでください抗生物質。抗生物質の添加は、トランスフェクション効率を減らすかもしれない</li>。
	<li>は、トランスフェクションする板の数に応じて 15 mLl チューブに細胞の適切な量を転送します。各 96 ウェル プレート、プレート 2 x 10 6 セル、または 100% コンフルエント 100 mm ディッシュの約 1/5 は、ウェルあたりよくまたは約 15-30% の合流点の密度ごとの 4 セル 2 x 10 のセルの数を与えます。5 分間 200 x g でチューブを遠心し、細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します 。
	注: 短期または刺激する前にセルを undergrowing を避けるために 96 ウェル プレートの上にメッキするセルの適切な量を計算します</li>。
	<li>は、質量セルのチャンクを分割する 10 %15 mL に FBS 管、ピペットの上下と MEM の適切な量を追加します。各 96 ウェル プレートは、6 ml の 10% と MEM の細胞を再懸濁します FBS。 。
	注: するチューブに空気の泡を生成しないように注意してください</li>。
	<li>は、貯留層に浮遊細胞を追加します。96 ウェル プレートの各ウェルにセルの 50 μ L のピペット マルチ チャンネル ピペットを使用する。5% CO 2 と 37 ° C で一晩インキュベートします</li>。
</ol> 3。プラスミドのトランスフェクション <ol><li>トランスフェクション効率を促進する前に約 30-50% 位相差顕微鏡下で井戸の適切な合流を確認し、インキュベーターに戻るメッキの細胞を観察します</li>。
	<li>準備事前にタグ付きのローまたは構築 11 , 21 , 22 , 28, アクセサリーの要因を構築 (RTP1S 22, 36 M3R 23) バイオ センサー バリアント miniprep によって 29 , 30 を構築します。分光光度計によって DNA の濃度を定量化し、必要に応じて蒸留水プラスミド DNA 濃度 (例えば に 100 ng/μ L) を調整します</li>。
	<li>トランスフェクション混合 <ol><li>表 1 に従って各 96 ウェル プレートの MEM を 500 μ l 添加のプラスミッドのトランスフェクション混合物を準備します 。
		注: 異なる ORs 同じ 96 ウェル プレートで、テストするときトランスフェクション混合物とプラスミド DNA を追加量のボリューム合わせられなければならない特定 or transfected 井戸の数の関数にします</li>。
		<li>18 μ 500 μ L の槍玉に脂質を介したトランスフェクション試薬とチューブでトランスフェクション混合物の準備</li>
	</ol></li> <li>上下ピペッティングによるトランスフェクション混合物とプラスミドの混合物を混ぜます。15 分、室温でインキュベート</li>
	<li>10% と MEM の 5 mL の追加によって反作用を停止 FBS</li>。
	<li>は細胞文化フード滅菌ペーパー タオルの厚い層に広がった。インキュベーターから細胞の 96 ウェル プレートを取る。ゆっくりと繰り返しタップ板ペーパー タオルの山の上の逆さま媒体はペーパー タオルで完全に吸収されるようにします 。
	注: 強制的にまたは突然をタップしないようにプレートとして 1 つのセルを失う可能性があります</li>。
	<li>96 ウェル プレートの各ウェルに結合されたトランスフェクション混合物の 50 μ L を転送し、5% CO 2 と 37 ° C で 18-24 時間一晩インキュベートします 。
	注: 時間管理のトランスフェクションと刺激スケジュールする必要があります測定の前すべてプレート同時トランスフェクションと刺激の露光時間を測定するために 1 つの実験で 1 つ以上の 96 ウェル プレートをテストするときです</li>。
</ol> 4。刺激と測定またはリアルタイム キャンプ アッセイを用いたアクティビティ <ol><li>ウェルあたり 50-80% の適切な合流を確認し、インキュベーターに戻る位相差顕微鏡下で transfected セルを観察</li>。
	<li>ハンクにグルコース 10 mM ヒドロキシエチル piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) と 5 mM を追加して刺激メディアの準備 &#39; s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS).</li>
	<li>氷上リアルタイム キャンプ アッセイ基質試薬因数分解しなさい。PCR チューブにチューブあたり 55 μ L で-80 ° C で基質試薬を格納します。プレートごと 1 のチューブを使用します</li>。
	<li>基質試薬の 55 μ L と 2750 μ L HBSS/HEPES/グルコース溶液を混合することによって 2% の平衡化ソリューションを準備します</li>。
	<li>は、ベンチにペーパー タオルの厚い層を広げた。ゆっくりと繰り返しタップ板ペーパー タオルの上の逆さまトランスフェクション媒体はペーパー タオルで完全に吸収されるようにします</li>。
	<li>の各ウェルに HBSS/HEPES/グルコース溶液 50 μ L 分注でセルを洗浄しています</li>。
	<li>96 ウェル プレートから HBSS/HEPES/グルコース溶液をゆっくりと繰り返しタップします</li>。
	<li>それぞれ 2% 平衡解のピペット 25 μ L と 2 h. のために室温でインキュベート</li>
	<li>嗅覚原液 DMSO、-20 ° c まで使用店で事前に 1 M を準備します</li>。
	<li>インキュベーション時間の終わりまで希釈 HBSS/HEPES/グルコース刺激培地で働く集中する臭気物質原液 。
	注: この手順で準備臭気物質の希釈液の濃度を倍にする各ウェルで正しい最終濃度を屈する</li>。
	<li>プレート リーダーとさらに匂い、前によく 34 あたり 1000 ms の速度で 2 回連続の板の基底の発光レベルを測定、化学発光を用いたします</li>。
	<li>は、プレート リーダーからプレートをすばやく削除各ウェルに 25 μ L の臭気物質の希釈を追加し、20 サイクルのすべての井戸の連続発光測定をすぐに30 分以内 
	注: 近隣の汚染を避けるために注意深くピペット井戸同じ板の別の匂いと同じ匂いの濃度の異なるを使用する場合</li>。
</ol> 5。データ分析 <ol><li>発光プレート リーダー ソフトウェアからデータをエクスポートします</li>。
	<li>計算式を使用して各時間ポイントまたは応答を正規化 
	(発光 N &#8211; 発光 基底)/(発光 最高 &#8211; 発光 基底) 、N = 特定の発光値よく; 基底基底の 2 つの平均発光値を =発光値;最高 = 板の最高発光値またはプレートのセットです 。
	注: 実験の目的に応じて代替のグラフィカルな表現を採用することができます。たとえば、スクリーニング アッセイ ( 図 1 参照) や最大値など、運動の測定時に必要な時点で特定の井戸の発光値濃度応答曲線を生成するため、または最終的な値を使用できます</li>。
</ol>

<ol><li>Malakoff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+scent+of+avian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Following the scent of avian olfaction.</a> Science. 286 (5440), 704-705 (1999).</li>
<li>Zippel, H. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037663578290033X">The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8.</a> Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).</li>
<li>Dryer, L., Berghard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors%3A+a+plethora+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+the+holy+grail%3A+establishing+a+molecular+basis+for+Mammalian+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction.</a> Cell. 116 (2), 329-336 (2004).</li>
<li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+eugenol-responsive+and+muscone-responsive+mouse+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors.</a> J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).</li>
<li>Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+mammalian+olfactory+receptors%3A+measurement+of+receptor+activation+via+luciferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity.</a> J. Vis. Exp. (88), e51640(2014).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Sci Signal. 2 (60), ra9(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+activated+olfactory+neurons+identifies+odorant+receptors+for+odors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Kajiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>von der Weid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+profiling+of+chemosensory+neurons+identifies+receptor-ligand+pairs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).</li>
<li>D'Hulst, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MouSensor%3A+A+Versatile+Genetic+Platform+to+Create+Super+Sniffer+Mice+for+Studying+Human+Odor+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding.</a> Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+retention%2C+degradation%2C+and+aggregation+of+olfactory+G-protein+coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+for+olfactory+receptors+by+functional+expression+of+a+receptor+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library.</a> Cell. 95 (7), 917-926 (1998).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Sci Signal. 4 (155), ra1(2011).</li>
<li>Durocher, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reporter+gene+assay+for+high-throughput+screening+of+G-protein-coupled+receptors+stably+or+transiently+expressed+in+HEK293+EBNA+cells+grown+in+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture.</a> Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).</li>
<li>Liberles, S. D., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+class+of+chemosensory+receptors+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium.</a> Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).</li>
<li>Saraiva, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+effects+of+odorants+on+mouse+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial effects of odorants on mouse behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).</li>
<li>Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+analysis+of+odor+coding+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium.</a> J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).</li>
<li>Fan, B. F., Wood, K. V. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/~/media/files/resources/reprints/glosensor_gen_2009_gr001.ashx?la=en">Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications.</a> Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).</li>
<li>Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Butter+Aroma+Recombinate+Activates+Human+Class-I+Odorant+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors.</a> J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).</li>
<li>Noe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OR2M3%3A+A+Highly+Specific+and+Narrowly+Tuned+Human+Odorant+Receptor+for+the+Sensitive+Detection+of+Onion+Key+Food+Odorant+3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol.</a> Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).</li>
<li>Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+broadly+tuned+odorant+receptor+OR1A1+is+highly+selective+for+3-methyl-2%2C4-nonanedione%2C+a+key+food+odorant+in+aged+wines%2C+tea%2C+and+other+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods.</a> Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+copper+in+detection+of+metal-coordinating+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smelling+Sulfur%3A+Copper+and+Silver+Regulate+the+Response+of+Human+Odorant+Receptor+OR2T11+to+Low-Molecular-Weight+Thiols%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols.</a> J Am Chem Soc. , (2016).</li>
<li>Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-transporting+protein+1+short+%28RTP1S%29+mediates+translocation+and+activation+of+odorant+receptors+by+acting+through+multiple+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps.</a> J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).</li>
<li>Shirasu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+and+neural+pathway+responsible+for+highly+selective+sensing+of+musk+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.</a> Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).</li>
<li>Block, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implausibility+of+the+vibrational+theory+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Implausibility of the vibrational theory of olfaction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).</li>
<li>Sato-Akuhara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+Specificity+and+Evolution+of+Mammalian+Musk+Odor+Receptors%3A+Effect+of+Single+Receptor+Deletion+on+Odor+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection.</a> J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).</li>
<li>Gane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+vibration-sensing+component+in+human+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular vibration-sensing component in human olfaction.</a> PLoS One. 8 (1), e55780(2013).</li>
<li>Young, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+evolutionary+processes+shaped+the+mouse+and+human+olfactory+receptor+gene+families%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families.</a> Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

嗅覚情報の符号化の解読の第一歩は、正確に特定の臭気物質への露出に OR の活性化を測定します。この研究を表す方法の 1 つの例によって識別できる、体外で示されている実験 OR 式システム、人間またはレパートリーの関心とその後受容体を特徴付ける臭気化学の中で応答 ORs薬理学の化学物質の濃度を使用します。我々 の結果は、ムスコンbona fideの受容体として OR5AN1 を確認します。これは以前レポート39と一貫性のある、受容体の数が少ないがムスク臭27,40をセンシングに関与しているという憶測に対する更なる証拠を提供しています。佐藤 Akuharaら類似または異種発現系のルシフェラーゼ アッセイによって生成されるからスクリーニング データと比べると、審査結果はやや悪い信号対雑音比を示した。関与する別の技術に固有のバリエーション以外にも出力の違いは低いムスコン濃度 (μ M の対100 の 30 μ ...

嗅覚は、食べ物を得るため、捕食者や危険を避けるため、種を区別、仲間1,2を選択する彼らの嗅覚の能力に依存している動物の生存に重要な役割を果たしています。これらの機能の実現 (OE) の嗅上皮にある嗅覚ニューロン (OSNs) 毛様体表面の表現は個別に嗅覚受容体 (ORs) によって異なります。ORs は、最大約 400 と 1200 多様な OR 遺伝子とヒト G タンパク共役型受容体 (GPCR) スーパーファミリーの家族やマウス、それぞれ3,4,5を構成します。匂いによって活性化される ORs は嗅覚 G タンパク質 (Golf) のシーケンシャルの活性化を介して細胞内 camp を増加につながるし、III アデニル酸シクラーゼ (ACIII) を入力します。メッセンジャーの 1 つ、細胞表面のヌクレオチド依存性チャネルを開き、Ca2 +や活動電位、最終的に開始するなどの陽イオンの流入をトリガーとして機能することが, 細胞内 cAMP の結果増加レベル神経電位伝送と嗅覚。検出および多数 ORs による匂いの識別のプロセスは、嗅知覚6、7の最初のステップと見なされます。
以来、木びき台およびアクセル8は最初正常に嗅覚受容体を複製し、ORs による嗅覚のメカニズムを解明、または家族の deorphanization この分野でのホット スポットの一つとなった。または活性化を測定する各種の体内、体外と体外の方法は、報告された9,10、11,12をされています。Ca2 +イメージングに続いて単一細胞 RT-PCR OSNs でを使用した従来の方法には、脂肪族の匂い13,14,15異なる嗅覚受容体の同定が有効になります。最近では、大規模なトランスクリプトーム解析の出現より体内の高スループット方法の開発を推進しました。ケンタッキーの試金は S100a5 tauGFP レポーター マウスひずみとマイクロ アレイ解析の9使用でオイゲノールとムスコン応答マウス ORs を識別しました。夢テクノロジー匂い暴露後または mRNA のレベルの減少に基づき、脊椎動物や非脊椎動物の種16両でまたはライセンス認証プロファイルを決定するトランスクリプトーム アプローチを採用しました。同様に、神経細胞の活性化で S6 のリン酸化を考えると、松波は応答の ORs12を識別するためにリン酸化リボソーム immunoprecipitations からシーケンスされた Mrna をグループ化します。最後に、ファインスタイン上院議員グループは、においは生体内で、MouSensor 技術17として知られているコーディングを研究するためのプラットフォームとして役立つことができるスーパー スニファー マウスを報告しました。
体外の王国で OSNs を養殖への挑戦はまたは機能発現体内を模した異種発現システムを ORs の臭気化学薬品の大規模スクリーニングを実施する理想的なソリューションになります。それにもかかわらず、ネイティブ OSNs と異なる非嗅覚起源の培養細胞やタンパク質は、小胞体、細胞膜へのトラフィックにできませんが保持されます、ので OR 劣化と受容体機能18の損失で、その結果,19します。 この問題を解決するために広範な作品複製または異種細胞における細胞膜の機能発現に加えられました。Krautwurstらはまずロドプシン (Rho-タグ) の最初 20 のアミノ酸をまたはタンパク質の N 末端に接続し、人間の萌芽期の腎臓 (HEK) セル20いくつかの ORs の細胞表面発現を促進しました。単一 OSNs から遺伝子発現 (セージ) ライブラリ解析のシリアル解析を実施して斎藤ら。最初のクローンされた受容体輸送蛋白質 (RTP) 家族のメンバー、RTP1 と RTP2、または細胞膜に人身売買を促進および拡張 HEK293T 細胞における嗅覚受容体の匂いを介した応答受容体式エンハンサー蛋白質 1 (REEP1)21. これらの調査結果に基づいて、松波グループ正常に Hana3A 細胞株を確立、HEK293T で Gα、REEP1、RTP2 RTP1olf安定発現および一過性発現する効率的なまたは機能のための Rho タグ ORs式です。その後の研究は、1) RTP1、RTP1S より確実を促進またはオリジナルの RTP1 のタンパク質と 2) 3 型ムスカリン性アセチルコリン受容体 (M3R) β アレスチン 2 の抑制を介してまたはアクティビティを高めることができるよりも機能の短いフォームを明らかにどちらの実験を最適化する異種発現システムに導入された募集は22,23を出力します。
いくつかの検出方法は、異種システムの受容体活性化を定量化するために使用されています。分泌される抗胎盤性アルカリホスファターゼ (SEAP) アッセイは、レポーター酵素がキャンプの応答の要素 (クレス) 調節または活性化を評価するための魅力的なオプションを作るそれで動作します。蛍光容易に SEAP 検出試薬24培養後の培地のサンプルで検出されます。このメソッドを使用して、ORs としてアミン関連受容体 (TAARs) がされている OE のトレースで表される化学感覚受容体の二次クラスの機能は、25,26,27を特徴付けられます。別の一般的な方法、ルシフェラーゼ アッセイは、キャンプの応答の要素 (CRE) の制御の下でホタルのルシフェラーゼ レポーターの遺伝子を使用します。ルシフェラーゼ生産によって生成される発光を測定または活性化10、11,28を定量化の効率的かつ堅牢な手段を提供します。
また、リアルタイムのキャンプ アッセイは、異種または内因性の Gpcr の機能を動的に監視で広く使用されています。このような高度な試金の一例では、ルシフェラーゼの変異形に融合 cAMP 結合ドメインを所有している遺伝的コード化バイオ センサーの変形を活用します。キャンプを結合すると、構造変化は化学発光リーダー29,30で測定することができますから発光ルシフェラーゼの活性化に します。リアルタイムのキャンプの技術は、HEK293 NxG 108CC15 細胞におけるひと嗅覚受容体の脱孤立化に適した報告されていますお尻 ="xref"> 31,32,33、HEK293T 由来 Hana3A 同様に細胞34,35。Krautwurst グループでは双方向の大規模なまたはスクリーニングのアプローチ32,33に合うようにリアルタイム キャンプ技術も詳細で説明します。
ここで Hana3A 細胞におけるリアルタイム キャンプの試金を使用してまたは活性化を測定するためのプロトコルについて述べる。30 分治療特定の揮発性化合物と、しにくいまたは活性化のより効率的かつ正確な分析を表すこのプロトコルで事前釣合いの生きているセルの発光を速度論的測定します。長時間と臭気による細胞毒性細胞環境で発生するアーティファクト。このリアルタイム測定興味の特定のまたはリガンド ペアの特性と同様、ORs とリガンドの大規模スクリーニングが可能です。このメソッドを使用して、ことに成功した OR5AN1 ムスク化合物ムスコンの受容体として 379 人間 ORs に対してスクリーニングを実行しその後肯定的なスクリーニング結果を確認します。

<table><tbody><tr><td>アムホテリシン B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP 試薬</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP プラスミド</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A cells</td><td></td><td></td> ご要望<td>に応じて著者から入手可能</td></tr><tr><td>HBSS, without calcium or magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>M3R plasmid</td><td></td><td></td><td>cloned into a mammalian expression vector such as pCI</td></tr><tr><td>MEM, with EBSS and L-glutamine</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>SantaCruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Musk tibetene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165</td><td></td></tr><tr><td>OR プラスミド</td>を <td>Rho タグでクローニングし、pCI PBS などの哺乳類発現ベクターにクローニング</td><td></td><td></td>、</tr>カルシウム<tr><td>またはマグネシウムなし</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド ミニプレップ キット</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S プラスミド</td><td></td><td></td>を pCI Trypsin-EDTA Hyclone SH30236 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tube</td><td>、Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL、Eppendorf tube</td>、<td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL、17 mm x 120 mm、コニカルチューブなどの哺乳類発現ベクターにクローニング</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルおよび/または12ウェルマルチチャンネルピペットマン</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底白細胞培養プレート</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Class II 生物学的安全キャビネット、層流</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>付き細胞培養インキュベーター、5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機、15mlコニカルチューブ</td><td></td><td></td><td></td>用スイングバケットローター付き</tr><tr><td>Infinite F200プレートリーダー</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡(対物レンズ×10および×20 分光</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>付き)マルチチャンネル分配</td><td></td><td></td><td></td>用の滅菌試薬リザーバー</tr><tr><td>滅菌ペーパータオル</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

哺乳類の嗅覚受容体 (OR) 家族の巨大なサイズは、多数の揮発性化学物質の中で、同種の配位子を見つけることの難しさを提示します。効率的かつ正確には、ORs を deorphanize、我々 はリアルタイムでまたは活性化の下流 cAMP の産生を測定する哺乳類 ORs とバイオ センサー遺伝子組み換えプラスミドを表現する異種細胞ラインの使用を組み合わせます。この試金は画面ニオイ Or その逆に対して使用できます。画面から肯定的な嗅覚受容体の相互作用は、様々 な臭気濃度、濃度反応曲線を生成するテストによってその後確認できます。ここも積極的に応じる受容体が関心の化合物の同種の受容体である Hana3A 細胞で発現を行い人間またはライブラリに対して臭気化合物高速スクリーニングを実行するのにこのメソッドを使用します。効率的なまたはアクティブ化を評価する上で信頼性の高いこのハイスループット検出方法がわかったし、我々 のデータまたは機能研究の潜在的な使用の例を提供します。

ムスコン天然ムスクから芳香主成分であります。ムスコンとマウスまたは、MOR215 1、行動マウス37,38ムスコン応答性腎糸球体からクローンに相同性に基づく他の大環状ムスク化合物のひと受容体として同定された OR5AN1 の最近の調査します。また人間またはレパートリー、当社グループと東原和グループをスクリーニングとして識別される OR5AN1 2 大環状ムスク化合物、cyclopentadecanone、ムスコンの主要な受容体, ルシフェラーゼ アッセイ システム38,39 を使用して.
ここで説明されているリアルタイムのキャンプのアッセイを使用して、30 μ M ムスコン (図...

嗅覚受容体の機能を特徴づける deorphanization プロセスの不可欠な部分を提供しています。キャンプの試金を使用してリアルタイムの嗅覚受容体の活性化を測定する手法を提案します。

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

このリアルタイム・ハイスループットcAMPアッセイの全体的な目的は、嗅覚受容体に対する嗅覚物質、およびその逆のスクリーニングを行うことです。マウスは、嗅覚受容体とリガンドの両方の広範なスクリーニングに加え、関心のある受容体とリガンドのペアの薬理学的キャラクタライゼーションを可能にするため、嗅覚受容体の機能を調査するのに有用です。この手法の主な利点は、嗅覚物質による受容体の活性化を効率的かつ信頼性高く評価できることです。生細胞を用いた異種嗅覚受容体発現システム。まず、位相差顕微鏡下でHana3A細胞を観察し、細胞の生存率を確認し、コンフルエンスを推定します。次に、細胞培養ディッシュからすべての培地を吸引します。10 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をプレートに加え、ディッシュを揺らして洗浄し、PBSを吸引します。次に、0.5% trypsin-EDTAを3 mLプレートに加えます。trypsinを細胞に1分間、またはすべての細胞が剥離するまで作用させます。10% FBS含有MEMを5ミリリットル添加し、ピペッティングで細胞塊を分散させることでトリプシンを不活化させます。細胞数を計測後、トランスフェクションを行う96ウェルプレート1枚あたり2×10^6個の細胞を15ミリリットルチューブに移します。刺激前の細胞の過剰増殖または増殖不足を防ぐため、96ウェルプレートに播種する正確な細胞数を算出することが重要です。チューブを200 ×gで5分間遠心分離します。その後、細胞ペレットを乱さないように上清を吸引除去します。96ウェルプレート1枚につき6 mLの抗生物質を含まない培地を加え、気泡が入らないようにピペッティングして細胞塊を分散させます。懸濁させた細胞をリザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートの各ウェルに細胞を50 µLずつ分注します。37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。トランスフェクションを行う前に、位相差顕微鏡下で播種した細胞を観察し、各ウェルのコンフルエンスが適切に30～50%程度であることを確認した後、インキュベーターに戻します。におい物質-受容体構築物、アクセサリー因子構築物、およびサイクリックAMPバイオセンサー変異体構築物の行に従ってください。その後、96ウェルプレート1枚につき500 µLのMEMでプラスミドトランスフェクション混合液を調製します。次に、500 µLのMEMに18 µLのリポフェクション試薬を含むトランスフェクション混合液を調製します。ピペッティングにより、トランスフェクション混合液と血漿混合液を混ぜ合わせます。その後、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、トランスフェクションミックスに10%FBS含有MEMを5 milliliters加えて反応を停止させます。次に、細胞培養フード内に滅菌ペーパータオルを厚く敷き詰めます。インキュベーターから細胞が入った96-well plateを取り出します。プレートを逆さまにしてペーパータオルの山に軽く繰り返し叩きつけ、培地を完全に吸収させます。混合したトランスフェクション液を96ウェルプレートの各ウェルに50 µLずつ分注し、37 °C、5% CO2条件下で18〜24時間、一晩インキュベートします。1つの実験で複数の96ウェルプレートをテストする場合は、すべてのプレートが同一のトランスフェクションおよび刺激曝露間隔となるよう、トランスフェクションと刺激のスケジュールを管理してください。刺激を加える前に、位相差顕微鏡下でトランスフェクションした細胞を観察し、1ウェルあたりのコンフルエンスが50〜80%であることを確認してからインキュベーターに戻します。次に、Hanks' balanced salt solutionに10 millimolarのheapsと5 millimolarのglucoseを添加して、刺激用培地を調製します。リアルタイムcyclic AMPアッセイ基質試薬の55 microliters分注液を氷上で融解します。基質試薬55 µLと刺激培地2,750 µLを混合し、2% equal abration溶液を調製します。ベンチ上にペーパータオルを厚く敷き、プレートを逆さまにしてペーパータオル上で軽く繰り返し叩き、トランスフェクション培地をペーパータオルに吸収させます。各ウェルに刺激培地50 µLをピペッティングして、細胞を洗浄します。96ウェルプレートから刺激培地を、優しく繰り返し叩くようにして取り除きます。各ウェルに2%平衡化溶液を25 µLずつピペットで分注し、室温の暗所で2時間インキュベートします。インキュベーション終了前に、解凍した匂物質ストック溶液を、刺激培地を用いて作業濃度まで希釈します。 odorantを添加する前に、化学ルミネッセンスプレートリーダーを使用してプレートの基底ルミネッセンスレベルを測定します。プレートリーダーから速やかにプレートを取り出し、各ウェルに25 µLのodorant希釈液を添加します。その後、直ちにすべてのウェルの連続ルミネッセンス測定を、30分以内に20サイクルで開始します。リアルタイムcAMPアッセイを用いて、30 µMのムスコンに対する379種類のヒト嗅覚受容体のスクリーニングを行った。X軸沿いの色付きブロックは、異なるヒト嗅覚受容体ファミリーを示している。Y axisは、ポジティブコントロールの反応が最大に達した、嗅覚物質添加30分後の正規化ルミネッセンスを表している。OR5AN1の応答を示します。この図は、異なる濃度のムスコンによるOR5AN1活性化のリアルタイム測定結果と、無臭の陰性対照の結果を示しています。矢印はオドラント添加の時点を示しています。ここでは、におい物質添加から30分後のムスコンに対するOR5AN1の濃度反応曲線を示しています。ここで説明する手法は、1日目に培養層のストックプレートを準備することから始まり、計3日間を要します。習熟すれば、最終日の工程は適切に行うことで、96ウェルプレート1枚につき3時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、cAMPアッセイを用いて嗅覚受容体の活性化を制御し、その結果を利用する方法について十分に理解することができます。

live-cell-measurement-odorant-receptor-activation-using-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。...

異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

このビデオでは、環状アデノシン一リン酸(cAMP)バイオセンサーと発光検出を使用して、トランスフェクションされた細胞の匂い受容体活性化を測定するためのプロトコルを示しています。この方法は、嗅覚ニューロンにおける受容体-リガンド相互作用とシグナル伝達経路の研究に適用されます。...

リアルタイム環状アデノシン一リン酸アッセイを用いた匂い物質受容体活性化の測定

出典:de March, C. A. et.al., 気相中の匂気物質による匂い受容体活性化のリアルタイム In Vitro モニタリング。J. Vis. Exp.

組換え細胞における匂い物質受容体活性化のリアルタイムモニタリング

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。...

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。...

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々...

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

生理的には、嗅覚受容体は匂い分子気相に吸入によってアクティブ化されます。ただし、ほとんどの in vitro システムは、液相嗅覚刺激を利用します。嗅覚刺激による気相匂い物質受容体活性化のリアルタイムでの in vitro...

気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

この研究で提示されたプロトコルは、2つの方法によるcAMPの測定におけるcAMP差分検出器 In Situ...

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

嗅覚受容ニューロン（ORNs）が受容体に最初のターンで嗅球の2次ニューロンに伝達される活動電位を引き起こすことを、現在の匂い信号を変換します。ここでは同時に匂い物質誘発性受容体マウスORNsから現在の活動電位を記録するための吸引ピペットのテクニックについて説明します。...

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

学ぶ生細胞を用いたリアルタイム高スループットcAMPアッセイによる嗅覚受容体活性化評価法。Hana3A細胞のヘテロロガス発現系を活用し、オドラントと受容体のスクリーニングを効率的かつ信頼性高く行う薬理学的アプローチを習得できます。

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイムキャンプ

さらに動画を探す

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

さらに動画を探す

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイムキャンプ