インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験

この赤血球凝集阻害アッセイの全体的な目標は、目的の特定のウイルスに対する抗体価を測定することです。この方法は、ワクチン学分野における、さまざまな集団内、さまざまな年齢層、患者グループにおけるワクチンを介した免疫と防御に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、正確であることと、中和抗体の存在を迅速に力価で決定できることです。

この方法は、ヒトの抗体価に関する洞察を得ることができますが、マウス血清の抗体価や培養上清など、他のシステムにも適用できます。まず、96ウェルマイクロタイタープレートに適切な実験情報をラベル付けします。次に、プレートを垂直方向に回転させ、マルチチャンネルピペットを使用して、下部の背部滴定列の最初のウェルを除くすべてのウェルに25マイクロリットルのPBSを追加します。

調製したばかりの目的の抗原溶液50マイクロリットルを後滴定列の最初のウェルに加え、続いてRDE処理血清サンプル25マイクロリットルを上位10列の最初のウェルに加えます。ポジティブコントロールとして、25マイクロリットルの適切な抗血清を11行目の最初のウェルに加えます。各列の最初のウェルから25マイクロリットルを連続したウェルに移し、連続した2倍の希釈を行います。

希釈ステップごとに10〜15回ピペットを上下させ、最後のウェルから最後の25マイクロリットルを廃棄します。次に、25マイクロリットルの抗原溶液を1列目から11列の各ウェルに加え、25マイクロリットルのPBSを後滴定列の各ウェルにのみ加えます。プレートの4面を10回丁寧に叩いて混ぜ合わせます。

次に、プレートを室温で30分間覆います。インキュベーションの終わりに、各ウェルに50マイクロリットルの赤血球溶液を加え、さらにタッピングしてプレートを混合します。次に、プレートを再度覆い、表に示されているように使用される種に従って赤血球をインキュベートします。

赤血球をプレートに添加した後、アッセイで使用する血液の種類に適したインキュベーション時間を守ってください。インキュベーションが短すぎたり長すぎたりすると、結果の解釈が間違ってしまいます。インキュベーションの終了時に、プレートを90度25秒間傾けて赤血球凝集を評価し、プレートを傾けたまま、96ウェルプレートの印刷スキームに各ウェルの結果をマークします。

この実験では、2015年インフルエンザシーズン24日前に、インフルエンザA/H1N1/California/2009、A/H3N2/Texas/2012、B/Massachusetts/O2/2012を含む不活化三価インフルエンザワクチンを接種した26人の健康なボランティアを対象に、ワクチン誘発性抗体反応を評価しました。A/H3N2/Switzerland/2013およびA/H3N2/Texas/2012ウイルス株では交差反応性免疫応答が観察され、幾何平均赤血球凝集阻害力価が有意に低く、インフルエンザA/H3N2/Texas/2012と比較してインフルエンザA/H3N2/Switzerland/2013に対するセロプロテクションが誘発されました。ワクチン接種後、ワクチンにはA/H3N2/Switzerland/2013株が存在しなかったにもかかわらず、両株に対する抗体価は上昇しました。

ウイルス性赤血球凝集素は、赤血球赤血球凝集の種依存性を示しています。興味深いことに、モルモットの血液はインフルエンザBで適切に血球凝集せず、シチメンチョウの血液は高力価と低い交差反応性で赤血球凝集の可能性があります。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば3時間で完了することができます。

この手順を試みる際には、ウイルスの赤血球凝集中に非特異的な阻害剤や非特異的結合を不活性化するために、RDEで血清を投与することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、ELISAなどの他の方法を実行して、個々の病原体特異的免疫グロブリンの役割に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、ウイルス免疫学の分野の研究者が、さまざまな年齢層の健康な患者と免疫抑制された患者におけるワクチン関連免疫の理解を深める道を開きました。

このビデオを見れば、インフルエンザ株特異的抗体価を大規模に定量するための赤血球凝集阻害アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。ウイルス抗原、動物の血液、ヒト血清サンプルの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際にはBSL2実験室での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。