インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験

この赤血球凝集抑制試験の全体的な目的は、標的とする特定のウイルスに対する抗体価を測定することです。この手法は、ワクチン学の分野において、異なる集団や様々な年齢層および患者グループにおけるワクチン介在性免疫と保護に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、精度が高く、中和抗体の存在による抗体価を迅速に決定できることです。

この方法はヒトの抗体価に関する知見を得るのに有用ですが、マウス血清や培養上清などの他の系における抗体価の測定にも適用可能です。まず、96ウェルマイクロタイタープレートに適切な実験情報を記入します。次に、プレートを垂直方向に向け、マルチチャンネルピペットを使用して、最下段後方のタイトレーション行の最初のウェルを除くすべてのウェルに25 µLのPBSを加えます。

調製したばかりの目的抗原溶液 50 µL を逆滴定列の最初のウェルに加え、続いて RDE 処理した血清サンプル 25 µL を上から 10 列の最初のウェルにそれぞれ加えます。陽性コントロールとして、適切な抗血清 25 µL を 11 列目の最初のウェルに加えます。その後、各列の最初のウェルから次のウェルへ 25 µL ずつ移し、2倍段階希釈を行います。

希釈の各段階で10回から15回ピペッティングし、最後のウェルから25 µLを廃棄します。次に、1行目から11行目の各ウェルに抗原溶液を25 µL加え、バックタイトレーション行の各ウェルにはPBSのみを25 µL加えます。プレートの四辺を慎重に10回ずつタッピングして混合します。

その後、プレートに蓋をして室温で30分間静置します。インキュベーション終了後、各ウェルに赤血球溶液を50 µL加え、再び軽くタッピングしてプレートを混ぜ合わせます。次に、もう一度プレートに蓋をし、表に記載されている使用種に応じた条件で赤血球をインキュベートします。

プレートに赤血球を添加した後、アッセイに使用した血液の種類に応じた適切なインキュベーション時間を遵守してください。インキュベーション時間が短すぎても長すぎても、結果の誤った解釈につながります。インキュベーション終了後、プレートを90度傾けて25秒間保持し、凝集反応を評価します。プレートを傾けたまま、96ウェルプレートの印刷された図に各ウェルの結果を記入してください。

本実験では、2015-2016年インフルエンザシーズン前に、インフルエンザA/H1N1/California/2009、A/H3N2/Texas/2012、およびB/Massachusetts/O2/2012を含む不活化3価インフルエンザワクチンを接種した健康成人ボランティア26名を対象に、ワクチン誘導抗体反応を評価した。A/H3N2/Switzerland/2013株およびA/H3N2/Texas/2012株に対する交差反応性免疫反応が観察され、インフルエンザA/H3N2/Switzerland/2013に対する幾何平均赤血球凝集抑制力価および誘導された血清保護能は、インフルエンザA/H3N2/Texas/2012と比較して有意に低かった。ワクチン接種後、A/H3N2/Switzerland/2013株はワクチンに含まれていなかったにもかかわらず、両株に対する抗体価は上昇した。

ウイルスのヘマグルチニンは、種によって赤血球凝集能に差があることが示されています。注目すべき点として、モルモットの血液はインフルエンザB型で適切に凝集せず、七面鳥の血液は高タイターでの凝集能を持ち、交差反応性が低いという特性があります。この手法を習得し、適切に実施すれば、3時間以内に完了させることができます。

この手順を行う際は、ウイルスの血球凝集における非特異的な阻害物質および非特異的な結合を不活性化するために、RDEを用いて血清処理することを忘れないでください。この手順に続いて、個々の病原体特異的免疫グロブリンの役割に関するさらなる疑問を解決するために、ELISAなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、ウイルス免疫学分野の研究者が、異なる年齢層の健康な患者および免疫不全患者におけるワクチン関連免疫の理解をさらに深める道が開かれました。

このビデオを視聴することで、インフルエンザ株特異的な抗体価を大規模に定量するための、赤血球凝集抑制試験の実施方法について深く理解できるはずです。ウイルス抗原、動物血液、およびヒト血清サンプルを取り扱うことは極めて危険であるため、この手順を実施する際は、常にBSL2ラボで作業を行うなどの予防策を講じることを忘れないでください。