Name: 人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮法。人間の死後脳組織から神経変性疾患におけるミスフォールドタンパク質を迅速に分離・同定し、病態メカニズム解明に貢献する効率的な実験手法です。

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著者は、有用なコメントや提案を夫妻ジム Lah とアランの売れ行き、エモリー神経内科をありがちましょう。この作品もあって資金が供給された医学パートナーシップの促進助成 (U01AG046161-02)、エモリー アルツハイマー病研究センター (P50AG025688)、国立老化研究所 (R01AG053960-01) に与える N.T.S.この研究はだった一部のエモリー神経組織プラスミノーゲンアクテベータ中核施設助成金、P30NS055077 の神経病理コアでもサポートされます。

倫理の声明: すべての脳組織がエモリー アルツハイマーから得られた &#39; s 病研究センター (ADRC) ブレイン バンク。人間の死後の組織は適切な制度審査委員会 (IRB) プロトコルの下で買収された。
 1 均質化と分別 <ol><li>組織選択 注: AD 症例は、エモリーから選ばれた健康管理 (Ctl) からと思われる死後の前頭皮質組織を凍結。アジア防災センター ブレイン バンク (n = 2)。アルツハイマー病のためレジストリを確立するコンソーシアムによるとアミロイド斑の分布の事後神経病理学的評価を行った &#39; 病半定量が基準 24 を得点神経昆布病理学は、ブラークのステージング システムに従って評価されました。 16 <ol><li>取得健康管理 (Ctl) から病理組織学的の死後脳組織の凍結は、広告の場合を確認しました。ドライアイス、鉗子、かみそりの刃の容器を利用して、消費税 〜 250 mg tared 使い捨ての各組織サンプルから灰白質部ボート、組織が融解するを防ぐために世話の重量を量る。均質にする各お荷物の重量を記録します</li>。
		<li>消費税 〜 目視で鉗子やかみそりを使用して外側の灰白質と内部の白質間のインタ フェースを検索する灰白質の 250 mg。白質ともっと重要なは、いずれかを避けるため大きな血管や血地域、髄膜、またはくも膜。迅速に作業し、よく乾燥氷のポリスチレン容器に脳組織と計量ボートを置くことによって切削過程における凍結組織を維持</li>
		<li>は、分析用天秤を使用して各固定部分から摘出した灰白質の正確な重量を記録します。低ソルト (LS) バッファーのボリュームを計算する dounce 均質化 (5 mL/g または 20% の w/v) のために必要 (表 1 を参照).</li>
		<li>準備 10 mL LS バッファー プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテルや氷に興じ x 1</li>
		<li>は、雪解けの季節からドライアイスと約 2 × 2 mm の部分にサイコロの重量を量られた組織と計量ボートを削除します。氷上 2 mL 中古冷蔵 dounce ホモジナイザー チューブへの転送</li>
		<li>5 mL/g (20 %w/v) ホスファターゼとプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 と冷たい低塩 (LS) バッファーを追加します</li>。
		<li>Homogenize 脳組織の高クリアランス杵と杵低クリアランス B. 15 ストロークの約 10 ストロークを使って氷の上</li>
		<li>は、すべての磨砕液をガラス パスツール ピペット 2 mL ポリプロピレン チューブに転送します。ラベルを持つ管 &#8220; TH &#8221; (総磨砕液)、ティッシュ ラベル付き 1.5 mL チューブに番号、およびホモジネート ボリューム。 因数 0.8 mL の場合。避けようと-80 に格納されて任意の過剰の磨砕液を同様にすることができます ° C</li>
		<li>各 0.8 mL を分注、追加 100 μ L 各 5 M の塩化ナトリウムの 10% (w/v) sarkosyl 濃度の 0.5 M と 1 %w/v、それぞれ。逆転でよく管を混ぜるし、15 分ラベル チューブを氷中でインキュベート &#34; TH S &#34; (総磨砕液-Sarkosyl)、乳剤は、sarkosyl バッファー (表 1) を示す</li>。
		<li>氷の上の 30% の振幅で 3 つ 5 のパルスの各チューブを超音波 (最大強度 = 40%) を使用して各プローブ</li> <li>ビシンコニン酸 (BCA) を使用して磨砕液のタンパク質濃度測定 25 決定。メソッド 。
		注: 組織の 1 グラムあたり 5 mL LS で作製した TH S 乳剤の平均蛋白質の集中は 15-20 mg/mL です。ホモジネートをすぐに分別や使用まで-80 ° C で保存することができます</li>。
		<li>を 10 mg/mL の冷たいサーク バッファー (表 1) を用いたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 × 1 回-S の希釈乳剤</li>。
		500 μ L ポリカーボネート遠心管にサーク バッファーとのペア バランス各 TH S ホモジネートの <li>転送 5 mg タンパク質 (0.5 mL)。中古冷蔵ローターと 1.5 mL チューブに 4 ° C sarkosyl 可溶性転送清 (S1) で 30 分間 180,000 × g で遠心管に読み込むし、-80 デパート ° C 
		注: (任意選択洗浄) 追加 200 μ L、遠心するサーク バッファーの管洗剤不溶性画分 (P1) を含む、200 μ L ピペット チップを用いた遠心管の底からペレット (P1) を外します</li>。
		2-3 s 用 <li>簡単にパルス スピン逆管 (&#8804; 2,500 x g) 以下 1.5 mL チューブにペレット (P1) とバッファー転送する遠心機に。ペレットは中断するように、上下にピペッティングでサーク バッファーで (P1) の不溶性のペレットを再懸濁します</li>。
		<li>ペア バランスと 4 でさらに 30 分間 180,000 × g で遠心する ° C</li>
		<li>(S2) の任意選択洗浄滅菌蒸留水し、1 sarkosyl 不溶性のペレット (P2) 尿素バッファー (表 1) の 50-75 μ L を孵化させなさい室温で 30 分間の可溶化、(プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル) PIC x、ペレット 。
		SDS 析出を避けるため使用する前に室温に注意: 暖かい尿素バッファー。洗剤に敏感なアプリケーションの尿素バッファーから SDS を省略し、尿素バッファーに再する前に低い塩バッファーで不溶性のペレット (P2) の洗浄を検討します</li>。
		<li>0.5 mL チューブに再懸濁のペレット (P2) を転送し、簡単な使用 (1 s) 20% 振幅で陰極超音波 (最大強度 = 40%) 完全にペレットの可溶化</li>。
		<li>Sarkosyl 可溶性 (S1) のタンパク質濃度を決定する・ BCA を使用して不溶性 (P2) 分画測定法。すぐにこれらの分数を使用または使用するまで-80 ° C で保存します</li>。
	</ol></li></ol> 2。免疫ブロット <ol>西部にしみが付くこと <li> 注: わずかな修正と以前に報告された手順に従って行われた西部にしみが付くこと 。5 , 10 <ol><li>合計乳剤 (TH 秒)、サーク可溶性 (S1) と 5 mM TCEP pH 7 で 1 X 塩化物イオン sds-page サンプルバッファーでサーク不溶性 (P2) 分数の準備 40 μ g のサンプル。95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベート</li>
		<li>ロード サンプル プレキャスト 10 ウェル 4-12% ビス トリス SDS-PAGE のゲルします。80 最初センチメートル (10 分) のための V、120 V (60 分) 残りの部分または追跡色素がゲルの底まで electrophorese.</li>
		<li>は、開いている分割既製ゲル カセットに新鮮なかみそりの刃とゲル ナイフを使用します。櫛と新鮮なかみそりの刃とゲルの一番下を優しく切り取る</li>。
		<li>1 x ピペッティングの写真上下で 200 μ l サーク バッファーで (P1) の不溶性のペレットを再懸濁します</li>。
		<li>あぶらとりマシン上乾燥の転送方法を使用して 0.2 μ m 硝酸セルロースの膜への転送 (材料表を参照してください).</li>
		<li>ブロック BB と続いて 0.05% Tween 20、30 分間なしバッファー (BB) の妨害で膜トゥイーン 20 (BB/T) 30 分間。ブロック後、TBS/T で膜をすすいでください (0.1% Tween 20) 余分なブロック バッファーを削除する 5 分</li>。
		一次抗体 pT231、タウ 2 (パン タウ)、AT8 の <li>準備縮尺希釈液BB/t EEA1 (0.05% Tween 20).</li>
		<li>では、円形撹拌で 4 ° C で一晩一次抗体溶液中膜を孵化させなさい。3 x 15 分 TBS/T の膜を洗浄</li>
		<li>は、シェーカーで暗闇の中で蛍光標識した近赤外線二次抗体 BB/T で室温で 60 分間の 1:20,000 希釈で膜をプローブします。TBS で TBS/T で、2 × 5 分の 3 × 10 分の膜を洗浄</li>
		<li>スキャン イメージング システム (例えば 700 nm (赤のチャネル) 赤外光吸収色素 680 ヤギ抗マウス IgG (H + L) セカンダリと 800 nm (グリーン チャンネル) 赤外光吸収色素 790 ロバ抗うさぎ IgG (H + L のための適切な励起波長の赤外線を用いた膜) セカンダリ).</li>
		<li>イメージング ソフトウェアを使用して信号強度を定量化し、メーカーごとのデンシトメトリーによる計測を実行 &#39; の指示、自動-背景の設定を確保する背景全体を平均に設定されます</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここを紹介し、議論する省略形のシングル ステップ洗剤分別のプロトコルさまざまな試金の折りたたみ機能性タンパク質質量分析を用いたプロテオミクス解析に至る実験アプリケーションに適用されます。西部にしみが付くこと.5,6,7,10この方法論は、おそらく最も効果的なアルツハイマー病など神経変性 proteinopathies を勉強していたとき、ALS、ハンチントン病、プリオン病、様々 なタウオパチー。元の 5 つのステップ順次分別のプロトコルと比較して、単一手順は 1 日で完了することができ、非常に同様の結果を与えます。5,6,7,9<...

アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、密接に関連のプリオン病などの神経変性疾患はの漸進的な蓄積によって特徴付けられる proteinopathies脳内認知を伴う洗剤不溶性タンパク質凝集体を辞退します。1,2この共有の病理学的特徴は、病因とこれらの神経変性疾患の病態の中心的な役割を果たすと考えられています。2これらの凝集体は通常繰り返し誤って折りたたまれたタンパク質がβクロス展示の単位から成る高分子アミロイド線維の構成-構造。1,2,3,4生化学的、アミロイド凝集体は耐化学または熱変性と溶解、分析、浄化に特有の課題3と、従来の生化学的な手法で研究します。2,5,6,7,8,9,10,11当然、洗剤不溶性タンパク質画分されている誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積を伴う神経変性疾患の病態生理に多くの研究の焦点。6,12,13,14
生化学的な分別の技術は、死後脳乳剤から洗剤不溶性分画を豊かにするためしばしば利用されています。6,12,13,14最も一般的な方法の 1 つを含むバッファーを持つ組織ホモジネートの連続抽出と水溶性と不溶性画分を分割する遠心続いて逼迫化洗剤。一般的に使用されるシーケンシャル分別プロトコル6,14を含む洗剤を用いない低塩 (LS) バッファーの凍結するティッシュ サンプルの均質化と結果不溶性のペレットが順番に抽出した、高い塩、非イオン性洗剤、高蔗糖を含むバッファー、界面活性剤そして chaotropes 尿素のような。6,14このような連続した分別のプロトコルの明らかな欠点はかなりの時間とそれらを完了するために必要な労働のコミットメントです。均質化と超遠心法を含む典型的な 5 つのステップ分別プロトコル取ることができるいくつか時間、あるいは日で完了します。4,6,7,10,15,16,17,18また、として多くの病理学的タンパク質凝集体残る過酷な条件19,20を除いてすべての不溶性生成された分数のほとんどは、限られた価値。したがって、高い塩の集中および非イオン性洗剤を利用したより少なく厳しい分別手順は主に冗長です。
以前の研究では、イオン洗剤 N ラウリルサルコシン (sarkosyl) が簡易のシングル ステップ洗剤分別のプロトコルのための優秀な候補者であることを示しています。5,6,12,13,14,21,22,23変化洗剤として sarkosyl は β-アミロイド (a β)6,11 から成る誤って折りたたまれたタンパク質凝集体を可なし脳内ネイティブ折られた蛋白質の大半を可溶化に十分に厳格リン酸化タウ (pTau)、6タール DNA 結合蛋白質 43 (TDP-43)、14 α-シヌクレイン、12,13スクレイピー、23または U1 小さなに原子力 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) U1-70 K など。5,21,22Sarkosyl ユビキタス陰イオン洗剤ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) よりより少なく厳しいが、SDS の処置に耐えることはできません誤って折りたたまれたタンパク質の凝集体の堅牢性の低いオリゴマー フォームを保存します。9
以前より面倒の順次分別方法論に匹敵する結果を達成する省略形の洗剤-分別のプロトコルについて述べる。5以下の厳しい分別手順を省略するが死後の人間の脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮の安易なシングル ステップ分別のプロトコルを開発することができました。5記載この詳細なプロトコルは西部にしみが付くことから、さまざまな実験的用途の広い範囲のために適して、プロテオミクスの質量分析を用いた機能性タンパク質の折りたたみと集計のシードを試金します。5,6,21

<table><tbody><tr><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル、EDTAフリー(100X)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー78441</td><td>プロテアーゼ&ホスファターゼ阻害剤カクテル</td></tr><tr><td>ソニック記憶装置システム(超音波装置)</td><td>フィッシャーサイエンティ</td><td>フィックFB505110</td><td>マイクロチップ超音波装置</td></tr><tr><td>Optimax TLX超遠心分離</td>機<td>ベックマンコールター</td><td>361545</td><td>冷蔵超遠心分離機</td></tr><tr><td>TLA120.1ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>362224</td><td>超遠心分離機ローター</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) ポリカーボネートチューブ、厚肉</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>TLA120.1 ローター用 343776超遠心チューブ</td></tr><tr><td>4X SDS サンプルバッファー</td><td>自家製</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP 溶液、中性 pH</td><td>サーモフィッシャー</td><td>77720</td><td>還元剤</td></tr><tr><td>(TBS) ブロッキングバッファー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>37542</td><td>ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>(TBS) ブロッキングバッファー + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>ブロッキングバッファーおよび抗体希釈剤</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus ゲル、10 ウェル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>NW04120BOX</td><td>プレキャスト SDS-PAGE ゲル</td></tr><tr><td>MES SDS ランニングバッファー (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE ランニングバッファー</td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩 (サルコシル)</td> <td>SigmaAldrich</td><td>L5777-50G</td><td>界面活性剤</td></tr><tr><td>抗タウ-2 (パンタウ) 抗体</td><td>ケミコン</td><td>MAB375</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗リン酸化スレオニン 231 タウ抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB5450</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗リン酸化セロイン 202 およびスレオニン 205 タウ抗体 (AT8)</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>MN1020</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗早期エンドソーム抗原 1 (EEA1) 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab2900</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790ロバ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>抗体</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulos, mini</td><td>サーモフィッシャー</td><td>IB23002</td><td>ゲル転写</td></tr></tbody></table>

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

本研究ではヒトの死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮のため短縮されたシングル ステップ分別プロトコルについて述べる.イオン洗剤 N ラウリルサルコシン (sarkosyl) は効果的に脳組織の変性 proteinopathies の広い範囲から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮を許可するようにネイティブで折られた蛋白質を可溶性します。アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病。人間の制御と広告死後脳組織病理学的リン酸化タウ、原線維変化のコア コンポーネントを含む洗剤不溶性タンパク質凝集体を豊かにする sarkosyl の存在下で超遠心法による均質化と堆積をいた広告のもつれ。集約されたリン酸化タウと洗剤水溶性タンパク質、初期エンドソーム抗原 1 (EEA1) コントロール、AD 脳での差分の溶解性を示した西部にしみが付くこと。プロテオーム解析も明らかに豊かなβ-アミロイド (a β)、タウ、snRNP70 (U1-70 K)、およびコントロール、前組織分別戦略と一貫性のあるのに比べて AD 脳の sarkosyl 不溶性画分におけるアポリポ蛋白 E (アポ).したがって、この単純な濃縮プロトコルは質量分析を用いたプロテオミクス共同凝集アッセイ西部にしみが付くこと機能性タンパク質からまで実験用アプリケーションの広い範囲に最適です。

省略されたシングル ステップ sarkosyl-分別のプロトコルは、管理と広告死後脳 (図 1) から洗剤不溶性タンパク質凝集体を豊かにする使用されました。TH S、S1、S2、P2 の一部分からの蛋白質は、SDS-PAGE、Coomassie 青い固定バッファー続けて Coomassie ブリリアント ブルー G-250 染色バッファーと穏やかな染色で 15 分間固定によって解決されました。S2 画分中のタンパク質の検出不可能なレベルがあったので、再懸濁の手順は省略可能 (1.1.14 を参照)。西部のしみの分析 (図 2 a とB) AD 脳の病理学的高分子量のリン酸化タウ凝集された sarkosyl 不溶性とに残ったほとんど pTau を明らかに示して、sarkosyl 可溶性画分。5,</...

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

この分画プロトコルの全体的な目的は、ヒトの死後脳組織から界面活性剤不溶性タンパク質凝集体を濃縮することです。したがって、本手法は、疾患におけるミスフォールドタンパク質凝集体の同定や特性解析など、神経変性分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、短時間で脳組織から界面活性剤不溶性タンパク質凝集体を迅速に濃縮および単離できることです。本手順の実演は、私の研究室の技術者であるTram Nguyenが行います。健康な対照群および病理学的にADと確認された検体から、凍結した死後脳組織を入手します。ピンセットとカミソリを使用し、各組織サンプルから約250 mgの灰白質を切り出します。脳組織片を1分間放置して融解させます。次に、組織片を解凍しながら、約2 mm³の立方体に細切にします。氷上で、あらかじめ冷却した2 mLのDounceホモジナイザーチューブに移します。この際、白質や太い血管を避けるように注意してください。迅速に作業を行い、組織を使い捨ての計量ボート（TARE）に載せます。脳組織を入れた計量ボートをドライアイス入りのポリスチレン容器に頻繁に戻し、組織が解凍されないよう注意してください。必要な組織片をすべて解剖し、計量した後、組織片が入った計量ボートをドライアイスから取り出します。次に、組織1gあたり、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む氷冷低塩バッファーを5mL加え、ハイクリアランスペッスルAで約10回、ロークリアランスペッスルBで15回、氷上でホモジナイズします。その後、9インチのガラス製パステールピペットを用いて、各ホモジネートをラベル付きの2mLポリプロピレンチューブに移します。残りのホモジネートは同様にラベル付きの1.5mLチューブに分注し、-80°Cで保存します。分画を進めるには、0.8mLの各分注液に5M NaClを100µL、10% sarkosylを100µL加えます。転倒混和して十分に混ぜ合わせます。その後、氷上で15分間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロチッププローブを備えたソニケーターを用い、振幅30%で5秒間のパルスを3回照射します。ビシンコニン酸法を用いてホモジネートのタンパク質濃度を測定した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む氷冷したSarkバッファーを各サンプルに添加し、最終濃度を10 mg/mLにします。次に、各サンプル500 µLを500 µL用ポリカーボネート製超遠心管に移します。チューブをあらかじめ冷却したローターにセットし、4 °Cで180,000 ×gにて30分間超遠心分離を行います。遠心分離後、S1サルコシル可溶性上清を1.5 mLチューブに移し、-80 °Cで保存します。界面活性剤不溶性のP1画分を含む超遠心管に200 µLのサルコバッファーを加え、ピペットチップを用いて超遠心管の底部からペレットを剥離させます。次に、再懸濁したP1ペレットを新しい500 µL超遠心管に移し、ペアバランスを調整して、4 °Cで180,000 ×gにてさらに30分間遠心分離します。S2上清を廃棄します。次に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む尿素バッファーを50〜75 µL、sarkosyl不溶性ペレットに添加し、室温で30分間インキュベートしてP2ペレットを可溶化させます。インキュベート後、再懸濁したP2ペレットをラベル付きの0.5 mLチューブに移し、振幅20%で1秒間の短時間のマイクロチップソニケーションを行い、ペレットを完全に可溶化させます。BCAアッセイ法を用いて、サルコシル可溶性画分およびサルコシル不溶性画分のタンパク質濃度を決定します。pH 7の5 mM TCEPを含む1× Laemmli SDS-PAGEサンプルバッファーを用いて、全ホモジネート、サルコシル可溶性S1、およびサルコシル不溶性P2画分の40 µgのサンプルを調製します。サンプルを95 °Cで5分間インキュベートします。サンプルを、あらかじめ作製した10ウェル、4～12% Bis-Tris SDS-PAGEゲルにロードします。最初の1cmまでを80Vで、その後、トラッキングダイがゲルの下端に達するまで、または約1時間、120Vで電気泳動を行います。あらかじめ作製したゲルカセットを蒸留水に浸し、新しいカミソリとゲルナイフを用いて切り開きます。新しいカミソリの刃を用いて、各ゲルのコーム部分と最下部を慎重に切り落とします。ブロッティング装置を用い、ドライ転写法で0.2 micronニトロセルロース膜に転写します。転写後、Tween-20を含まないブロッキングバッファーで30分間膜をブロッキングし、続いて0.5% Tween-20を含むブロッキングバッファーで30分間ブロッキングします。ブロッキング後、過剰なブロッキングバッファーを除去するため、0.1% Tween-20を含むTBSでメンブレンを5分間洗浄します。0.5% Tween-20を含むブロッキングバッファーを用いて、一次抗体を1:1,000に希釈して調製します。ここではPhospho-Tau pT231およびEEA1を使用します。メンブレンを一次抗体溶液中で4°Cにて一晩、円を描くように攪拌しながらインキュベートします。翌日、0.1% Tween-20を含むTBSで、15分間ずつ3回メンブレンを洗浄します。その後、1:20,000に希釈した蛍光標識近赤外二次抗体と0.5% Tween-20を含むブロッキングバッファーを用いて、室温・暗所にてシェーカーで60分間メンブレンをプローブします。インキュベーション後、0.1% Tween-20を含むTBSで10分間3回、次いでTBSで5分間2回、メンブレンを洗浄します。使用した二次抗体に適切な励起波長を用い、赤外線イメージングシステムでメンブレンをスキャンします。このクーマシー染色ゲルは、TH-S、S1、S2、およびP2画分から得られた20 mcgのタンパク質を示しています。ウェスタンブロット解析により、AD脳において、病理学的な高分子量のリン酸化Tauがサルコシル不溶性として凝集しており、サルコシル画分に残存するリン酸化Tauはごくわずかであることが明確に示されました。EEA1は、本質的にサルコシル可溶性であり、対照群およびAD脳の両方でS1画分に分配される、ほとんどの正常な非病理学的タンパク質の一般マーカーとして使用されました。注目すべき点として、可溶性画分におけるEEA1のシグナルはTH-S画分と比較してわずかに低く、EEA1の少量のプールがサルコシル不溶性である可能性が高いものの、この特定の抗体を用いたウェスタンブロットの検出限界以下であることが示唆されました。この図は、単一ステップまたは多段階の分画プロトコルを用いた病理的ADタンパク質のプロテオーム解析を示しています。単一ステップの分画技術は、サンプル全体の損失が大幅に減少するため、低存在量のタンパク質に対して有利である可能性があります。この手順を行う際は、脳組織から可能な限り多くの白質を除去することが重要です。この手順に続いて、質量分析ベースのプロテオミクスなどの他の手法を実施することで、変性疾患における病理学的凝集体のコアタンパク質成分の同定および特性解析を行うことができます。

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ほとんどのアッセイは、単一セルの分解能が不足しているため脳組織の細胞の不均質性は、クロマチンにおけるエピジェネティックなマーキングの研究のための重大な制約をもたらす。ニューロンは通常、グリア細胞および他の非神経細胞が混在しています。私たちは、人間の脳から神経細胞核を抽出して収集するプロトコルを提供しています。...

人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS -...

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

細胞プリオンタンパク質の新種（PRP...

正常なヒト脳内の可溶性および不溶性のPrPオリゴマーの分離

このビデオでは、密度勾配遠心分離と非アミロイドタンパク質の消化を使用して、マウス脳組織抽出物からアミロイド線維を分離するプロトコルを示しています。...

脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

このビデオでは、凍結死後のヒト脳組織から洗剤不溶性タンパク質凝集体を分離し、濃縮するプロセスを説明しています。これは、均質化、界面活性剤処理、超音波処理、不溶性凝集体を分離および精製するための超遠心分離などの主要なステップを示しています。最後のステップでは、凝集体を尿素緩衝液に可溶化して、さらに分析します。...

ヒト死後脳組織からの界面活性剤不溶性タンパク質凝集体の単離

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。...

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。...

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

げっ歯類やヒト被験者の脳組織から 生き生きとした...

げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。...

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

本研究は、フィラメントの組み立て、凝集、翻訳後修飾に焦点を当て、GFAPおよびその病原変異を生化学的に特徴づける実験的方法を示しています。高純度のGFAPタンパク質を解析し、アレクサンダー病のメカニズムに関する洞察が明らかになり、潜在的な治療標的の研究やGFAP変異および関連疾患の理解の枠組みとなり得ました。...

グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ

学ぶ洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮法。人間の死後脳組織から神経変性疾患におけるミスフォールドタンパク質を迅速に分離・同定し、病態メカニズム解明に貢献する効率的な実験手法です。

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

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