Name: ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング Saccharomyces cerevisiae (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶChEC-seq法によるSaccharomyces cerevisiaeのタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピング。マイクロコッカス核酸酵素融合タンパク質を用いて高解像度の結合マップを作成し、転写制御メカニズムを解明する。

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ChEC-seqの開発とMediator複合体への応用の際に、Moustafa SalehとJay Tourignyに原稿の批評とSteven HahnとSteven Henikoffの指導と支援を感謝します。 SGはNIHグラントR01GM053451とR01GM075114でサポートされ、GEZはインディアナ大学のスタートアップファンドによってサポートされています。

1.酵母菌株の生成<ol><li> MNaseでタグ付けされた目的の因子を有する酵母株を作製する。 <ol><li>指定された反応混合物（ 表2 ）およびサイクル条件（ 表3 ）を用いて、所望のベクター（ 表1 ）からMNase標識カセットをPCR増幅する。 5μLのPCR反応物と1μLの6X DNAローディング色素を混合する。各PCRアリコートを0.8％アガロースゲル上で120Vで40分間実行する。予想される製品サイズは〜2.3kbです。 </li><li>増幅されたタグ付カセットを、標準的な酢酸リチウムトランスフォーメーション22を使用して選択した株に形質転換し、選択を行う。 </li><li>コロニーPCRによるタグカセットの正確な組み込みを確認する。 <ol><li>スクリーニングするコロニーの数について、指定の反応液（ 表4 ）を調製する。必要になるまで氷上に置いてください。 </li><li>各コロニーの一部を選んでテス滅菌した爪楊枝またはピペットチップを用いてPCRチューブの底に移した。 </li><li>拾ったコロニーを1分間高出力でマイクロ波処理する。 </li><li>各マイクロ波コロニーに50μLのPCRミックス（ 表4 ）を加え、ピペットで上下にミックスします。指定されたサイクリング条件（ 表5 ）を使用してPCRを行います。 </li><li>各PCRチューブに50μLのPCR反応液と10μLの6X DNAローディング色素を直接混合する。各サンプル10μLを1％アガロースゲル上で120Vで40分間泳動する。予想される製品サイズは約700bpである。 注：必要に応じて、ウェスタンブロッティングによるMNase融合タンパク質の適切な発現を確認します。タグ付きタンパク質の分子量が約20.6キロダルトンシフトすることが予想される。 </li></ol></li></ol></li><li> 目的の遺伝子のプロモーターの相同性に基づくクローニングをpGZ136（表1）に加え、ステップ1.1.2のように形質転換および選択することにより、遊離のMNase株を作製する。 <ol><li>オルタナティ目的の遺伝子のプロモーターおよび3xFLAG-MNase-SV40 NLSをプラスミドベクターに組み込み、ステップ1.1.2のように形質転換および選択し、プラスミドの維持のための適切な選択条件で株を増殖させる。 </li></ol></li></ol> 2. ChEC <ol><li> ChEC実験前日の午後/夕方に、MNaseタグ付き因子を有する菌株の単一コロニーを有する酵母 - ペプトン - デキストロース（YPD）または適切な選択培地3mLを接種する。この培養物を一晩インキュベートする（180RPM振とう、30℃）。 </li><li> ChEC実験の当日の朝、終夜培養物を50mLの培地に希釈して、600nmでの光学密度（OD 600 ）が0.2〜0.3になるようにする。 OD 600が0.5〜0.7に達するまで、この培養物（180 RPM振盪、30℃）をインキュベートする。培養液が適切なOD 600に近づくにつれて、ヒートブロックまたはウォーターバスを30℃に設定し、Buffer A添加物（ Ta6）。 </li><li>培養液あたり5 mLのBuffer A +添加物（ 表6 ）を調製する。手順中にバッファーAを室温に保つ。 </li><li> 90μLの停止液（ 表7 ）および10μLの10％SDSを含む微量遠心管を収集する各時点で調製する。分析した各新しい因子について、0秒、30秒、1分、2.5分、5分、および10分でサンプルを採取する。 </li><li>培養液を50 mLコニカルチューブに移し、1,500 xgで室温（RT）で1分間遠心します。 </li><li>細胞を緩衝液Aの1mLに徹底的に再懸濁し、再懸濁した細胞をマイクロチューブに移す。ペレットは、微小遠心分離機に1,500 xg、RTで30秒間再懸濁した。 </li><li>上清を吸引し、上下にピペッティングすることにより、緩衝液Aの1 mL中に細胞を完全に再懸濁する。ペレットは、微小遠心分離機に1,500 xg、RTで30秒間再懸濁した。このステップを1回繰り返します。 </li><li>緩衝液Aの570μL中に細胞を徹底的に再懸濁する.30μLの2％ジギトニン（0.1％最終濃度）、細胞の透過性を促進し、混合を逆転させる。 </li><li> 30℃で5分間加熱ブロックまたは水浴中で細胞を浸透させる。 </li><li>細胞の均一な分布を確実にするために反応を上下にピペッティングします。停止溶液およびSDS（ステップ2.4）を含有する微量遠心管へのネガティブコントロールとして透過性細胞の100μLアリコートを除去し、短時間ボルテックスして混合する。 </li><li> 1.1mMの1M CaCl 2 （2mM最終濃度）を透過性細胞に添加してMNaseを活性化し、迅速に数回反転させるか、短時間ボルテックスして混合します。直ちに混合反応を30℃に戻し、タイマーを開始する。 </li><li>収集する各時点で、細胞を均一に分布させるために反応を上下にピペッティングしてから、100μLの透過細胞のアリコートを停止溶液とSDSを入れたマイクロチューブに加え、ボルテックスして混合します。分析された各新しい因子について、0秒（CaCl 2添加なし）、30秒、1分、2.5分、5分、および10分の時点で測定した。 注：30℃でDNAを迅速に切断する因子を用いたChEC実験は、MNase切断速度を遅くするために低温で行うことができる。 </li><li>すべての時点を集めたら、各サンプルに20μg/ mLプロテイナーゼK4μLを添加し、ボルテックスして短時間混合し、55℃で30分間インキュベートする。 </li><li>各サンプルに200μLの25：24：1フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、激しく撹拌して混合し、最大速度および室温で微量遠心機で5分間遠心する。 </li><li>各水相（〜150μL）を新しいチューブに移す。 30μgのグリコーゲンおよび500μLの100％エタノールを添加する。 10分間または溶液が粘性になるまでドライアイス上で混合および沈殿させるために激しく攪拌する。 </li><li>ペレットはDNAを最大速度で微量遠心分離で4℃で10分間沈殿させた。 </li><li>上清をデカントし、1mLのRT 70％エタノールでペレットを洗浄する。 </li><li>エタノールを傾瀉し、残りを紙タオルでチューブを静かに軽くたたきます。ベンチトップ遠心分離機を使用して試料を簡単に回転させ、ペレットを乱さないように注意して残留エタノールを除去するためにピペットを使用する。室温で5分間空気乾燥したペレット。 </li><li>ペレットが乾燥している間、それぞれ10mg / mL RNase AのpH 8.0 +1μLのトリス29μL中に乾燥ペレットを再懸濁するためのマスターミックスを作製する。 37℃で20分間RNAを消化する。 </li><li> 1μLの6X DNAローディング色素と5μLの各サンプルを混合し、120Vで1.5％アガロースゲル上で40分間泳動する。 </li></ol> 3.サイズ選択注：サイズ選択の目的は、配列決定されるサンプルからゲノムDNAのマルチキロベース断片を除去し、約150bp（およそヌクレオソームDNAのサイズ）以下の断片を濃縮することです。配列データでは、&lt;400bpの断片が濃縮され、ヌクレオソームDNAのサイズ（約150bp）の周りに顕著なピークがあり、サブヌクレオソーム断片のピークまたは広域分布がある。 &lt;ol&gt; <li>各サンプルに、75μLの固相可逆的固定化（SPRI）ビーズをポリエチレングリコール（PEG）溶液23に加え、ピペットで10回上下させて混合する。ビーズ：DNA混合物をRTで5分間インキュベートする。 </li><li> SPRIビーズインキュベーションの間、96μLの10mMトリス、pH8.0および4μLの5M NaClを含む微量遠心チューブを各サンプルに調製する。 </li><li>チューブを磁気ラックに入れて、チューブの側面にビーズを集める。ビーズをチューブの側面に2分間集める。 </li><li>各上清をTrisおよびNaClを含む新しいチューブに移す（ステップ3.2）。 </li><li>各サンプルに200μLの25：24：1フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、ボルテックスして混合し、最大速度および室温で微量遠心機で5分間遠心する。 </li><li>それぞれの水相を新しいチューブに移す。 30μgのグリコーゲンおよび500μLの100％エタノールを添加する。ドライアイス上でDNAを10分間または溶液が粘性になるまで沈殿させる。 </li><li>ペレットプレッサーマイクロスピードで10分間、最高速度と4℃でDNAをピットした。 </li><li>上清をデカントし、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄する。 </li><li>エタノールを傾瀉し、ペーパータオル上のチューブを反転させてゆっくりと軽くたたいて残りを取り除く。ベンチトップ遠心分離機を使用して試料を簡単に回転させ、ペレットを乱さないように注意して残留エタノールを除去するためにピペットを使用する。室温で5分間空気乾燥したペレット。 </li><li> 25μLのトリス、pH8.0中で乾燥ペレットを再懸濁する。高感度アッセイを使用してサンプル濃度を決定する。 TF ChEC実験のために、サイズ選択後に10〜100ngのDNAが日常的に回収される。 </li><li>シーケンシングライブラリを準備する。以前に記載されたように、サイズ選択に依存しないライブラリー調製プロトコル24は、広範囲のフラグメントサイズ（25〜500bp）の配列決定を可能にするために望ましい。 </li><li>ペアエンドモードのシーケンスライブラリ。高品質の読み取りのためには、各末端に最低25塩基の配列が必要ですマッピング。 1〜200万回の読み取りで、ChECサンプルに十分なカバレッジが得られます。 注：ChEC-seqデータの分析は複雑な手順であり、この記事の範囲を超えています。データ分析に関する詳細な情報は、以前の刊行物1,21にあり、分析に使用されたカスタムスクリプトはGitHub（https://github.com/zentnerlab/chec-seq）で入手できます。 HOMER 25 （http://homer.salk.edu）は、ChEC-seqデータのコマンドライン解析にも使用できます。 </li></ol>

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<li>Izzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscape+of+the+Somatic+Linker+Histone+Subtypes+H1.1+to+H1.5+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells.</a> Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).</li>
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著者は何も開示することはない。

我々は、ChECが酵母タンパク質の多様なクラスを染色体上にマッピングすることができ、それが酵母の異なるファミリーのTFおよび他のクロマチン結合因子に広く適用可能であることを予期していることを示した。 ChEC-seqは、架橋、クロマチン可溶化、または抗体を必要としないという点で有利である。したがって、ChECは、不完全なタンパク質可溶化14による偽陰性など、ハイパーチップ可能なアーチファクト3,4およびネイティブChIPなど、X-ChIP-seqに潜在的に存在するアーチファクトを回避する14 。 ChEC-seqの主要な欠点は、すべての酵素的融合法と同様に、融合タンパク質の必要条件である。これは出芽酵母で迅速に達成することができるが、後生動物ではより困難である。 ChEC-seqのもう1つの制限は、ヒストン修飾のプロファイリングのためにそのまま実施することができないことである。しかし、修飾結合ドメインをMNaseに融合させて発現させると、hChEC-seqを用いたアイソトーン変更マッピング。この...

転写因子（TF）、クロマチンリモデーダー、および他のクロマチン関連調節因子の結合部位のマッピングは、すべてのクロマチンベースのプロセスを理解する上で重要です。ゲノム生物学への多くの重要な洞察を得るために、クロマチン免疫沈降法およびハイスループットシーケンシング（ChIP-seq）アプローチが用いられてきたが、それらには顕著な限界がある。我々は最近、これらの欠点を回避するために、クロマチン内在性切断および高スループット配列決定（ChEC-seq） 1と呼ばれる別の方法を導入した。 ChIP-seqは、タンパク質-DNA相互作用を保存するために、初期ホルムアルデヒド架橋工程（X-ChIP-seq）で行われることが最も多い。しかしながら、最近の多くの研究により、X-ChIP-seqは、一過性または非特異的なタンパク質-DNA相互作用を2,3,4,5 、偽陽性結合部位を生じさせる。さらに、X-ChIP-seq実験においてクロマチンを断片化するために一般的に使用される超音波処理は、オープンクロマチンの領域を優先的に切断し、これらの領域9,10からの断片の偏った回収をもたらす。超音波処理はまた、エキソヌクレアーゼ消化工程の追加が分解能11,12を大幅に改善することができるが、最終的に結合部位分解を制限する、断片長の異種混合物を生じる。親和性精製された天然に単離されたクロマチン（ORGANIC） 13由来のゲノムの占有領域などのネイティブChIP法は、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理に関連する潜在的な偏りを緩和する、ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）しかしながら、天然のクロマチン抽出に必要とされる比較的穏やかな条件下での多くのクロマチン結合タンパク質の溶解度が低く、潜在的にダイナミックレンジおよび/または偽陰性の減少を招く可能性がある14 。 ChIP-seqの種々の反復は、タンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピングに最も一般的に使用されるが、目的のタンパク質と様々なDNA修飾酵素との融合に基づくいくつかのマッピング技術も実施されている。そのようなアプローチの1つは、目的のクロマチン結合タンパク質がダムに遺伝的に融合され、この融合が細胞または動物において発現され、タンパク質の結合部位に近接したGATC配列のメチル化をもたらす、DNAアデニンメチルトランスフェラーゼ同定（DamID） 15である。 DamIDは、免疫沈降に頼らず、架橋、抗体またはクロマチンの可溶化を回避するという点で有利である。それはインビボでも行われる 。しかしながらDamIDの分解能はキロベーススケールに限定され、Dam融合タンパク質のメチル化活性は構成的である。酵素的融合に基づく第2の方法は、興味のある因子のトランスポザーゼへの融合を用いて、トランスポゾンの部位特異的組込みを指示するCalling Card-seq 16である。 DamIDと同様に、Calling Card-seqは免疫沈降に基づいていないため、同様の利点があり、分解能が向上するという利点があります。しかし、Calling Card-seqは、トランスポゼースの配列バイアスによって制限され、トランスポゾン挿入部位に近い制限部位の存在にも依存する。 Laemmli研究室で開発された第3の酵素的融合法は、クロマチン内在性切断（ChEC） 17である。 ChECでは、クロマチン関連タンパク質とMNaseとの融合物が細胞内で発現され、MNaseを活性化するためにカルシウムが添加されると、DNAはタグ付き結合部位の近位で切断される因子（ 図1 ）。サザンブロッティングと併せて、ChECは、酵母17,18中の多数の個々の遺伝子座でのクロマチン構造およびタンパク質結合を特徴付けるために使用され、低解像度マイクロアレイ分析と組み合わせて、核細孔成分と酵母との相互作用を調べたゲノム19 。 ChECは、DamIDおよびCalling Card-seqと同様の利点を提供し、プライマー伸長19によって分析された場合、その分解能はほぼ1塩基対である。 ChECはまた制御可能である：MNaseによる頑強なDNA切断はミリモルのカルシウムの添加に依存し、MNaseは生酵母細胞で観察される低遊離カルシウム濃度で不活性である20 。 これまで、我々は、ChECを高スループット配列決定（ChEC-seq）と組み合わせることにより、TF結合部位の高分解能マップを提供すると仮定した。確かに、ChEC-seqは、出芽酵母一般制御因子（GRF）Abf1、Rap1、およびReb1のゲノム1にわたる高分解能マップを生成した。我々はまた、ChEC-seqを、直接的にDNAと接触しないChEC-seqの適用可能性を拡大し、ChIP-seqによってマッピングすることが困難な、モジュラーメディエーター複合体、保存された必須の全体的転写共活性化剤21に首尾よく適用したベースの方法。 ChEC-seqは、ChIP-seq結果の独立した検証と、クロマチン常駐プロセスの新しい洞察の生成の両方の強力な方法です。ここでは、出芽酵母におけるこの方法の実施のための段階的プロトコールを提示する。

<table><tbody><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Phusionなどの他のハイフィデリティDNAポリメラーゼは、カセット増幅に使用できます。</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ラダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイ</td>エンティフィック 10488085 <td></td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Ca2+のキレート化によるMNase切断を阻害しないように、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤ミックスを使用することが重要です。</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS Organics</td><td>AC215740010</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin, High Purity</td><td>EMD Millipore</td><td>300410-250MG</td><td>20 mg ジギトニンを 1 mL DMSO に激しく渦巻いて溶解し、2% ストックを作成します。</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK、20 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNase A、10 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP ビーズ</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Ampure様ビーズは、公開されたプロトコルを使用して生成できます(文献24)。</td></tr><tr><td>マグネスフィアマグネティックラック</td><td>プロメガ</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

chec-seqとのタンパク質 - dna相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

タンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピングは、遺伝子調節、クロマチンリモデリング、および他のクロマチン常駐プロセスを理解するために重要です。ホルムアルデヒド架橋、その後のクロマチン免疫沈降およびハイスループット配列決定（X-ChIP-seq）は、ゲノム生物学に対する多くの貴重な洞察を得るために使用されてきた。しかしながら、X-ChIP-seqは、架橋および超音波処理に関連する注目すべき制限を有する。ネイティブChIPは、架橋を省略することによってこれらの欠点を回避するが、多くの場合、クロマチン結合タンパク質の回収率が低い。さらに、すべてのChIPベースの方法は、抗体の品質を考慮する必要があります。目的のタンパク質のDNA修飾酵素への融合を含むタンパク質-DNA相互作用をマッピングするための酵素的方法もまた、タンパク質-DNA相互作用をマッピングするために使用されている。我々は最近、ChEC-seqとして高スループット配列決定法を用いて、このような方法の一つであるクロマチン内在性切断（ChEC）を組み合わせた。 ChEC-seqは、クロマチンアソーク生存細胞中のカルシウムの存在下で標的とされたDNA切断を生成するために、ミクロコッカルヌクレアーゼ（MNase）に対する関心対象のタンパク質を同定する。 ChEC-seqは免疫沈降に基づいていないため、架橋、超音波処理、クロマチン可溶化、抗体品質に関する潜在的な懸念を回避し、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えた高分解能マッピングを回避します。 ChEC-seqは、ChIP-seqの知見を検証し、ゲノム規制への新たな洞察を発見するための独立した手段を提供し、ChIPに強力に対応するものと考えています。

成功したChEC実験の場合、アガロースゲル電気泳動によるDNA分析は、ゲノムDNAの塗抹および最終的な完全消化によって示されるように、DNA断片化の時間依存的な増加を明らかにする。場合によっては、従来のMNase消化で見られるのと同様のバンドのはしごが、消化の延長の後に観察される。これは、ヌクレオソーム枯渇領域（NDR）に結合する一般的な調節因子であるReb1（ 図2 ）のChEC分析の場合である。本発明者らは、GRFの場合、伸長消化が急速に切断された結合部位でのシグナル消失をもたらすことを見出した1 。理想的には、Reb1 ChECの30秒および1分の時点など、高分子量スメアを示すゲノムDNAバンドのサイズが減少したサンプルは、シグナルの時間依存的損失を避けるための配列決定に使用されます。 <p class="jove_content" fo:keep-togetRebec1 ChEC-seq実験からのフラグメント末端の可視化は、添加されたカルシウムを含ま...

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

本手順の全体的な目的は、ホルムアルデヒドによる架橋、クロマチンの可溶化、または抗体を必要とせずに、高解像度かつ低バックグラウンドでin situのゲノムワイドなタンパク質-DNA相互作用マップを生成することです。この手法は、さまざまな調節因子が遺伝子調節領域に対してクロマチンのどこに結合しているかなど、転写分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、バックグラウンドを極めて低く抑えた高解像度のゲノム結合マップを提供でき、標準的なChEC-seqプロトコルに伴う制限を回避できる点にあります。手順の実演は、Fred Hutchinson Cancer Research Centerの同僚であるSebastian Grunbergが行います。実験前日の午後または夕方に、実験に使用する菌株の前培養を開始してください。MNaseタグ付き因子を持つ当該菌株の単一コロニーを、3 mLのペプトンデキストロースまたは適切な選択培地に接種します。この培養物を30 °Cの振盪インキュベーターで一晩培養します。翌朝、一晩培養したものを50 mLの培地で希釈し、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）を0.2から0.3に調整します。その後、光学密度が0.5から0.7に達するまで、振盪インキュベーターで培養します。添加剤を含むBuffer Aを必要量調製し、手順中は室温で保持します。サンプル回収用のマイクロ遠心チューブを準備します。解析する各新規因子について、カルシウム添加前のサンプルを回収し、さらにカルシウム添加後30秒、1分、2.5分、5分、および10分後のサンプルを回収します。各チューブにストップ溶液を90 µL、10% SDSを10 µL加えます。培養液の600 nmにおける吸光度が0.5〜0.7に達したら、培養液を50 mLコニカルチューブに移し、室温で1,500 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を1 mLのBuffer Aに十分に再懸濁させ、再懸濁した細胞をマイクロ遠心チューブに移します。再懸濁した細胞を、室温にて1,500 ×gで30秒間、マイクロ遠心機で遠心分離してペレット化します。上清を吸引し、ピペッティングにより1 mLのバッファーAで細胞を十分に再懸濁します。再懸濁した細胞を、室温にて1,500 ×gで30秒間、遠心分離してペレット化します。上清を除去し、細胞を1 mLのBuffer Aに再懸濁して、再度遠心分離します。上清を除去した後、細胞を570 µLのBuffer Aに十分に再懸濁します。細胞の透過処理を促進するために2% digitoninを30 µL加え、転倒混和します。30 °Cのヒートブロックで5分間、細胞を透過処理します。ピペットで反応液を吸い上げ、出しを繰り返し、細胞を均一に分散させます。陰性対照として、透過処理した細胞の100 microliter分注液を、停止溶液とSDSを含むマイクロ遠心チューブに移し、ボルテックスで短時間混合します。タイムコースを開始する前に、初期のタイムポイントを効率的に回収できるよう、停止溶液のチューブ、ピペット、ピペットチップ、およびタイマーをヒートブロックの横に配置しておくことが極めて重要です。タイムコースを開始するために、1.1 µLの1 M塩化カルシウムを透過化細胞に加えてMNaseを活性化し、数回素早く反転させて混合します。混合した反応液を直ちに30 °Cに戻し、タイマーを開始します。回収する各タイムポイントにおいて、ピペットで反応液を吸い上げ、出し、細胞が均一に分散するようにし、その後100 µLの透過化細胞分注液を、停止溶液とSDSを含むマイクロ遠心チューブに移します。軽くボルテックスして混合します。すべてのタイムポイントの回収が完了したら、各サンプルに20 mg/mLのproteinase Kを4 µL加えます。軽くボルテックスして混合し、55 °Cで30分間インキュベートします。各サンプルに200 µLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加え、激しくボルテックスして混ぜた後、室温で最大速度で5分間遠心分離します。水層を新しいチューブに移します。30 µgのグリコーゲンと500 mLの100% ethanolを加えます。激しくボルテックスして混合し、ドライアイス上で10分間、または溶液が粘稠になるまで沈殿させます。最大速度、4°Cで10分間遠心分離し、沈殿したDNAをペレット化します。上清を除去し、各ペレットを室温の70%エタノール 1 mLで洗浄します。エタノールをデカントし、チューブを逆さにし、ペーパータオル上で軽く叩いて残液を取り除きます。ベンチトップ遠心機でサンプルを短時間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットで残存するエタノールを除去します。室温で5分間、ペレットを風乾させます。DNAペレットを乾燥させている間に、乾燥後のペレット再懸濁に使用するTris緩衝液とRNase Aのマスターミックスを作成し、ボルテックスで混合します。乾燥した各DNAペレットにRNase A溶液を30 µL加え、ボルテックスで混合した後、37 °Cで20分間インキュベートしてRNAを消化します。20分後、6X DNAローディングダイを1 µLと各サンプルを5 µLずつ混合し、1.5%アガロースゲルを用いて120 Vで40分間電気泳動を行います。各サンプルに、ポリエチレングリコール溶液中のSPRIビーズを75 µL加えて、サイズセレクションの手順を開始します。ピペッティングを10回繰り返し、ビーズとDNA混合液を混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。SPRIビーズのインキュベート中に、各サンプル用に10 mM Tris pH 8.0を96 µLと5 M 塩化ナトリウムを4 µL含むマイクロ遠心チューブを準備します。ビーズとDNAの混合物が入ったチューブをマグネットラックに2分間置き、チューブの壁面にビーズを集めます。その後、各上清をTrisおよび塩化ナトリウムを含む新しいチューブに移します。各サンプルに200 µLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加え、ボルテックスミキサーで混合し、室温で最大速度で5分間遠心分離します。各水相を新しいチューブに回収し、30 µgのグリコーゲンと500 µLの100% ethanolを加えます。ドライアイス上で10分間、または溶液が粘性を持つまでDNAを沈殿させます。最大回転数、4°Cで10分間遠心分離し、沈殿したDNAをペレット化します。上清を捨て、各ペレットを1 mLの70%エタノールで洗浄します。エタノールをデカンテーションで除き、チューブを倒してペーパータオル上で軽く叩くことで残液を取り除きます。ベンチトップ遠心機でサンプルを短時間遠心分離し、ピペットを用いて残存するエタノールを除去します。この際、ペレットを乱さないように注意してください。ペレットを室温で5分間風乾させます。各乾燥ペレットを25 µLのTris pH 8に再懸濁します。高感度アッセイを用いて各サンプルの濃度を測定します。ヌクレオソーム欠乏領域に結合する汎用的調節因子であるReb1のクロマチン内在性切断解析から得られたDNAのアガロースゲル電気泳動では、スメアリングによって示されるように、時間経過に伴うカルシウム依存的なDNA断片化の増加と、最終的なゲノムDNAの完全な消化が認められます。Reb1クロマチン内在性切断シーケンシング実験におけるフラグメント末端の可視化により、30秒間のカルシウム処理後の遊離MNase株に由来するバックグラウンドに対して、Reb1が強力に濃縮されていることが明らかになりました。同様に、カルシウム添加1分後にMed8プロモーターによって駆動された、メディエーターサブユニットMed8とMNaseの融合タンパク質による大幅なDNA切断が観察されましたが、遊離MNaseでは観察されませんでした。Reb1クロマチン内在性切断シーケンシングのデータをクロマチン免疫沈降およびハイスループットシーケンシングのデータと比較するため、定量的手法により決定された1,992個のReb1ピークをモチーフ中心に揃え、モチーフ中心点周辺の100塩基対のウィンドウ内における各塩基位置の平均フラグメント末端数を算出しました。著しい非対称性と切断が観察され、Reb1-MNaseによって放出された断片末端の大部分がモチーフの上流側にマッピングされました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1営業日で完了させることができます。本手順を試みる際は、正確なピペッティングとハンドリング時間を確保するため、並行して分析するサンプル数を制限することが重要です。この手法の開発により、転写分野の研究者は、DNA結合能を持たないメガダルトンサイズのタンパク質複合体のゲノム上の結合部位を、出芽酵母において初めて明確に特性評価することが可能となりました。このビデオを視聴することで、出芽酵母ゲノムにおけるタンパク質結合部位のゲノムワイドマッピングを行うためのChEC-Seq法の実施方法について、十分に理解できるはずです。

genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-with-chec-seq

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。...

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

このビデオでは、標的DNAと相互作用する複数のタンパク質を検出する改変酵母ワンハイブリッドアッセイを実演します。形質転換酵母細胞は、レポーター遺伝子の上流に標的DNA配列を含んでいます。さらに、転写因子タンパク質を発現します。タンパク質が複合体を形成し、標的DNAに結合すると、レポーター遺伝子が発現し、酵素的に検出することができます。...

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ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。...

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タンパク質は互いに相互作用し、これらの相互作用が彼らの機能の大部分を決定します。タンパク質相互作用パートナーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼタンパク質フラグメント相補アッセイ(DHFR-PCA)に基づく酵母適応度アッセイを使用して、in...

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

この論文は、染色体外環状DNA（eccDNA）を精製するためのCircle-Seqと呼ばれる高感度な方法を紹介しています。この方法には、カラム精製、残存する直鎖状染色体DNAの除去、ローリングサークル増幅、ハイスループットシーケンシングが含まれます。Circle-Seqは、真核生物のeccDNAのゲノムスケールのスクリーニングや、ゲノムの不安定性やコピー数多型の研究に応用できます。...

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

酵母 2 ハイブリッド スクリーンのバッチ処理は、獲物の融合蛋白質の非常に複雑なセットを持つ複数の餌の蛋白質の相互作用のプロファイルの直接比較のためことができます。ここでは、我々...

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肯定的な酵母 2 ハイブリッド相互作用の可能性があります選択酵母集団のディープ シーケンスには、パートナーの相互作用の蛋白質についての情報の富が得られます。ここでは、特定のバイオインフォマティクス ツールとこのような画面からシーケンス...

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

シーケンシング(RH-seq)を介した相互異形性は、種間の形質の違いの遺伝的基礎をマッピングする強力な新しい方法である。ヘミジゴットのプールはトランスポゾン変異によって生成され、その適合性は、高いシーケンシングを使用して競争力のある成長を通じて追跡されます。得られたデータの分析は、形質の基礎となる遺伝子を特定します。...

ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。...

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

学ぶChEC-seq法によるSaccharomyces cerevisiaeのタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマッピング。マイクロコッカス核酸酵素融合タンパク質を用いて高解像度の結合マップを作成し、転写制御メカニズムを解明する。

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング

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