ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング Saccharomyces cerevisiae

この手順の全体的な目標は、ホルムアルデヒド架橋、クロマチン可溶化、または抗体を必要とせずに、高分解能で低バックグラウンドでタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドマップをin situで生成することです。この方法は、遺伝子調節領域に対してさまざまな調節因子がクロマチンとどこで関連しているかなど、転写分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、バックグラウンドが無視できる高解像度のゲノム結合マップを提供し、標準的なChEC-seqプロトコルに関連する制限を回避できることです。

この手順を実演するのは、フレッドハッチンソンがん研究センターの同僚であるセバスチャン・グランバーグです。実験前日の午後または夕方に、実験用菌株の予備培養を開始する。3ミリリットルの使用済みペプトンデキストロース、またはMNaseタグ付き因子を持つ菌株の単一コロニーを含む適切な選択培地を接種します。

この培養物を摂氏30度のシェーカーインキュベーターで一晩インキュベートします。翌朝、一晩培養したものを50ミリリットルの媒体から600ナノメートルの0.2〜0.3の光学密度に希釈します。培養物をシェーカーインキュベーターでインキュベートし、600ナノメートルの0.5〜0.7の光学密度に達するまで

必要な量のバッファーAと添加剤を調製し、処置中は室温に保ちます。サンプル収集用のマイクロチューブを準備します。分析した新しい因子ごとに、カルシウムを添加せずにサンプルを採取し、カルシウム添加の30秒後、1分後、2.5分後、5分後、および10分後に追加します。

各チューブに90マイクロリットルのストップ溶液と10マイクロリットルの10%SDSを追加します。培養物が0.5〜0.7の600ナノメートルで光学密度に達したとき、培養物を50ミリリットルの円錐管にデカントし、室温で1,500倍gで1分間遠心分離する。上清を取り除き、細胞を1ミリリットルのバッファーAに完全に再懸濁し、再懸濁した細胞をマイクロチューブに移します。

再懸濁した細胞をマイクロフュージで1,500倍gで室温で30秒間ペレット化します。上清を吸引し、ピペッティングで上下させて、細胞を1ミリリットルのバッファーAに再懸濁します。再懸濁した細胞を室温で30秒間、1,500倍gでペレット化する。

上清を取り除き、細胞を1ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、再度遠心分離します。上清を除去した後、細胞を570マイクロリットルのバッファーAに再懸濁し、細胞の透過化を促進するために2%ジギトニンを30マイクロリットル加え、反転させて混合します。細胞を摂氏30度のヒートブロックに5分間透過処理します。

反応を上下にピペットで動かして、細胞が均一に分布するようにします。ネガティブコントロールとして、透過処理した細胞の100マイクロリットルアリコートを停止溶液とSDSを含むマイクロチューブに移し、短時間ボルテックスして混合します。タイムコースを開始する前に、ストップ溶液のチューブ、ピペット、ピペットチップ、およびヒートブロックの隣にタイマーを用意して、初期のタイムポイントを効率的に収集できるようにすることが重要です。

タイムコースを開始するには、透過処理した細胞に1.1マイクロリットルの1モル塩化カルシウムを加えてMNaseを活性化し、数回すばやく反転させて混合します。すぐに混合反応を摂氏30度に戻し、タイマーを開始します。採取する各時点で、細胞が均一に分布するように反応を上下にピペットで移動し、100マイクロリットルの透過処理細胞を停止溶液とSDSが入ったマイクロチューブに移します。

渦を少し混ぜます。すべてのタイムポイントを収集したら、各サンプルに20ミリグラム/ミリグラムのプロテイナーゼKを4マイクロリットル追加します。渦巻きにして短時間混合し、摂氏55度で30分間インキュベートします。

各サンプルに200マイクロリットルのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加え、激しくボルテックスして混合し、室温で5分間最高速度で遠心分離します。水相を新しいチューブに移します。30マイクログラムのグリコーゲンと500ミリリットルの100%エタノールを加えます。

激しく渦を巻いて混合し、ドライアイス上に10分間、または溶液が粘性になるまで沈殿させます。沈殿したDNAを最高速度で遠心分離し、摂氏4度で10分間ペレット化します。上清をデカントし、各ペレットを1ミリリットルの室温70%エタノールで洗浄します。

エタノールをデカントし、残りを反転させ、チューブをペーパータオルで軽くたたいて取り除きます。ベンチトップ遠心分離機を使用してサンプルを短時間回転させ、次にピペットを使用して残留エタノールを除去し、ペレットを乱さないように注意してください。ペレットを室温で5分間風乾します。

DNAペレットが乾燥している間に、トリスバッファーとRNase Aのマスターミックスを作り、乾燥したペレットを再懸濁し、ボルテックスして混合します。各乾燥DNAペレットに30マイクロリットルのRNアーゼA溶液を加え、ボルテックスで混合し、摂氏37度で20分間インキュベートしてRNaを消化します。20分後、1マイクロリットルの6X DNAローディング色素を各サンプル5マイクロリットルと混合し、1.5%アガロースゲル上で120ボルトで40分間泳動します。

サイズ選択手順を開始するには、各サンプルにポリエチレングリコール溶液中の75マイクロリットルのSPRIビーズを加えます。ピペットで10回上下させてビーズとDNA混合物を混合し、室温で5分間インキュベートします。SPRIビーズのインキュベーション中に、各サンプルに96マイクロリットルの10ミリモルトリスpH8.0と4マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムを含むマイクロチューブを調製します。

ビーズとDNA混合物が入ったチューブを磁気ラックに2分間入れて、チューブの側面にビーズを集めてから、各上清をトリスと塩化ナトリウムを含む新しいチューブに移します。各サンプルに200マイクロリットルのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加え、ボルテックスで混合し、室温で最高速度で5分間遠心分離します。各水相を新しいチューブに移し、30マイクログラムのグリコーゲンと500マイクロリットルの100%エタノールを加えます。

DNAをドライアイス上に10分間、または溶液が粘性になるまで沈殿させます。沈殿したDNAを最高速度および摂氏4度で10分間遠心分離することによりペレット化します。上清をデカントし、各ペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗浄します。

エタノールをデカントし、チューブを反転させてペーパータオルで軽くたたいて残りを取り除きます。ベンチトップ遠心分離機を使用してサンプルを短時間回転させ、ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットを使用して残留エタノールを除去します。ペレットを室温で5分間風乾します。

各乾燥ペレットを25マイクロリットルのトリスpH8に再懸濁します。.高感度アッセイを使用して各サンプルの濃度を決定します。ヌクレオソーム枯渇領域に結合する一般的な調節因子であるReb1のクロマチン内因性切断解析によるDNAのアガロースゲル電気泳動は、スミアリングによって示されるように、DNA断片化の経時的なカルシウム依存性の増加、およびゲノムDNAの最終的な完全な消化を明らかにします。

Reb1クロマチン内在性切断シーケンシング実験によるフラグメント末端の可視化により、カルシウム処理の30秒後には、遊離MNase株に由来するReb1のバックグラウンド上での強固な濃縮が明らかになりました。同様に、メディエーターサブユニットMed8とMNaseとの融合により、かなりのDNA切断が観察されましたが、カルシウム添加の1分後にMed8プロモーターによって駆動される遊離MNaseは観察されませんでした。Reb1クロマチン内在性切断シーケンシングデータと比較するために、有機的方法によって決定された1, 992のReb1ピークをモチーフ中心にし、モチーフ中点の周りの100塩基対ウィンドウにおける各塩基位置における平均フラグメントエンドカウントを決定しました。

顕著な非対称性と切断が観察され、Reb1-MNase放出フラグメント末端の大部分がモチーフの上流側にマッピングされました。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、丸1営業日で実行できます。この手順を試みるときは、正確なピペッティングと処理時間を確保するために、並行してアッセイするサンプルの数を制限することを忘れないでください。

その開発後、この技術は、転写分野の研究者が初めて、酵母の非DNA結合メガダルトンサイズのタンパク質複合体のゲノム関連を明確に特徴付ける道を開きました。このビデオを見れば、出芽酵母ゲノムのタンパク質結合部位のゲノムワイドマッピングのためのChEC-Seq法の実行方法について理解できるはずです。