新生児低酸素性虚血性脳損傷のマウス モデルにおける神経行動学的評価

新生児低酸素虚血性脳損傷手術およびそれに続く認知・運動機能テストの全体的な目的は、このような損傷および関連する脳損傷を研究するためのマウスモデルを構築することです。この手法により、新生児低酸素虚血性脳損傷が運動機能や認知機能にどのような影響を与えるかといった、重要な疑問に対する答えを得ることができます。この技術の主な利点は、広く知られており、一般的に用いられていることです。

これは、脳性麻痺および新生児脳卒中の前臨床モデルでもあります。一般的に、この手法に慣れていない方は、右側の単一頸動脈の特定が困難であるため、苦労することがあります。私とともに、当研究室の大学院生であるYoon-Kyum Shinがこの手順を実演します。

少なくとも5匹のP7マウス幼仔を麻酔にかけた後、幼仔を解剖顕微鏡の下に腹側を上にして配置します。次に、頸部をアルコールで清浄します。手術を開始するために、はさみを使用して頸部に0.7 mmの切開を加えます。

次に、ピンセットを用いて脂肪組織を慎重に除去し、右総頸動脈を露出させます。続いて、5-0 縫合糸を用いて右総頸動脈を結紮します。その後、頸部の切開部を 5-0 ナイロンで縫合し、切開部を滅菌します。

その後、蓋を開けた状態で37°Cの低酸素チャンバー内に幼マウスを入れ、約1時間回復させます。手術操作を行った別のマウスを低酸素チャンバーに入れて回復させます。すべての幼マウスが完全に覚醒したら、チャンバーの蓋を閉め、ガス濃度を下げて低酸素状態を確立します。

90分間の低酸素状態の後、脳損傷させた仔マウスをケージに戻します。1週間後、以前と同様に仔マウスの手術準備を行い、損傷の根拠を確認します。頭皮を切開し、右半球の後外側領域にある脳病変を特定します。

半透明の頭蓋骨を通して、皮質損傷および海馬損傷の証拠があるかを確認します。これにより、仔鼠を損傷群または非損傷対照群に分類します。確認後、縫合糸で頭皮を閉じ、切開部を滅菌します。

マウスが6週齢になったとき、嫌悪刺激の学習と回避に基づいた記憶力の評価を行います。このタスクには、市販の2室式ステップスルー受動回避装置を使用します。まず、マウスをボックスの明室に30秒間入れます。

次に、コンパートメント間の扉を開き、動物が暗いコンパートメントに入るまでの潜時を記録します。タスクの遂行には最大300秒まで時間を設けてください。マウスの4肢すべてが完全に暗いコンパートメントに入ったら、扉を閉めます。

次に、1/2 mAの電気足ショックを2秒間与え、マウスをケージに戻します。24時間後、テストを繰り返します。今回は、マウスが暗室に移動するまで300秒間十分に時間を設け、ショックは与えないでください。

6週齢のマウスに対してラダーウォーキングテストを行い、定性的および定量的な分析の両方を用いて、運動機能のわずかな障害を識別します。まず、ラダー装置を設置し、次に装置上のマウスの肢の動きを記録するためのビデオカメラを設置します。次に、マウスをスタートパネルに置き、ビデオカメラで録画を開始します。

ビデオで脚部がはっきりとフォーカスされていることを確認してください。マウスがラダー装置の最後のパネルに到達したら、録画を停止します。その後、マウスをスタートパネルまで戻し、装置を横切る様子を再度録画してください。

各試験日に、マウス1匹につき合計4回ずつこれを行います。後でビデオを解析する際、ビデオを1/10の速度で再生しながら、各肢で発生したスリップの回数を手動でカウントします。肢が棒の間で滑った場合をスリップと定義します。

マウスが6週齢になったら、握力を測定します。パネルに固定された直径2 mmの三角ワイヤーに、プッシュ/プル型ストレインゲージを取り付けて使用します。マウスの尾を保持してパネル上に配置してください。

次に、マウスの前肢が金属ワイヤーに届くようにします。マウスがワイヤーを掴んだらすぐに、手を離すまで尾をそっと引っ張ります。装置は、ワイヤーに加わった最大筋力をグラム単位で記録します。

マウスを休ませる前に、この試験を5回繰り返します。握力試験中には、正確な動作が顕著に現れます。マウスを少なくとも1分間休ませて筋疲労を軽減させる前に、5回の試行を通じてそれらの動作を確認してください。

マウスを少なくとも1分間休ませた後、5回の一連の試行を再度繰り返します。次に、さらにマウスを休ませ、その試験日の最後の一連の試行を行います。得られたデータから、片方の前肢または両方の前肢のいずれかについて、上位3つのスコアの平均を分析に使用します。

14週齢の低酸素虚血損傷動物から脳を採取した後、形態学的に評価し、皮質損傷なし、軽度損傷、または重度損傷に分類しました。同じ動物を1週間前にMRIでスキャンしており、そこでも非常に顕著な結果が得られていました。形態学的に正常であった脳でさえ、海馬に軽度の損傷が認められました。

生後6週（受傷後5週）において、マウスを用いてさまざまな行動課題による評価を行いました。低酸素虚血性脳損傷を受けたマウスは、24時間受動回避課題において認知機能の低下を示しました。また、右半球のみが損傷していたため、マウスには片麻痺的な運動機能障害が見られました。

これは、各前肢における梯子の横桟での滑り発生率の差によって明らかになりました。さらに、握力は脳の運動皮質が関与するため、正常群と皮質損傷群の間で握力に差が見られました。正常対照群とカテゴリー的に非損傷のマウスとの間には差は認められませんでしたが、損傷マウスでは明らかに機能低下が認められました。

このビデオを視聴することで、新生子マウスの低酸素虚血モデルを作成するための右総頸動脈の一側結紮法と、その後の行動解析の手順について十分に理解できるはずです。重要な点として、損傷から7日後に皮質脳に目に見える損傷が認められない場合でも、MRIでは海馬の損傷が検出される可能性があることに注意してください。また、幼若マウスを慎重に扱い、手術を可能な限り迅速に完了させることが重要です。

幼獣の皮膚は非常に弱く薄いため、細心の注意を払ってください。