Name: 非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学ぶ非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるラベルフリー高コントラスト単一細胞イメージング法。マイクロ流体中で毎秒10万個の細胞を高速撮影し、標準フローサイトメトリーでは不可能な複雑な形態学的解析を実現します。

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私たちのためにMCF-7を準備してくれたP. Yeung氏に感謝します。この作業は、香港特別行政区の研究助成審議会（プロジェクト番号17259316,17207715,17207714,17205215、およびHKU 720112E）、イノベーションおよび技術支援プログラム（ITS / 090/14 ）、およびHKUの大学開発基金。

<ol><li>Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLau%2C+AKS+%22Imaging+Flow+Cytometry%3A+Methods+and+Protocols%22">Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols</a>. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).</li>
<li>Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-encoded+amplified+imaging+for+real-time+observation+of+fast+dynamic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena.</a> Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).</li>
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<li>Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+time-stretch+imaging+-+an+emerging+tool+for+high-throughput+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry.</a> Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).</li>
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<li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li>
<li>Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://journals.aps.org/pra/abstract/10.1103/PhysRevA.80.043821">Theory of amplified dispersive Fourier transformation.</a> Physical Review A. 80 (4), 043821(2009).</li>
<li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li>
<li>Lai, Q. T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+time-stretch+imaging+flow+cytometry+for+multi-class+classification+of+phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton.</a> Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).</li>
<li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Learning+in+Label-free+Cell+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Deep Learning in Label-free Cell Classification.</a> Sci Rep. 6, 21471(2016).</li>
<li>Fard, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+serial+time-encoded+amplified+microscopy+for+high-speed+contrast-enhanced+imaging+of+transparent+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media.</a> Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).</li>
<li>Lau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+time-stretch+microscopy+for+ultrafast+quantitative+cellular+and+tissue+imaging+at+1+mum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum.</a> J Biomed Opt. 19 (7), 76001(2014).</li>
<li>Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-throughput+cell+screening+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Label-free high-throughput cell screening in flow.</a> Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).</li>
<li>Wong, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric-detection+time-stretch+optical+microscopy+%28ATOM%29+for+ultrafast+high-contrast+cellular+imaging+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow.</a> Sci Rep. 4, 3656(2014).</li>
<li>Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1364032109001646">Microalgae for biodiesel production and other applications: A review.</a> Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).</li>
<li>Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+biodiversity+patterns+of+marine+phytoplankton+and+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton.</a> Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6722896/">Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breathing+laser+as+an+inertia-free+swept+source+for+high-quality+ultrafast+optical+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging.</a> Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+measurements+of+optical+spectral+coherence+by+single-shot+time-stretch+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry.</a> Sci Rep. 6, 27937(2016).</li>
<li>Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+serial+time-encoded+amplified+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Performance of serial time-encoded amplified microscope.</a> Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+circulating+tumour+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+counting+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Beyond counting tumor cells.</a> Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Sci Transl Med. 5 (179), (2013).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Scientific Reports. 3, 1259(2013).</li>
<li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).</li>
<li>Krebs, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumour+cells-biology+and+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.eee.hku.hk/optima/pub/journal/1701_LSA.pdf">Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths.</a> Light Sci Appl. , (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

ATOMシステムのセットアップ中に特別な注意が必要な技術的な詳細がいくつかあります。第1に、非対称/斜めのスペクトル符号化された照明が、吸収コントラストにおける残留位相勾配成分（ すなわち、シャドーイング効果）を導入し、ATOMにおける位相勾配コントラストの増強に影響を及ぼす可能性があることに留意することが重要である。したがって、斜め照明のこの効果は最小限に抑えられるべきである。第2に、2つのレプリカを含む時間多重化または時間インターリーブ方式が画像化速度に大きな妥協をもたらさないことが強調されるべきである（ すなわち、 &gt; MHzのライン走査速度が依然として維持され得る） 2つのビームレプリカのうちの1つは、1つのライン走査期間を超えない。第3に、分散ファイバおよび増​​幅器の統合モジュールの最適な構成は、利用可能な増幅器の仕様としての目標利得に依存する。光増幅は本質であるGVD22に関連する光損失に対処するために、時間ストレッチのプロセスにかけられる。原理的には、ファイバベースの時間ストレッチプロセス（ 図1b ）と互換性があるよ...

光学イメージングは​​、多くの細胞/亜細胞成分の詳細な空間分布を（ほとんど）非侵襲的に視覚化するための強力なツールおよび細胞ベースのアッセイを提示し、細胞の形態学的、生物物理学的および生体分子の多数の特徴を明らかにする。しかしながら、単一の細胞から高含量の情報を抽出するこの能力は、莫大かつ異種の細胞集団を調査しなければならない場合、一般に損なわれている。これは、測定スループットとコンテンツとの間の細胞ベースアッセイにおける共通のトレードオフを示す。注目すべき例は、フローサイトメトリーにイメージング能力を加えることにより、従来の非イメージングフローサイトメーターに比べて少なくとも1-2桁のスループットのダウンスケーリングがもたらされたことである。それは、標準的なフローサイトメーター1では不可能である複雑な形態学的な単一細胞分析を提供することができるが、イメージングフローサイトメトリーは、一般に、高い統計的信頼性で細胞の異種性を念入りにする。これは、生物学における新たな発見や疾患の病因の理解を得るために必要です。レーザービーム走査（ガルバノメーターミラーなど）、および/または画像センサー（ 例えば、電荷結合素子（CCD）および相補型金属光検出器）によって課される固有の速度限界には、酸化物半導体（CMOS））である。走査速度は、走査ミラーの機械的な慣性によって本質的に制限されるが、CCDまたはCMOSのフレームレートは、撮像速度と感度との間の基本的なトレードオフによって制限される（ すなわち、フレームレートを増加させると、 、 およびその逆）。 全光学的、超高速画像符号化メカニズムに基づいて、光学的時間ストレッチ撮像は、ハイスループット画像フローサイトメトリーのための魅力的なプラットフォームとして実証されている従来の画像センサや機械的なレーザ走査を必要とせずに、タイムストレッチイメージングの動作原理の詳細な説明は、参考文献4,5,6,7に見出すことができる。簡単に説明すると、2つの交換可能なマッピングステップからなる：（i）画像化された標本の空間座標が光パルスビーム8,9のスペクトルにわたって異なる波長にマッピングされるスペクトル符号化（波長空間マッピング）個々のレーザパルスの波長成分が群速度分散（GVD）を経て時間的（波長掃引）波形（ 図1 ）に変換（伸張）される分散フーリエ変換（波長 - 時間マッピング） 9 。重要な時間ストレッチイメージングの特徴は光増幅であり、超高速光検出とGVD損失による感度の低下との戦いにおいて重要な役割を果たし、光検出器のノイズ9によって汚染されることなくイメージ信号対雑音比（SNR）を向上させる。各レーザーパルスは、細胞の一方向の流れに直交する画像化された標本のラインスキャンをコード化するので、有効なライン走査速度は、典型的には10MHzを超えるレーザー反復速度によって決定される。この超高速操作により、10,000〜100,000細胞/秒（ すなわち、従来のイメージングフローサイトメトリーよりも10〜100倍高い）のスループットで、ぼやけのない単一細胞画像捕捉が可能になる。結果として、時間ストレッチイメージングは​​、特に、未知の異種性または珍しい/異常な細胞をかなりの集団（数千〜数百万個）で同定する必要がある場合に、ハイスループット、単一細胞、セル<html>珍しいがん細胞スクリーニング10または微細藻類分類11など）が挙げられる 。 時間ストレッチイメージングは​​、主に、明視野（BF）イメージキャプチャに依存し、そこからイメージコントラストが細胞2,3,10,10,11からの光散乱および吸収によって生成される。このようなラベルフリーの単一細胞イメージング能力は、細胞毒性および光退色などの蛍光標識に関連する有害な影響を回避することができ、さらに、細胞および細胞内テクスチャおよび形態に基づく単一細胞分析に有益な情報を提供する。これらのラベルフリーパラメータは、特に莫大な細胞集団が利用可能な場合に、細胞の深部画像分類に有効であることが証明されている11 。&quot;xref&quot;&gt; 12。しかしながら、多くの場合、BFイメージングは​​、標識を含まない透明細胞の詳細な形態を明らかにするために十分なコントラストを提供することができない。超高速フレームレート13,14,15で撮像コントラストを向上させるために、異なるラベルフリー位相差、時間ストレッチ撮像モダリティが開発されている。これらの技術の中でも、Schlieren撮影と同様の概念に基づく位相勾配（微分干渉コントラスト（DIC）のような）コントラストを明らかにするために、非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡法（ATOM）超高マイクロ流体スピード（最大10m / s）での単一細胞の高コントラスト造影。この効果は、画像符号化されたビーム経路を部分的に遮断するか、または光検出の前にビームを傾斜させることによって、斜めの検出または照明によって容易に生成することができる。 ATOMのもう一つの利点は、逆の方向に沿って2つの位相勾配コントラストを同時に取得する能力。強度減算および2つの反対のコントラスト画像の合計は、同じラインスキャンからのそれぞれ異なる位相勾配コントラストおよび吸収コントラストをもたらす。この作業では、光学セットアップの確立、サンプルの準備、データの取得と可視化を含む、ATOMの実装を記述する詳細なプロトコルを提示します。具体的には、この研究は、ヒト血液細胞、癌細胞、および植物プランクトン（微細藻類）の単一細胞イメージングを用いたATOM操作を実証する。これは、生物医学分野だけでなく、海洋およびバイオ燃料の研究でも、イメージングフローサイトメトリーへのATOMの適用性を強調している17,18 。

<table><tbody><tr><td>ニコンプラン蛍石生理学対物レンズ 40倍</td><td>ニコン</td><td>MRF07420</td><td>対物レンズ (Obj2)</td></tr><tr><td>オリンパスプラン蛍石対物レンズ、0.75 NA、0.51 mm WD、40倍</td>オ<td>リンパス</td><td>RMS40X-PF</td><td>対物レンズ (Obj1)</td></tr><tr><td>N-BK7 平凸レンズ</td><td>Thorlabs</td><td>LA1145-C</td><td>スペクトルシャワー</td></tr><tr><td>FC/APC ファイバーコリメーションパッケージ</td><td>Thorlabs</td><td>F220APC-1064</td><td>レーザーパルスの出力・収集用</td></tr><tr><td>ペリクルビームスプリッター</td><td>ソーラブ</td><td>スBP145B3</td><td>ビームレプリカ作成用</td></tr><tr><td>保護シルバーミラー</td><td>ソーラブ</td>ス <td>PF10-03-P01</td><td>光反射用</td></tr><tr><td>800-1650nm 12GHzシングルモード DC結合型NIRフォトレシーバー</td><td>ニューポート</td><td>1544-B</td><td>光を電気信号に変換するため</td></tr><tr><td>インフィニウム 高性能オシロスコープ</td><td>アジレント</td><td>DSOX91604A</td><td>光変換された電気信号を保存するために</td></tr><tr><td>HI1060 光ファイバー</td><td>コーニング</td><td>HI1060</td><td>タイムストレッチ用光ファイバー</td></tr><tr><td>イッテルビウムドープファイバー増幅器</td><td>Keopsys</td><td>KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA</td><td>光インライン増幅器</td></tr><tr><td>ホログラフィックグレーティング</td><td>ワサッチフォトニクス</td><td>020305-6</td><td>グレーティング</td></tr><tr><td>注入/引き出しシリンジポンプ</td><td>ハーバード・イスラーム</td><td>PHD 2000</td><td>マイクロ流体チャネルにサンプルをロードするためのシリンジポンプ</td></tr></tbody></table>

非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（atom）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

フローサイトメトリーの高度な開発において、多次元データ分析、したがってより高い信頼性の統計結果を可能にする測定可能なパラメータの数をスケーリングすることが、主な傾向であった。注目すべきことに、高解像度イメージング能力を加えることにより、細胞/細胞間構造の複雑な形態学的分析が可能になる。これは標準的なフローサイトメーターでは不可能です。しかし、それは細胞機能の知識を進歩させる上で貴重であり、生命科学の研究、臨床診断、環境モニタリングに役立ちます。フローサイトメトリーへのイメージング能力の組み込みは、主にカメラ技術における速度および感度の制限によるアッセイスループットの低下をもたらす。イメージ品質を維持しながらイメージングフローサイトメトリーに直面するこの速度またはスループットの課題を克服するために、非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡法（ATOM）が、高コントラストの単一細胞イメージを可能にすることが実証されている100,000細胞/秒という高い画像処理スループットで、細胞内分解能を有する。 ATOMは、超高速広帯域レーザパルスの使用による全光学画像の符号化および検索に依存する従来の時間ストレッチ撮像のイメージングコンセプトに基づいて、非標識/非染色細胞の画像コントラストを向上させることによって画像性能をさらに進歩させる。これは、単一ショット広帯域パルスにスペクトル的に符号化されたセルの位相勾配情報にアクセスすることによって達成される。したがって、ATOMは、細胞型、状態、および機能さえ示す単一細胞形態およびテクスチャ情報のハイスループット測定において特に有利である。最終的に、これは細胞の生物物理学的表現型解析のための強力なイメージングフローサイトメトリープラットフォームとなり、現在の最先端の生化学マーカーベースの細胞アッセイを補完することができます。この作業では、ATOMシステムのキーモジュールを確立するためのプロトコルについて説明します（光フロントエンドからデータpロゼイングおよび可視化バックエンド）、ならびにヒト細胞および微細藻類を例として使用して、ATOMに基づくフローサイトメトリーのイメージングのワークフローを提供する。

<html>この研究では、哺乳類細胞（ヒト末梢血単核細胞（PBMC）および乳癌細胞（MCF-7））および植物プランクトン（ScenedesmusおよびChlamydomonas）を有するATOMによる2つの単一細胞イメージング実証が示されている。最初の実験は、血液中の循環腫瘍細胞（CTC）の検出、列挙、および特徴付けのための液体生検への関心の高まりによって動機付けられた23 。原発性腫瘍部位から血流に拡散したCTCを測定する能力は、転移性癌の進行を検査することを可能にする24,25 。しかし、CTC分析には次のような課題があります。（i）CTC数は、全血中の血球の超過量よりも大幅に少なくなります。 CTCを同定および回収する現在の方法は、大部分が細胞濃縮および分離工程を含む<html> class = &quot;xref&quot;&gt; 26,27,28。しかし、血液細胞の混入するバックグラウンドおよび/または濃縮されたCTCの生存率は、その後の分子分析（ 例えば...

このプロトコールは、超高速マイクロ流体流における単一細胞イメージングのための非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡検査システムの実施およびイメージングフローサイトメトリーにおけるその応用を記載する。

非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

このプロトコルの全体的な目的は、超高速マイクロ流体フローにおけるラベルフリーの高コントラスト単一細胞イメージングのために、非対称検出タイムストレッチ光学顕微鏡（ATOM）システムを構築し、運用することです。ATOMの主な利点は、最大で数十MHzのラインスキャンレートによる超高速な画像キャプチャが可能であると同時に、ラベル未付加細胞の画像コントラストを向上させられる点にあります。ATOMを用いることで、標準的なフローサイトメトリーでは不可能な、秒間最大100,000個の細胞に対する、中心を合わせない細胞ベースのアッセイを用いた細胞および細胞内構造の複雑な形態学的解析が可能になります。システムのセットアップを開始するには、ファイバーコリメータを使用して、広帯域のフェムト秒またはピコ秒近赤外パルスレーザーを、光増幅器に接続されたシングルモード分散光ファイバーに結合させます。レーザーで透過型回折格子を照射し、スペクトルシャワーを生成します。回折効率を最大化するため、回折格子をリトロー構成に近い角度に配置します。4f結像システムにおいて、望遠リレーレンズアセンブリを構成し、スペクトルシャワーをサンプルステージ下にある対物レンズの後焦点面に導きます。スペクトルシャワーが対物レンズの後方開口部を完全に満たすように調整してください。サンプルステージの上方には、後方開口部にプレーンミラーを備えた別の対物レンズを配置します。対物レンズを調整し、それぞれの焦点面が重なるようにします。スペクトルシャワーが像面を2回通過し、再びグレーティングへと戻る同一の経路を辿っていることを確認してください。マイクロ流体チップをサンプルプラットフォームに設置し、スペクトラムシャワーがマイクロ流体チャネルを横切るように調整します。グレーティングを通過した後の反射光をビームスプリッターで転向させます。さらに別のビームスプリッターを用いて、反射光を2つのビームに分離します。ファイバーコリメーターを使用して、これらのビームを長さの異なるシングルモードファイバーに結合させ、ビーム間に時間遅延を導入します。ファイバーカプラとフォトディテクタを介して、ファイバーをリアルタイムオシロスコープに接続します。光信号の信号対雑音比（SNR）が10 decibels以上になるまで、光増幅器のゲインを調整します。その後、ナイフエッジビームブロックを用いて、各戻り光の約半分を遮断します。各ファイバーで測定される光出力が、ブロック前の出力の約半分になるまでビームブロックを調整します。オシロスコープの帯域幅とサンプリングレートが、画像解像度に影響を与えない十分に高い値であることを確認してください。実験を開始するために、細胞サンプルをリン酸緩衝生理食塩水または天然水を用いて、1mLあたり10⁵から10⁶個の範囲に希釈します。次に、細胞溶液を10 mLのシリンジに充填します。シリンジをマイクロ流路の入口に接続します。マイクロ流路の出口を遠心チューブに向けます。シリンジをシリンジポンプに固定し、チャネル幅に応じて流速を適切に設定します。実験で保存するデータポイント数を決定します。その後、光学信号データを取得し、保存します。オシロスコープからデータをデジタル化し、コンピュータへ書き出します。データを2D画像に変換し、画像からパラメータライブラリを抽出します。画像とパラメータライブラリを可視化プログラムにインポートします。各軸に関心のあるパラメータを割り当て、散布図として表示するデータセットを選択します。プロット内の各グループに関連付けられた細胞画像を確認し、傾向を特定します。必要に応じて、マニュアルゲーティングを行うか、追加のデータセットを表示して詳細な解析を行います。ATOMを用いて、ヒト細胞および植物プランクトンの高コントラストな単一細胞画像を取得しました。植物プランクトンの画像では、液胞、ピレノイド、鞭毛などの特徴的な細胞構造が確認できます。細胞サイズや円形度などのパラメータをATOM画像から決定し、サイトメトリー解析のための細胞分類を行いました。分類結果は2D散布図として表示できます。ここでは、黄色のMCF7と赤色のPBMCについて、体積と円形度をプロットしました。MCF7では2つのクラスターが観察されました。個々のデータポイントに対応する高コントラスト画像を確認することで、低い方のクラスターは細胞断片およびデブリに対応していることが判明しました。習熟すれば、適切に行った場合にイメージングシステムのセットアップは2〜3時間で完了します。イメージングの手順は1時間以内に完了させることができます。レーザー光源の取り扱いおよびレーザービームの光軸調整を行う際は、特に目の安全に十分注意してください。これらの手順を実施する間は、保護メガネの着用などの予防措置を常に講じる必要があります。また、最適な結像品質を確保するため、イメージングシステムのセットアッププロセス全体を通じて、光学ビームの光軸調整を継続的に監視することを忘れないでください。この手法は、疾患プロセスにおける希少細胞や特異的な細胞の検出および定量化に知見をもたらすだけでなく、大規模で不均一な細胞集団内での細胞型の分類にも適用可能です。この手法は、画像品質を維持しながら、イメージングサイトメトリーのスループット制限を克服したい場合に特に有効です。このビデオを視聴することで、システムのセットアップからイメージング手順に至るまで、ATOMをどのように実施するかについて十分な理解を得ることができます。

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学ぶ非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるラベルフリー高コントラスト単一細胞イメージング法。マイクロ流体中で毎秒10万個の細胞を高速撮影し、標準フローサイトメトリーでは不可能な複雑な形態学的解析を実現します。

非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー

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