非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー

このプロトコルの全体的な目標は、超高速のマイクロ流体フローでのラベルフリーの高コントラストシングルセルイメージングのための非対称検出タイムストレッチ光学顕微鏡システムを準備し、使用することです。ATOMの主な利点は、最大数十メガヘルツのラインスキャンレートで超高速の画像キャプチャを可能にし、非標識細胞の画像コントラストを向上させることです。ATOMは、標準的なフローサイトメトリーでは不可能な、毎秒最大100, 000細胞の非中心化細胞ベースのアッセイにより、細胞および細胞内構造の複雑な形態学的解析を可能にします。

システムのセットアップを開始するには、ファイバーコリメータを使用して、広帯域フェムトまたはピコ秒近赤外線パルスレーザーを光増幅器に接続されたシングルモード分散光ファイバーに結合します。透過回折グレーディングをレーザーで照らして、スペクトルシャワーを生成します。グレーディングをリトロー構成に近づけて、回折効率を最大化します。

4fイメージングシステムで望遠リレーレンズアセンブリを構成して、スペクトルシャワーをサンプルプラットフォームの下の対物レンズの後焦点面に向けます。スペクトルシャワーが対物レンズの後部開口部を満たしていることを確認します。サンプルプラットフォームの上の背面開口部に平面鏡を備えた別の対物レンズを配置します。

対物レンズの焦点面が重なるまで調整します。スペクトルシャワーのダブルが像面を通過し、同じパスをたどってグレーディングに戻ることを確認します。マイクロ流体チップをサンプルプラットフォームに置き、スペクトルシャワーがマイクロ流体チャネルを横切って落ちることを確認します。

戻った光は、グレーディングを通過した後、ビームスプリッターでリダイレクトします。戻った光を別のビームスプリッターで2つのビームに分割します。ファイバーコリメータを使用して、ビームを異なる長さのシングルモードファイバに結合し、ビーム間に時間遅延を導入します。

ファイバーカプラーと光検出器を介してファイバーをリアルタイムオシロスコープに接続します。光信号の信号対雑音比が10デシベルを超えるまで、光増幅器のゲインを調整します。次に、戻された各ビームの約半分をナイフエッジビームブロックでブロックします。

各ファイバーで測定された光パワーがブロック前のパワーの約半分になるまで、ビームブロックを調整します。オシロスコープの帯域幅とサンプリングレートが、画像の解像度に影響を与えないほど高いことを確認します。実験を開始するには、細胞サンプルを1ミリリットルあたり10〜5〜10〜6に希釈し、リン酸緩衝生理食塩水または湧き水で

次に、細胞溶液を10ミリリットルのシリンジに入れます。シリンジをマイクロ流体チャネルインレットに接続します。マイクロ流体チャネル出口を遠心分離管に向けます。

シリンジをシリンジポンプに固定し、流路幅に対して適切な流量を設定します。実験用に保存するデータポイントの数を選択します。次に、光信号データを取得して保存します。

オシロスコープからデータをデジタル化してコンピュータにエクスポートします。データを 2D 画像に処理し、画像からパラメーターのライブラリを抽出します。パラメータライブラリの画像を視覚化プログラムにインポートします。

各軸に目的のパラメーターを割り当て、散布図として表示するデータセットを選択します。プロット内の各グループに関連付けられたセル画像を確認して、傾向を特定します。手動ゲーティングを使用するか、必要に応じて追加のデータセットを表示してさらに分析します。

ATOMを使用して、ヒト細胞と植物プランクトンの高コントラストシングルセル画像を取得しました。液胞、ピレノイド、べん毛などの特徴的な細胞構造は、植物プランクトン画像で見ることができます。細胞サイズや真円度などのパラメータは、サイトメトリー解析のために細胞を分類するために、ATOM画像から決定されました。

分類結果は、2D 散布図として表示できます。ここでは、MCF7 の体積と真円度をプロットしました (黄色で、PBMC を赤で示しています)。MCF7では2つのクラスターが観察されました。

個々のデータポイントに対応する高コントラスト画像を特定することにより、下部のクラスターが細胞の断片と破片に対応していることがわかりました。一度マスターすると、イメージングシステムは適切に実行されれば、2〜3時間でセットアップできます。イメージングの手順は1時間以内に完了します。

レーザー光源とレーザービームの位置合わせで作業する際には、目の安全に特別な注意を払うことを忘れないでください。これらの手順を実行するときは、常に安全ゴーグルを着用するなどの予防措置を講じる必要があります。この手順を試行する際は、イメージングシステムのセットアッププロセス全体を通じて光ビームのアライメントを監視して、最適なイメージング品質を確保することを忘れないでください。

この手法は、疾患プロセス中の希少細胞または見かけ細胞の検出と定量に関する洞察を提供するだけでなく、大規模で不均一な細胞集団内の細胞タイプの分類にも適用できます。この手法は、画像品質を維持しながら、イメージングサイトメトリーのスループット制限を克服する場合に特に有利です。このビデオを見れば、システムのセットアップからイメージング手順まで、ATOMの実装方法を十分に理解できるはずです。