ひと腎臓血管周囲間質細胞の新規臨床等級分離法

この臨床グレードの分離法の全体的な目的は、さまざまな腎疾患の細胞治療に用いるためのヒト腎血管周囲ストローマ細胞（kPSC）を分離することです。この手法は、腎疾患に対する中枢神経治療や移植に適したヒトkPSCなど、再生医療分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、臨床的に適用可能であること、および細胞治療に十分な数のkPSCを生成できることです。

当研究室の技術者であるEllen Lieversが、kPSCの機能試験について実演します。腎細胞の分離手順を開始する前に、滅菌済みの灌流トレイをウォーターバスに垂直に接続してください。灌流トレイが温まったら、ウォーターバスに接続したままトレイを水平方向に変更し、L/S 25チューブをポンプにセットします。

培養用ピンセットをチューブの一端に配置し、チューブをトレイの底に置きます。閉塞を防ぐため、チューブの上に滅菌ガーゼを置き、チューブのもう一端にルアーコネクタを取り付けます。次に、トレイに約100 millilitersの培地を加え、ポンプ速度100 milliliters/minでL/S 25チューブのフラッシングを開始します。腎細胞を単離するために、二重滅菌袋から腎臓を滅菌灌流トレイに移し、ハサミを用いて慎重に剥離しながら、腎周囲脂肪組織と腎被膜を除去します。

大動脈パッチ上の腎動脈を確認したら、アクセサリースパイクを用いて腎動脈をカニュレーションし、滅菌済みのタイラップでスパイクを固定します。ポンプを起動させ、ポンプチューブ端をルアーコネクターに接続します。そして、トレイ内の培地を用いて、100 milliliter per minuteの流速で腎臓をフラッシュします。

次に、20 millilitersのコラゲナーゼと2.5 millilitersのDNAseを灌流トレイに加え、酵素によって腎臓を消化させます。臓器が柔らかくなり、灌流液が不透明になり始めるまで、時々手で優しく臓器を回転させます。コラゲナーゼによる消化時間は非常に重要であり、短すぎると細胞の凝集につながり、長すぎると細胞死を招きます。酵素灌流の終了後、細胞懸濁液が得られるまで腎臓を優しくマッサージし、未消化物とスパイクを取り除きます。

50 mLの正常ヒト血清を細胞懸濁液に加えます。次に、ポンプを低流量に設定し、腎臓に接続されたチューブを数本の50 mL回収チューブの上に配置して、細胞懸濁液を灌流トレイから回収チューブに排出させます。すべての細胞を回収した後、細胞懸濁液を遠心分離し、10%正常ヒト血清を添加した洗浄用培地でペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞ペレットと同量の細胞培養培地でペレットを再懸濁します。

未精製腎細胞を培養するため、T 175細胞培養フラスコ1本あたり、約1 mLの細胞懸濁液を24 mLのα-MEM 5%血小板ライゼート細胞培養培地に加え、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。2日後、上清と細胞残渣を除去し、25 mLの新鮮な細胞培養培地を添加します。細胞がコンフルエントになったら、標準プロトコルに従い、磁気細胞分離法を用いてNG2陽性画分を単離します。

次に、適切なサイズの細胞培養フラスコに1cm²あたり4×10³個のNG2陽性細胞を播種し、フラスコを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞が90〜100%コンフルエントに達したら、上清を回収し、接着細胞をPBSで2回洗浄します。フラスコのサイズに応じて適切な量のトリプシンで細胞を剥離させ、5分後に保存しておいた上清を加えて反応を停止させます。

細胞を穏やかに再懸濁し、遠心分離用の適切なサイズのコニカルチューブに細胞懸濁液を移した後、4 × 10³ cells/cm² の密度で再播種します。NG2濃縮後、細胞の増殖が停止したり、3D構造で成長し始めたりすることがあります。この場合は、細胞をトリプシン処理して再播種することで解決できます。

4〜5代の継代後、kPSCを6ウェルプレートに1ウェルあたり2 mLの培地で2×10⁵ cellsの濃度で播種し、別の6ウェルプレートに近位尿細管上皮細胞を1ウェルあたり2 mLの近位尿細管上皮細胞培地で5×10⁵ cells播種します。両方のプレートを細胞培養インキュベーターに48時間置き、培養終了時にkPSCの細胞上清を回収します。次に、近位尿細管上皮細胞の上清を除去し、黄色いピペットチップを用いて各ウェルの底にある細胞単層にスクラッチを作製します。スクラッチした細胞をPBSで洗浄し、腎血管ストローマ細胞培養のコンディション培地を加えます。

その後、倒立明視野顕微鏡を用いて、同じマークした位置で4時間、8時間、12時間、および24後にスクラッチを撮影し、時間経過に伴う閉鎖率を評価します。腎血管周囲間質細胞は、プラスチック接着性で紡錘形の細胞であり、間質および血管周囲細胞マーカーに陽性で、CD31、CD34、CD45、およびHLA-DRのマーカーには陰性です。通常、継代4回目で均一な腎血管周囲間質細胞の集団が得られ、継代9回から10回前後で細胞は細胞老化に達します。

この代表的な創傷スクラッチアッセイでは、kPSCの機能的能を評価しました。腎周囲血管間質細胞の培養上清を添加したところ、コントロール培地で培養したウェルよりも有意に速く創傷が閉鎖しました。一次分離の手技に習熟すれば約2時間で完了しますが、均一なkPSC集団を構築するには1〜2か月かかります。この手順を行う際は、腎臓が柔らかくなり、液体の透明度が低下した時点で直ちにコラゲナーゼ処理を停止することが重要です。

ここで実演した手順に加えて、これらの手法は他の実質臓器から血管周囲ストローマ細胞を単離するためにも利用可能です。この手法で単離されたkPSCは、さまざまな腎疾患および移植モデルにおいて、これらの細胞の再生能力を研究するために使用できます。このビデオを視聴することで、臨床グレードの形式でkPSCを単離および培養できるようになります。

ヒト由来試料を扱う際はウイルス感染のリスクがあることに留意し、本手順を実施する際は、HIV、B型肝炎、C型肝炎などの検査を行うなど、常に予防措置を講じてください。