Name: 細胞分化および単細胞イメージングの誘導腸炎ビブリオスイマーとスマーマー細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶVibrio parahaemolyticusの細胞分化誘導と単細胞蛍光顕微鏡解析法。スワーマー細胞の単層化による細菌コミュニティ内イメージングの課題解決と細胞内構造の動態理解に貢献します。

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この研究はマックス・プランク・ソサエティによって支持された。

1.エレクトロコンピテントV.腸炎ビブリオ菌細胞の調製およびスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション注記：プロトコルの次のセクションでは、エレクトロコンピテント細胞の調製とその後のスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションが可能です。蛍光タンパク質がプラスミドから異所的に発現される場合、この工程は重要である。 <ol><li> 100μg/ mLのアンピシリンを含有する新鮮なLB寒天プレート上に-80℃のグリセロールストックからのV.parahaemolyticus細胞をストリークし、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、200mLのLB培地にV.parahaemolyticusの単一コロニーを接種し、振盪条件下でOD 600が1.0に達するまで37℃でインキュベートする。それは、細胞培養物が所望の光学濃度に達するために通常5〜6時間のインキュベーションを要する。 </li><li>直ちに細胞を氷上に移し、perf氷上で4℃の予冷した遠心分離機でさらにすべてのステップを行う。 </li><li>細胞を4℃で10分間2,000 x gで収穫する。 </li><li>デカンテーションにより上清を捨て、25mLの氷冷273mMスクロース溶液（pH7.4、KOHで緩衝化した）に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 4℃で10分間、2000×gで細胞を再度採取する。さらに2回繰り返します。 </li><li>洗浄した細胞ペレットを400μLの氷冷273mMスクロース溶液に再懸濁する。続いてグリセロールを15％vol / volの最終濃度に添加する。細胞はエレクトロポレーションの準備が完了していますが、後で使用するために-80℃で70μLのアリコートで凍結することもできます。 </li><li>エレクトロポレーションのために、エレクトロコンピテント細胞の70μLアリコートを100〜1,000ngのプラスミドDNAと混合し、混合物を氷冷エレクトロポレーションキュベット（0.2cmの電極ギャップ）に移す。 25μF、2400 V、200Ωの設定でエレクトロポレーションを行います。 </li><li>中断する細胞をLBブロス600μL中のエレクトロポレーションキュベットに入れ、2mLチューブに移し、37℃で3時間振とうしながらインキュベートする。 </li><li>細胞を2,000 xgで5分間遠心し、100μlのLBブロスにペレットを再懸濁する。必要な抗生物質を含む選択的LB寒天プレートに細胞懸濁液を広げ、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、コロニー形成についてプレートをチェックする。増殖するコロニーはプラスミド上にコードされた正しい抗生物質耐性遺伝子を保有し、さらなる実験に使用することができる。 </li></ol>スワマー細胞分化誘導注：以下のステップは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞のライフサイクルへの分化を誘導する方法、および固体表面上の増殖を刺激する方法を記載する。 <ol><li>スワンミングプレートを調製するために、4mLのハートインフュージョン（HI）寒天を100mLのddH 2 O中に懸濁する。 </li><li>HI寒天溶液を電子レンジで注意深く沸騰させ、粉末が溶解するまで瓶を随時振とうする。 121℃で20分間オートクレーブ処理する。 </li><li>オートクレーブ後、HI寒天を60〜65℃に冷却する。最終濃度50μM（100％エタノール中50mMのストック溶液）に2,2&#39;-ビピリジルを添加する。 4mMの最終濃度（ddH 2 O中の4Mのストック溶液）にCaCl 2を添加する。必要に応じて、抗生物質を溶液に加えてプラスミドを維持する。 注：誘導性プラスミドを使用する場合は、最終濃度に誘導剤を加えてください。 注意：2,2&#39;-ビピリジル：急性毒性（経口、経皮、吸入）。この化学物質を取り扱う際には、手袋および安全ゴーグルを使用する。 </li><li>最後のHI寒天溶液30〜35mLを丸150mmペトリ皿に注ぎ、寒天を凝固させる。 </li><li>細胞培養物をスポッティングする直前に、寒天プレートを37℃で少なくとも10分間乾燥させます（または液体残渣にdisappeared、しかしもはや）右上に開いた蓋があります。 注：乾燥時間は、使用したインキュベーターに大きく依存し、重度に乾燥したプレートは、 腸炎ビブリオの蔓延を許さない 。 （このステップは非常に重要です！）プレートは新しく使用する必要があり、2〜3時間以上経過してはいけません。古いプレートはあまりにも乾燥して群れを刺激することはありません。 </li><li>単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。 OD 600 = 0.8に達するまで37℃で振とう培養物をインキュベートする。通常、約2〜3時間かかる。その後、細胞はHIスウィング寒天プレート上にスポットされる準備が整う。 </li><li> HI寒天プレート（ 図1A ）の中央に細胞培養液1μLをスポットする。 </li><li>スポットを乾燥させる（ 図1B ）。 </li><li>透明なプラスチックテープでプレートを密封し、しっかりと取り付けてください。そうでなければ、一晩のインキュベーション中に取り外す可能性があります（ 図1C ）。 注：これはシールが完璧であることが非常に重要です。適用時にテープに気泡や折れ曲がりが発生しないように注意してください。 </li><li> 24℃で一晩インキュベートする。これにより、鞭毛コロニー（ 図2 ）の周辺部から伸びる群発虫が発生した腸炎ビブリオの群集が形成される。 </li></ol> 3.蛍光顕微鏡用のV.parahaemolyticus Swarmer細胞の調製注：以下のプロトコールは、顕微鏡検査のための単一のスマーマー細胞を得るために、顕微鏡アガローススライドを調製する方法およびアガロースパッド上に猛烈なフレアの続くインプリンティングを記載する。 <ol><li>顕微鏡用アガローススライドを調製するには、20％vol / vol PBSおよび10％vol / vol LBブロス溶液100 mLに1 gのアガロースを加えます。注意深く電子レンジで溶液を沸騰させてアガロースを溶解させ、マグネチックスターラーで混合しながら65〜70℃に冷却します。 </li><li>交流する場所リーン顕微鏡は作業台の完全な水平部分にスライドします。スライドの両端を汎用ラボ用ラベリングテープの2つの層で覆い、スライドを作業台に固定します。 2枚のテープの間隔は3cm程度にしてください。 注：テープの2つの層は、アガロースパッドの高さを決定する非常に小さな標高を作成します。細胞が顕微鏡分析のために同じ平面内にあることを確認するために作業空間が水平であることが重要です。 </li><li>先に調製したアガロース溶液250μLを非被覆ガラス表面上にピペットで入れる。 </li><li> 2番目の顕微鏡スライドを底に1つの上と同じ向きに置き、少し残して残ったアガロースが側面に流れ出るようにします。 </li><li>アガロースを1〜2分間固化させ、次に水平方向の動きで上部ガラススライドを底部ガラススライドからゆっくりと引っ張ります。 </li><li>メスを使用し、メスに付着している残りのアガロースをすべて切り取ってください。顕微鏡スライドの両側をゆっくりとスライドさせ、顕微鏡スライドの端部からテープをゆっくりはずします。 注：アガローススライドはすぐに準備ができており、ゆっくりと乾燥が始まるので、できるだけ早く使用する必要があります。 </li><li>スマーマー細胞で顕微鏡検査を行うには、群集のコロニーの最も外側の端から3mm×10mmのスウォーミング寒天片を切り取ってください（ 図1D ）。スイマーセルを顕微鏡スライドに移す直前まで、スウォームプレートのテープシールを壊さないことは非常に重要です。テープを剥がすと、 鞭毛鞭毛虫細胞はスイマー細胞への分化を開始する。 注：群集の端から外へのカットをコロニーの内側に向けるようにしてください（ 図1D ）。この方法で、群れのコロニーの端に「水泳者の汚染」を防ぐことができます。 </li><li>細胞がアガロースpaに面している顕微鏡アガローススライド上に群れの寒天片を転送d（ 図1E ）。これは、群れの細胞をアガロースパッド上にインプリントする。 </li><li>約30秒待ってから、アガロースパッドから寒天片を注意深く取り除いてください（ 図1F ）。 </li><li>細胞がインプリントされたアガロースパッド上にガラスカバースリップを置く。細胞は顕微鏡検査の準備ができています。 注：スマーマー細胞はゆっくりとスイマー状態への分化を開始するので、スマーマー細胞を直ちにイメージングすることが重要です。 </li></ol> 4.蛍光顕微鏡検査のためのV.parahaemolyticusスイマー細胞培養物の調製注：プロトコールのこのセクションでは、スイマー細胞型で蛍光顕微鏡検査を行うためにV.parahaemolyticusの培養液を調製する方法について説明します。 <ol><li>単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。培養物を37℃で1時間、またはわずかな細胞増殖が見えるようになるまで振とうする。 </li><li>でこの段階は、必要であれば、目的のタンパク質の発現のための誘導剤を添加する。この実施例では、YFP-CheW9の発現を誘導するために、L-アラビノースを0.2％（w / vol）の最終濃度まで添加した。 </li><li>培養物を37℃でさらに2時間振とうさせる。 </li><li>顕微鏡のアガローススライドを準備するために、3.1-3.7のステップに従ってください。 </li><li>アガロースパッドの中央に細胞培養液1μLをスポットし、乾燥するまでインキュベートします。 </li><li>ガラスカバースリップを細胞が見つかったアガロースパッド上に置く。細胞は、蛍光顕微鏡下で画像化する準備が整っている。 </li></ol> 5.画像解析このプロトコルの部分では、画像分析のワークフロー、特に、人口統計解析のための単一細胞の蛍光データの抽出方法について説明します。 <ol><li>画像解析を開始する前に、すべての顕微鏡画像が16ビットTIF形式で保存されていることを確認してください。 </li><li> DIC（または位相コントラスト）および対応する蛍光チャネル画像をソフトウェアにロードします。 </li><li> 「表示/オーバーレイ画像」を選択して、両方のチャンネルのオーバーレイ画像を生成します。画像の数（「＃Images：」）を2に設定し、第1チャンネルのDIC画像と第2チャンネルの蛍光画像を選択します。 </li><li>ツールバーから「マルチライン」ツールを選択し、セルの中央から一方のポールから他方のポールにセルをマーキングします。生成されたすべての線（線オブジェクト）のリストを取得するには、「Measure / Region Measurements」を開きます。領域のラベル、距離、および平均強度のみを表示するように、領域の測定値を設定します。 </li><li> 「測定/キャリブレーション距離」のピクセルサイズを、顕微鏡セットアップに特有のピクセルサイズに較正し、「すべての開いている画像に適用」をクリックします。 </li><li>すべての領域（線オブジェクト）を蛍光チャネル画像に転送します。 「地域/トランスフソース画像（オーバーレイ画像）とデスティネーション画像（蛍光灯画像）を選択し、「すべての領域」を選択して「OK」を押します。 注記：後で正確な線（線オブジェクト、領域、ROI）を再生成するには、「領域/領域の保存」を開いて領域を保存します。 </li><li> &quot;Measure / Region Measurements&quot;を開いて &quot;Open Log&quot;を押して、すべての領域測定値をスプレッドシートにエクスポートします。データを開いてエクスポートすることを確認します。スプレッドシートをバックグラウンドで開くと、最後に &quot;F9：Log Data&quot;を押してデータをエクスポートします。 </li><li> セルに沿って蛍光焦点の位置を決定するには、 &quot;Measure / Linescan&quot;を開きます。セルの全幅が、以前に作成した領域で覆われるように、「線の幅」を値に設定します。ラインスキャングラフを右クリックし、「グラフデータを表示」を選択します。マウスを左クリックしてドラッグすると、ラインスキャンに沿って「Graph Data」ウィンドウには、2点間の対応するピクセル/距離が表示されます。青色の強調表示された行を選択し、内容をコピーします。 注：ラインスキャン強度プロファイル全体は、「ラインスキャン」ウィンドウで「ログデータ」を押すことでスプレッドシートに記録できます。抽出されたデータは、グラフやその他の統計分析での視覚化に使用できます。細胞周期にわたる局在化パターンは、細胞体に沿った細胞長および蛍光強度の人口統計学的表現で容易に視覚化することができる。これらの表現は、前に選択した同じROIを使用して取得できます。以下のステップは、 図3Cおよび4Cに示されるものと同様の人口統計を生成する方法の例を与える。 <ol><li> &quot;Metamorph nd＆ROI files importer&quot;を使用して、ソフトウェアで以前に作成されたフィジー/ ImageJのロード領域マーキング（.rgn）（ステップ5.6）;あるいは、分析される細胞の関心領域（ROI）は、組み込み「セグメント化された線」ツールを使用して、Fiji / ImageJで直接作成することができる。 </li><li> 「Analyze / Tools / ROI manager」を開き、すべてのアクティブなリスト項目をマークします。 </li><li>その後、 &quot;More / Multi Plot&quot;をクリックし、新しい &quot;Multi Plot&quot;ウィンドウで &quot;List&quot;を選択します。テーブルエントリをクリックして、「すべてコピー」を選択します。その後、新しいスプレッドシートに貼り付けます。 注：最も長いセル（対応する2つのXとYの列が最も多くの行を持つ）のデータがスプレッドシートの最後のものであることを確認してください。 </li><li>スプレッドシートを「CSV（カンマ区切り）（* .csv）」として保存します。 </li><li> Rスクリプトはここからダウンロードしてください。 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10.スクリプトは長さ別に細胞を分類し、各細胞の蛍光強度の平均としてすべての細胞の蛍光強度プロファイルを正規化しますe。 </li><li> R [バージョン3.0.1のスクリプト &quot;cell profiles function.R&quot;全体を実行します。 11 ]。 </li><li> 30行目の &quot;example plots.R&quot;スクリプトを編集して、ファイルパスが以前に生成された.csvファイルが保存されているフォルダを参照するようにします。さらに、31行目のファイル名 &quot;profile.csv&quot;を、手順5.9.4で生成した.csvファイル用に選択したファイル名に変更します。その後、 &quot;example plots.R&quot;を実行し、 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;のドキュメントとスクリプトファイルのコメントに従って、人口統計解析を生成します。 </li></ol></li></ol>

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利害の衝突は宣言されていない。

本稿では、 V. parahaemolyticus swarmer細胞の顕微鏡画像化方法とそれに続く下流分析を用いて、細胞内局在および研究された蛍光標識タンパク質の他の特徴を解明および定量する方法を報告する。顕微鏡検査画像処理および分析のためのいくつかのツールが存在するが、V.parahaemolyticusスウォーム細胞の分析は、大部分が高密度細胞集団内に通常存在し、細胞長の変動が大きいために依然として挑戦的である（14,15,16,17,18） 図2 ）。したがって、自動化された細胞の検出には時には欠陥があり、結果はやや信頼性がありません。このプロトコルは、 V.parahaemolyticusの鞭打ち細胞を増殖、画像化および分析するために設計されたパイプラインを概説しており、近接して成長する可変長の細胞の存在に対応する表面および下流の画像解析上の制御された増殖環境のような、これらの細胞の必要性が存在する。 目的のタンパク質をプラスミドから異所的に発現する能力は、いくつかの実験、 例えば顕微...

細菌は、常に外部環境の変化を経験し、それに応じて行動を変化させ適応させるためのいくつかの技術を開発してきた。そのような機構の1つは、変化した環境をよりよく補う別個の細胞型への分化を含む。分化は、しばしば、細胞周期の調節、細胞形態学、および細胞の時空間組織化における主要な変化を伴う。分化を受けることができる1つの生物は、腸炎ビブリオである 。 V.parahaemolyticusはVibrionaceaeに属し、これは通常新鮮なまたは塩水に棲むプロテオバクテリアのファミリーである。 Vibrionaceaeは環境に広く分布しており、Vibrio cholerae.Vを含むヒトに腸管感染を引き起こすいくつかの種を含む。腸炎菌は二形性生物であり、その変化に対応するための応答として2つの異なる細胞型に分化することができる外部環境。水性環境では、それは古い棒状のスイマー細胞として存在し、単一の極性鞭毛が古い細胞極に位置する。表面が接触すると、スマーマーセルへの分化が引き起こされる。スワマー細胞の分化には、2つの大きな変化が含まれる：細胞分裂の阻害によるスワマー細胞の形態形成、および第2の鞭毛系の誘導。この結果、蠕虫状の非常に細長い棒状のスマーマー細胞が形成され、スマーマーライフスタイルを続けることができ、分裂イベントは後代のスマーマー細胞を生じるか、または代わりにスイマー細胞に分化する。 スウォーマーの分化を誘導または影響するいくつかの因子が報告されている。一次刺激は、 V.腸炎菌が表面接触時の回転の阻害を検出する触覚センサとして極性鞭毛を使用するメカノセンシングによって駆動されると思われるが、他のいくつかの要因がウェル1 。実験室では、フェナミルを添加することにより、極性鞭毛の回転を人為的に阻害することができます。フェナミルは、ナトリウムチャネル駆動の鞭毛回転を阻止し、それによりスワマー分化を誘発します2 。さらに、初期の研究では、細胞を透明なプラスチックテープでシールしたペトリ皿中で増殖培地上で増殖させると、 ビブリオ・アルギノリチカスは固体培地上に集まるように誘導された。アルカリ性の濾紙は、これらの条件下での群れを防ぎ、したがって、1つまたは複数の揮発性酸が群れ誘導に関与している可能性があることを示唆している。従って、プラスチックテープでペトリ皿を密封することは、プレートのヘッドスペース内で、細胞代謝の副生成物として形成される揮発性酸の蓄積を可能にする可能性が高い。培地成分を加水分解することによって人工的に揮発性酸を生成するために、シールされていないペトリ皿中で増殖培地にH 2 O 2を添加した場合にも同じ効果が達成された<supclass = &quot;xref&quot;&gt; 3、4、5。それにもかかわらず、このような揮発性酸のアイデンティティは未知のままである。さらに、カルシウム6および鉄制限7の過剰な利用は、固体表面上のスマーマー分化および増殖を促進することが示されている。化合物2,2&#39;-ビピリジルをスウォーマー分化に影響することが示されている増殖培地に添加することにより、細胞を鉄で飢えさせることができる8 。分化を調節することが知られている因子は、スワマー細胞への腸炎ビブリオ寄生虫の分化および固体寒天表面上でのそれらの増殖を再現可能に誘導するプロトコールの設計において現在実施されている。 V.腸炎ビブリオの分化は、細胞分裂、細胞形態の調節、および鞭毛のような巨大分子機械の配置における主要な変化を伴うaおよび走化性装置 - 細胞周期に従ってタンパク質の特異的局在を必要とするプロセス。従って、このようなタンパク質の細胞内局在を研究する能力は、前述の細胞プロセスの理解に必須である。そのような研究を行うためには、単一細胞に対する蛍光顕微鏡法が必要である。これは、スマーマー細胞の場合のように、高密度細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。顕微鏡検査のために単一細胞を潜在的に生成する可能性がある液体培地中のスマーマー分化を誘導する試みがなされている。そして、転写レベルでは、これらの細胞は部分的にスワマー分化プログラムを誘導したが、固体培地上で増殖させた完全に分化したスマーマー細胞と同じ形態変化を受けなかった8 。この論文は、スワーマーを誘発する方法の堅牢で再現性のあるプロトコルを提供する寒天表面での分化。プロトコールは、単一細胞顕微鏡法およびその後の分析のために容易に入手可能な容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生する。さらに、このプロトコールは、スイマー細胞およびスワマー細胞型（セクション1,2,3,4）の両方において蛍光標識タンパク質の局在化研究を可能にする。さらに、このプロトコルは、細菌顕微鏡の人口統計的分析を可能にする蛍光顕微鏡検査（セクション5）から生成されたデータを処理および分析する方法に関する後続のワークフローを記述する。

<table><tbody><tr><td>Mediaコンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB中</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco寒天、粒状</td><td>BD</td><td>214510</td><td>LB中</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion寒天培</td>地<td>BD BD</td><td>244400</td><td>HI寒天スウォーミングプレートの調製用</td></tr><tr><td>アガロースNEEO、超高品質</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>顕微鏡検査用アガロースパッドの調製</td></tr><tr><td>用名前</td><td><strongstrong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Additives</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-アラビノース</td><td>ロスロス</td><td>5118.3</td><td>pBAD誘導体</td></tr><tr><td>2,2'-ビピリジル</td><td>を誘導するために使用されますシグマアルドリッチ</td><td>D216305-25GHI</td><td>寒天スウォーミングプレートの調製用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>ロス</td><td>5239.1HI</td><td>寒天スウォーミングプレートの調製用</td></tr>アン<tr><td>ピシリンナトリウム塩</td><td>ロス</td><td>K029.3</td><td></td></tr>クロ<tr><td>ラムフェニコール</td><td>ロス</td><td>3886.3PBS</td><td></td></tr><tr><td>バッファー</td><td>-</td><td>リン</td><td>酸塩緩衝生理食塩水</td></tr><tr>の標準レシピ<td>D(+) ショ糖</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>電気コンピテントセルの調製用</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>電気コンピテントセルの調製</td></tr><tr><td>用名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Hardware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 150 mm x 20 mm カム付き</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>HI 寒天スウォーミングプレートの調製用</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>ヘレウス</td><td>-</td><td>HI 寒天スウォーミングプレートの乾燥に使用</td></tr><tr><td>遺伝子パルサー Xcell 微生物システム</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>プラスミド DNA</td></tr><tr><td>Name</td><td></td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>顕微鏡画像解析に使用</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>顕微鏡データ解析に使用</td></tr></tbody></table>

細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;スイマーとスマーマー細胞

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

タンパク質の細胞内局在を研究する能力は、多くの細胞プロセスの理解に不可欠です。これは、蛍光顕微鏡検査のための単一細胞を得る能力を必要とし、細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。例えば、ヒト病原体Vibrio parahaemolyticusは、表面接触時に固体表面上での増殖に特化した非常に細長いスマーマー細胞の亜集団に分化する液体状態の短い棒状のスイマー細胞として存在する。本稿では、 V.parahaemolyticusの 2つの異なる状態における単一細胞蛍光顕微鏡分析を行う方法を提示する。このプロトコールは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞ライフサイクルへの分化を非常に再現性よく誘導し、固体表面上でのそれらの増殖を促進する。この方法は、tから伸びる分化したスマーマー細胞のフレアを生成する群れコロニーの縁である。注目すべきは、群れのフレアの先端では、スワマー細胞が細胞の単一層内に存在し、顕微鏡スライドおよびその後の単一細胞の蛍光顕微鏡画像化への容易な移行が可能になることである。さらに、細菌学の人口学的表現のための画像分析のワークフローが提示されている。原理の証明として、V.parahaemolyticusのスイマーおよびスマーマー細胞における走化性シグナル伝達アレイの細胞内局在の分析が記載されている。

集団コロニーの分化誘導 図1は、 V.parahaemolyticus （ 図1A〜C）の 鞭打ちコロニーを産生することに関与する重要なステップのスキーマを提供する。スイマー培養物を群寒天にスポットし、24℃でインキュベートし、固体寒天表面上のスマーマー分化および増殖を誘導した。群れたコロニーの代表的な立体顕微鏡画像を図2に示します。ステレオ顕微鏡法によるイメージングでは、群コロニー周辺の外側に広がる群発発射が明確に示されます。より高い倍率は、群発発火において、細胞が単層または二層のみにグループ化されるのに対して、群のコロニーでは、複数の層に細胞が積み重なっていることを明らかにする（ 図2A ）。スウォームフレアは容易に転送することができます（ステップ3.8-3.11、 <strong&g...

このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

本手法の目的は、細菌であるVibrio parahaemolyticusの細胞分化を誘導し、蛍光顕微鏡による単一細胞解析に容易に利用可能な、分化したスウォーマー細胞の集団を形成させることです。本手法は、細菌が細胞分化および形態形成の過程でどのように細胞内組織化を制御しているかを解明するのに役立ちます。細菌コミュニティ内の細胞をイメージングすることは困難な場合がありますが、本技術の主な利点は、単一細胞顕微鏡解析にすぐに利用できる、単層状態で存在する分化したスウォーマー細胞の集団を作製できる点にあります。本手法の意義は、細胞分化における細菌の細胞周期、細胞形態、および細胞内組織化の変化の制御メカニズムに対する理解を深めることにあります。細胞分化の確実な誘導およびシングルセル解析に適した細胞の調製は困難であるため、本手法の実証は極めて重要です。スウォーミングプレート作成用の寒天溶液を調製するには、4 gのハートインフュージョン（H.I.）寒天粉末を100 mLの二回蒸留水に懸濁させます。H.I.agar溶液を電子レンジで慎重に加熱し、粉末が溶解するまで時々ボトルを振ってください。アガロース溶液を121 °Cで20分間オートクレーブし、絶えず攪拌しながら60〜65 °Cまで冷却します。次の工程では、毒性の高い2, 2'Bipyridylを取り扱うため、必ず手袋と保護メガネを着用してください。2, 2'Bipyridylを最終濃度50 micromolarになるように添加します。塩化カルシウムを最終濃度4 millamolarになるように添加します。単一コロニーの端から少量のV.parahaemolyticus細胞を、5 milliltersのLBブロスに接種します。培養液をシェーカーインキュベーターを用い、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.8に達するまで37 °Cでインキュベートします。通常、これには約2〜3時間かかります。細胞培養の成長を待つ間に、最終的なH.I. agar溶液30〜35 mLを直径150 mmの円形ペトリ皿にピペッティングし、アガロースを凝固させます。細胞培養液をスポットさせる直前に、アガープレートの蓋を開けたまま、37 °Cで少なくとも10分間、または液状の残渣が消失するまで直立させて乾燥させます。ただし、乾燥させすぎないようにしてください。H.I.agarスウォーミングプレートの中心に、細胞培養液を1 µLスポットし、乾燥させます。気泡やテープの折り目ができないように注意しながら、透明なプラスチックテープでプレートを密封します。プレートを24°Cで一晩インキュベートします。これにより、このタイムラプスビデオクリップに示されているように、コロニーの中心からスウォームフレアが伸びるV.parahaemolyticusのスウォームコロニーが形成されます。本手順の最初のステップは、顕微鏡観察用のアガローススライドを準備することです。1 gのアガロースを、20% PBSおよび10% LBブロス溶液100 mLに加えます。電子レンジで溶液を慎重に加熱し、アガロースを溶解させた後、マグネチックスターラーで攪拌しながら65～70 °Cまで冷却させます。きれいな顕微鏡スライドガラスを、完全に水平な作業台の上に置きます。汎用研究室用ラベルテープを2層重ねてスライドの両端に貼り付け、ベンチに固定します。2つのテープの間隔は約3 cmにします。あらかじめ調製したアガロース溶液を約250 µL、テープで覆われていないガラス面にピペットで滴下します。下側のスライドと同じ向きに2枚目の顕微鏡スライドを上に重ね、残りのアガロースが側面に流れ出すように軽く押し付けます。アガロースを1〜2分間凝固させます。メスを使用して、顕微鏡スライドの側面に付着している余分なアガロースを取り除きます。アガロースが凝固したら、上のガラススライドを水平に動かしながら、ゆっくりと下のスライドから剥がします。顕微鏡スライドの両端からテープをゆっくりと取り除きます。アガローススライドは徐々に乾燥し始めるため、できるだけ速やかに使用してください。スウォーマー細胞を顕微鏡スライドに転移させる直前に、メスを使用して、あらかじめ準備しておいたスウォーマープレートからプラスチックテープを切り離します。スウォーミングアガールの切り出しの際、コロニー中央部の細胞によってスウォーミングフレア（辺縁部）が汚染されるのを防ぐため、外側から内側に向かって切断することが重要です。新しいメスを用い、スウォーミングコロニーの最も外側の端から3 mm × 10 mmのサイズでスウォーミングアガールの断片を切り出します。このとき、必ずコロニーの端の外側から内側に向かって切断してください。スウォーミングアガーの断片を、細胞面がアガロースパッドに接するように顕微鏡用アガローススライドに転写し、スウォーミング細胞をアガロースパッドに転写します。約30秒間待機した後、アガロースパッドからアガーの断片を慎重に取り除きます。細胞が転写されたアガロースパッドの上に、ガラスカバーガラスを載せます。これで細胞を蛍光顕微鏡で観察する準備が整いました。V.parahaemolyticusのスウォーマーコロニーを実体顕微鏡で倍率を上げて撮影すると、スウォームコロニーの周辺部からスウォームフレアが伸びていることがわかります。フレア内の細胞は単層または二層のみで集まっていますが、スウォームコロニー中央部の細胞は多層に重なっています。DIC顕微鏡観察により、フレア部分は完全に分化したスウォーマー細胞のみで構成されていることが明らかになった一方、スウォームコロニー中央部の細胞は著しく短く、スイマー細胞とスウォーマー細胞の混合状態である可能性が高いことが示された。原理実証として、必須走化性タンパク質であるYFP-CheWを異所的に発現させた野生型V.Parahaemolyticusのスイマー細胞およびスウォーマー細胞を用いて、DICおよび蛍光顕微鏡観察を行った。スイマー細胞では、YFP-CheWは単極性または双極性に局在したが、スウォーマー細胞では、YFP-CheWは常に双極性に局在し、さらに細胞長に沿ってランダムに配置されたクラスターも形成していた。スイマー細胞からスウォーマー細胞への分化におけるYFP-CheWの局在パターンの変化は、フォーカスの分布表示および蛍光強度プロファイルの人口統計学的解析によっても示されました。本手法の開発後、微生物細胞生物学分野の研究者は、細菌Vibrio parahaemolyticusがスイマー細胞とスウォーマー細胞という異なる分化状態において、内部組織をどのように調節しているかを探求することが可能となりました。このビデオを視聴することで、細菌Vibrio parahaemolyticusの細胞分化を誘導する方法、および蛍光顕微鏡による単一細胞解析のために分化したスウォーマー細胞集団を調製する方法について、十分な理解を深めることができます。Vibrio parahaemolyticusはヒトの病原体であるため、お住まいの地域のBSL 2病原体の取り扱いに関する適切な手順および規制を適用することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Heering、J.、 et al. Vibrio parahaemolyticus スイマー細胞とスウォーマー細胞の細胞分化と単一細胞イメージングの誘導 J. Vis. 経験。 (2017年)このビデオは、特別に調製された寒天培地を使用して、ビ ブリオパラ溶血性ビブリオ...

ビ ブリオパラ溶血性ビブリオ のスウォーマー細胞への分化の誘導

源： ヒーリング、J.、 他。、細胞分化の誘導とビ ブリオパラ溶血性 スイマー細胞およびスウォーマー細胞の単一細胞イメージング。 J. Vis. 経験。 (2017).このビデオは、蛍光イメージング用のビ ブリオパラ溶血性菌...

イメージングのための Vibrio parahaemolyticus Swarmer細胞の調製

出典: Morales-Soto、N. et al.、 細菌表面運動性アッセイの調製、イメージング、および定量化。 J. Vis. 経験。...

細菌の表面運動性を可視化するためのスウォーミングアッセイ

群れの運動性は、物理的および環境的要因の影響を受けます。ここでは、スウォームアッセイの調製とデータ収集に一般的に関連する課題を回避するための2段階のプロトコルとガイドラインについて説明します。巨視的なイメージング技術を使用して、現在の分析技術では提供されない群れの行動に関する詳細な情報を取得します。...

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

進化のシナリオで品揃え（空間的分離）の役割は、空間分布の調整を可能にする制御された実験室での単純な微生物系を用いて調べることができます。創始細胞密度を変更することにより、様々な品揃えのレベルは、 枯草菌のコロニーバイオフィルム内の蛍光標識された菌株を使用して可視化することができます。...

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

例として枯草菌を使用して個々...

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

ここでは、複数の濃度応答を同時に取得しながら細菌群動性を評価するためのインデューサーグラジエントプレートの使用について説明します。...

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

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ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

学ぶVibrio parahaemolyticusの細胞分化誘導と単細胞蛍光顕微鏡解析法。スワーマー細胞の単層化による細菌コミュニティ内イメージングの課題解決と細胞内構造の動態理解に貢献します。

細胞分化および単細胞イメージングの誘導

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