細胞分化および単細胞イメージングの誘導腸炎ビブリオスイマーとスマーマー細胞
May 15th, 2017
このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。
この方法の全体的な目標は、細菌Vibrio parahaemolyticusの細胞分化を誘導し、蛍光顕微鏡による単一細胞分析に容易に利用できる分化した群れ細胞の集団を形成することです。この方法は、科学者が細胞の分化と形態形成中に細菌が細胞内組織をどのように調節するかを理解するのに役立ちます。細菌群集内の細胞のイメージングは困難な場合があるため、この手法の主な利点は、シングルセル顕微鏡分析に容易に利用できる単一細胞層に存在する分化したスウォーマー細胞の集団を生成することです。
この手法の意味するところは、細菌が細胞分化中の細胞周期、細胞形態、および細胞内組織の変化をどのように制御するかについての理解を深めることにまで及びます。細胞分化の信頼性の高い誘導とシングルセル解析に利用可能な細胞の形成を達成することが難しいため、この方法の実証は非常に重要です。スウォーミングプレートを作るための寒天溶液を調製するには、4グラムの心臓注入、またはH.I.寒天粉末、および100ミリリットルの二重蒸留水を懸濁します。
H.I.寒天溶液を電子レンジで慎重に沸騰させ、粉末が溶けるまでボトルを時々振ってください。寒天溶液を摂氏121度で20分間オートクレーブし、寒天溶液を60 t0 65°Cに冷却し、絶えず攪拌します。次のステップでは、毒性の高い2,2'ビピリジルの取り扱いを行うため、手袋と安全ゴーグルを着用する必要があります。
2,2'Bipyridylを最終濃度50マイクロモルに加えます。塩化カルシウムを最終濃度4ミラモラーまで加えます。1つのコロニーの端から少量のV.parahaemolyticus細胞を5ミリリットルのLBブロスに接種します。
培養物をシェーカーインキュベーターで摂氏37度でインキュベートし、600ナノメートルの光学密度が0.8に達するまでインキュベートします。これには通常、約2〜3時間かかります。細胞培養が進行している間に、最終H.I.寒天溶液30〜35ミリリットルを丸い150mmのペトリ皿にピペットで移し、寒天を固めます。
細胞培養物を見つける直前に、寒天プレートを37°Cの蓋を開けた状態で少なくとも10分間、または液体の残留物が消えるまで直立させて乾燥させます。H.I.寒天培地の群れプレートの中央に1マイクロリットルの細胞培養物を見つけ、そのスポットを乾燥させます。プレートを透明なプラスチックテープで密封し、気泡やテープへの折り目の形成を防ぐように注意してください。
プレートを摂氏24度で一晩インキュベートします。これにより、このタイムラプスビデオクリップに示すように、コロニーの中心から群れのフレアが伸びるV.Parahaemolyticusの群れコロニーが形成されます。この手順の最初のステップは、顕微鏡用のアガローススライドを準備することです。
100ミリリットルの20%PBSと10%LBブロス溶液に1グラムのアガロースを加えます。溶液を電子レンジで慎重に沸騰させてアガロースを溶かし、マグネチックスターバーで混合しながら摂氏65〜70度まで冷まします。清潔な顕微鏡スライドを作業台の完全な水平セクションに置きます。
スライドの両端を2層の汎用ラボ用ラベリングテープで覆って、スライドをベンチに固定します。2つのテープ間の距離は約3センチメートルである必要があります。事前に調製したアガロース溶液の約250マイクロリットルを、覆われていないガラス表面にピペットで移します。
2枚目の顕微鏡スライドを下部スライドと同じ向きで上に置き、残留アガロースが側面に流れ出るようにわずかに押し下げます。アガロースを1〜2分間固めます。メスを使用して、顕微鏡スライドの側面に付着している残留アガロースを切り取ります。
アガロースが固まったら、水平方向に動かして上部のガラススライドを下のスライドからゆっくりと引き抜きます。顕微鏡スライドの端からテープをゆっくりとはがします。アガローススライドはゆっくりと乾き始めるため、できるだけ早く使用する必要があります。
スワーマー細胞を顕微鏡スライドに移す直前に、メスを使用して、以前に準備したスウォーマープレートからプラスチックテープを切り取ります。群れ寒天の切除中は、コロニーの中央から発生する細胞で群がるフレアを汚染しないように、カットを群がるコロニーの外側から内側に向けることが重要です。新鮮なメスを使用して、群がるコロニーの最も外側の端から3ミリメートル×10ミリメートルの群れる寒天を切り取り、群がるコロニーの端の外側からコロニーの内側に切り口を向けるようにします。
群れ寒天の断片を顕微鏡アガローススライドに移し、細胞をアガロースパッドに向けて、群がる細胞をアガロースパッドに刻印します。約30秒待った後、寒天片をアガロースパッドから慎重に取り出します。細胞が刻印されたアガロースパッドにガラスカバースリップを置きます。
これで、細胞は蛍光顕微鏡検査の準備が整いました。V.parahaemolyticusの群れコロニーの立体顕微鏡イメージングを拡大してみると、群れコロニーの周辺から広がる群れフレアが見られます。フレア内の細胞は単層または二重層のみにグループ化されますが、群れコロニーの中央にある細胞は複数の層に積み重ねられます。
DICの顕微鏡イメージングにより、フレアは完全に分化した群れ細胞の集団のみで構成されていることが明らかになりましたが、群れコロニーの中央からの細胞は著しく短く、遊泳細胞と群れ細胞の混合物を表している可能性があります。原理の証明として、DICおよび蛍光顕微鏡イメージングを野生型V.Parahaemolyticus遊泳動物および群細胞に対して行い、必須走化性タンパク質であるYFP-CheWを異所的に発現させました。遊泳細胞では、YFP-CheWはユニポーラおよびバイポーラの方法で局在しますが、群れ細胞では、YFP-CheWは常にバイポーラに局在し、細胞の長さに沿ってランダムに配置されたクラスターを形成します。
遊泳選手から群れ細胞への分化中のYFP-CheWの局在パターンの変化は、病巣分布の表示と蛍光強度プロファイルの人口統計学的分析によっても示されました。その開発後、この技術は、微生物細胞生物学の分野の研究者が、細菌Vibrio parahaemolyticusが遊泳細胞と群れ細胞の明確な分化状態でその内部組織をどのように制御するかを探求する道を開きました。このビデオを見れば、細菌Vibrio parahaemolyticusの細胞分化を誘導する方法と、蛍光顕微鏡によるシングルセル分析のために分化したスワーマー細胞の集団を準備する方法についてよく理解できるはずです。
ビブリオ・パラヘモリチカスはヒトの病原体であり、お住まいの地域でのBSL 2病原体の取り扱い方法に関する適切な手順と規制を適用する必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、単一細胞顕微鏡分析のためにビブリオ・パラヘモリティクスを遊走細胞に分化するのを可能にします。細胞培養の準備、遊走分化の誘導、サンプル準備、画像分析をカバーしています。
主要な研究要素
科学分野
- 微生物学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- ビブリオ・パラヘモリティクスは、遊走挙動で知られる細菌です。
- 細胞分化は細菌の形態と機能を理解する上で重要です。
- 単一細胞分析は細胞の組織と挙動への洞察を提供します。
- 細菌コミュニティ内でのイメージングには独特の課題があります。
研究の目的
- ビブリオ・パラヘモリティクスで細胞分化を誘導すること。
- 単一細胞分析用の遊走細胞の集団を作ること。
- 細菌の細胞周期と形態の理解を深めること。
使用された方法
- 遊走プレート用アガー溶液の準備。
- 遊走細胞分化の誘導。
- イメージング分析のための蛍光顕微鏡法。
- 顕微鏡用に単一細胞層の準備。
主な結果
- ビブリオ・パラヘモリティクスから遊走細胞の成功した誘導。
- 効果的なイメージングのための単一細胞層の作成。
- 分化中の細胞内組織への洞察。
- 細菌の形態形成の理解の向上。
結論
- この方法は分析用の遊走細胞の信頼できる誘導を可能にします。
- 細菌分化の研究のフレームワークを提供します。
- 将来の研究は細菌の挙動を探索するためにこの技術を基に構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables reliable induction of bacterial differentiation and isolation of single cells for fluorescence microscopy, addressing a key challenge in studying intracellular organization during phenotypic transitions. By producing a monolayer of differentiated swarmer cells at the edge of swarm colonies, it provides a scalable system for mechanistic de-risking of antimicrobial targets linked to virulence and motility. The approach supports early discovery workflows where phenotypic screening and target validation require quantitative, single-cell resolution data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking chemotaxis protein localization to cellular differentiation states in a human pathogen.
- Operational Value: Provides a reproducible system for phenotypic screening of compounds that disrupt swarmer differentiation or motility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, single-cell-ready samples for high-content imaging assays measuring subcellular protein dynamics.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent swarmer monolayer production, reducing variability in fluorescence readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular mechanisms of differentiation to virulence phenotypes, supporting biomarker identification for anti-infective development.
- Operational Value: Facilitates preclinical continuity by enabling longitudinal tracking of intracellular organization during phenotypic switching.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where phenotypic switching informs target confidence and lead optimization decisions, particularly for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how pathogens regulate intracellular organization during morphogenesis and host adaptation.
- Screening: Delivers assay-ready, differentiated cell populations for compound screening against motility or biofilm formation.
- Analytics: Enables quantitative fluorescence intensity profiling and demographic analysis for objective comparison of cellular states.
- Translational Research: Links molecular differentiation markers to pathogenic potential, informing risk-adjusted target prioritization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying bacterial differentiation across multiple strains or species with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in virulence-related pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of single-cell imaging workflows in containment-required settings.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of phenotypic resistance mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of anti-infective candidates through mechanistic de-risking of colonization and persistence traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture techniques, microscopy, and image analysis software.
- Dependent on access to fluorescence microscopes, agarose preparation tools, and sterile swarming plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between microbiology and imaging groups for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to other bacterial species with different swarming dynamics.
- Includes practical limitations such as the need for BSL-2 compliance when working with V. parahaemolyticus and the time-sensitive use of agarose slides before drying.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
6:11
Results: Single Cell Analysis Reveals Changes in Intracellular Localization of YFP-CheW During V. parahaemolyticus Differentiation
1:14
Induction of Swarmer Cell Differentiation
7:41
Conclusion
3:39
Preparation of V. parahaemolyticus Swarmer Cells for Fluorescence Microscopy
