三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

本プロトコルは、in vitroの神経生物学的モデルまたは神経再生治療への利用を目的として、ミクロンサイズのハイドロゲルマイクロカラム内に、縦方向に整列したアストロサイトの細胞体および突起からなる自己組織化三次元バンドルを作製する方法を指導することを目的としています。外傷や神経変性疾患は、中枢神経系における再生を制限する抑制的環境下での神経新生能の不足により、患者に特に甚大な影響を及ぼします。工学的に作製されたアストロサイトバンドルは、主要な神経解剖学的特徴およびグリア介在性の発生メカニズムを再現することで、標的への細胞遊走および軸索の経路探索を促進し、現在の治療戦略の限界を解消することを目指しています。

これらのアストロサイト・スキャフォールドの構造は、主に吻側移動流のグリアチューブ内にある整列したアストロサイト突起から着想を得ています。まず、滅菌ビーカーに3% w/vのアガロース溶液とDPBSを準備します。溶液が早すぎる段階で凝固しないよう、加熱と撹拌を維持してください。

バルブディスペンサーの底部の開口部に鍼を挿入します。露出した鍼の上にキャピラリーチューブを被せ、チューブの一部をバルブディスペンサーシリンダーのゴム部分に挿入して、2つを固定します。シリンダーにキャップをして組み立てを完了させます。

1 mLの液体アガロースを空のペトリ皿の表面に移します。バルブディスペンサーのゴムキャップをつまみながら、キャピラリーチューブの一端をアガロースに挿入し、キャップの圧力を緩めてアガロースをチューブ内に吸い込みます。バルブ、チューブ、ニードルのアセンブリをペトリ皿に置き、キャピラリーチューブ内でアガロースが凝固するまで5分間静置します。

次に、マイクロカラムを針に装着したまま、針をキャピラリーチューブから引き抜きます。ピンセットの先でマイクロカラムを針の端まで押しやり、針をDPBSが入った開いたペトリ皿の上に保持して、マイクロカラムをDPBSの中へ押し出します。これらの構造体のその後の取り扱いを容易にするためのマイクロカラムボートを作製するには、まず4%（重量/容量）のアガロース溶液を調製し、溶液を加熱・撹拌した状態で保持します。

ピンセットを使用して、マイクロカラムを空のペトリ皿に移動させます。次に、実体顕微鏡下でマイクロメスを用い、マイクロカラムの両端を45度の角度にカットし、所定の長さに切り揃えます。さらに3本のマイクロカラムを同様に切り揃えた後、4本のカラムを平行に並べます。

ピペットに4%アガロース溶液を50 µL分充填し、マイクロカラムアレイの上に液体を線状に滴下して、各構造体を接続してボート状にまとめます。4%アガロースがゲル化するように、1～2分間冷却します。その後、精密ピンセットを使用して、接続部分のアガロースブリッジを持ってマイクロカラムボートを拾い上げます。

そして、DPBSを含むペトリ皿に移します。マイクロカラムボートをバイオセーフティーキャビネットに移動し、紫外線照射により30分間滅菌します。バイオセーフティーキャビネット内で、共培養培地を用いて1 mg/mLのラットテール1型コラーゲン溶液を調製します。

その後、氷上に置きます。ECM溶液のpHを、酸または塩基を用いて、pHが7.2から7.4の範囲で安定するまで調整します。ピンセットを用いて、マイクロカラムボートを35または60 mLのシャーレに移します。

実体顕微鏡で確認しながら、マイクロピペットの10 mLチップを各マイクロカラムの一端に配置し、吸引して管腔内のDPBSと気泡を取り除きます。P10マイクロピペットにコラーゲン溶液を吸い込みます。10 mLチップを各マイクロカラムの一端に当て、管腔を満たす十分な量の溶液を注入します。

次に、マイクロカラムの両端にECMのリザーバーをピペットで分注します。すべてのカラムを満たしたら、カラムの乾燥を防ぐため、ペトリ皿の周囲に共培養培地をリング状にピペットで分注します。細胞を添加する前に、コラーゲンの重合を促進させるため、マイクロカラムを入れた皿を37°C、5% carbon dioxideの条件下で少なくとも1時間インキュベートします。

その後、P10マイクロピペットのチップをマイクロカラムの端に当て、約 5 mL の細胞懸濁液をルーメン内に移して満たします。すべてのマイクロカラムをボートに設置し、37 °C、5% carbon dioxide の条件下で 1 時間インキュベートして、アストロサイトの ECM への接着を促進させます。インキュベーション期間後、マイクロカラムが設置されたディッシュに、35 mL または 60 mL のペトリ皿に応じて、それぞれ 3 mL または 6 mL の共培養培地を慎重に満たします。

プレートしたマイクロカラムと培養液を37°C、5% carbon dioxideで維持し、アストロサイト束の配向した自己組織化を促進させます。これにより、6〜10時間後に束状のケーブルのような構造が形成されます。プレート後1時間では、アストロサイトは球状で、構造体全体に分散しています。プレート後5時間までに、アストロサイトは突起の伸展と収縮を開始します。

播種から8時間後、アストロサイトは整列し、収縮しています。この例では、播種から24時間後までに、アストロサイト突起の緻密な束が形成されています。播種から24時間後のこの完全に形成されたアストロサイト束は、ケーブルの両端が管腔壁の異なる端に付着するジッパー効果を示しています。

このビデオでは、播種から3〜10時間後のバンブリングの様子を示しています。アストロサイト・スキャフォールドの免疫ラベル化により、アストロサイト突起の縦方向の配向が確認できます。このアストロサイト束の共焦点画像では、アストロサイトマーカーであるGFAPが検出されています。

そして、核が青色に見えます。この束をより高倍率で観察することで、マイクロカラム内のアストロサイトの細胞構築を可視化できます。このビデオを視聴することで、バイオマテリアルによる封入の中で、生物学的な細胞構築を持つ縦方向に整列したアストロサイト束からなる生体模倣スキャフォールドを作製できるようになります。

本手順に従い、バイオマテリアルによる被覆の有無にかかわらず、星状細胞束を損傷した脳組織に届ける移植戦略を設計することで、神経発生領域からの指向性細胞遊走を促進し、中枢神経系（CNS）の限定的な微小環境へのガイダンスとして作用させることができます。さらに、この手法は、生体模倣的なモデリングプラットフォームとして拡張可能であり、天然の三次元環境の模倣とin vitroシステムの本来的な実験的制御の利点を活かして、グリア介在性の神経生物学的現象を解析することが可能です。