2018年1月10日
縦一直線に並べられたアストロ サイトの突起と新規の生体材料箱詰め内のプロセスの自己組織化、三次元の束の開発を紹介します。これらは「生活足場」、神経発達メカニズムを研究したり、演出の神経細胞移動や軸索再生に関するを促進するテストベッドとしてセンチメートル長さを拡張する可能性がありますまだミクロン径を展示設計草分け。
このプロトコルは、in vitro神経生物学的モデルまたは神経再生療法として使用するために、ミクロンサイズのハイドロゲルマイクロカラム内の縦方向に整列したアストロサイト体細胞およびプロセスの自己組織化、三次元バンドルの作製をガイドすることを目的としています。外傷および神経変性疾患は、中枢神経系の再生を制限する抑制性環境での神経原性能力の制限により、患者にとって特に有害です。人工アストロサイトバンドルは、主要な神経解剖学的特徴とグリア媒介の発生メカニズムを再現して、標的細胞の移動と軸索経路探索を促進することにより、現在の治療戦略の限界に対処します。
これらのアストロサイト足場の構造は、主に吻側移動流のグリア管における整列したアストロサイトプロセスに触発されています。まず、無菌ビーカーにアガロース溶液とDPBSを容量あたり3%の重量で調製します。溶液が早期に固まるのを防ぐために、加熱と攪拌を維持します。
バルブディスペンサーの下部の開口部に鍼を差し込みます。露出した針の上に毛細管を置き、その一部をバルブディスペンサーシリンダーのゴム部分に挿入して固定します。シリンダーをキャップして組み立てを完了します。
1ミリリットルの液体アガロースを空のシャーレの表面に移します。バルブディスペンサーのゴムキャップをつまみながら、キャピラリーチューブの一端をアガロースに挿入し、キャップの圧力を解放してアガロースをチューブに引き込みます。バルブ、チューブ、ニードルアセンブリをペトリ皿に置き、アガロースをキャピラリーチューブ内で5分間固化させます。
次に、針を毛細管から引き出し、マイクロカラムを針を囲んだままにします。フォレセップの先端を使用してマイクロカラムを針の端に押し込み、次に針を開いたDPBS入りペトリ皿に保持し、マイクロカラムをDPBSに押し込みます。これらのコンストラクトの後の取り扱いを容易にするマイクロコラムボートを製造するには、まず体積あたり4%の重量のアガロース溶液を作成し、溶液を加熱して攪拌し続けます。
鉗子を使用して、マイクロカラムを空のシャーレに移動します。次に、ステレオスコープで作業しながら、マイクロメスを使用してマイクロカラムを目的の長さにトリミングし、両端を45度の角度でカットします。さらに3本のマイクロカラムをトリミングした後、4本のカラムを平行に並べます。
ピペットに50マイクロリットルの4%アガロース溶液をロードし、マイクロカラムアレイ上に液体のラインを分注して、コンストラクトをボートに接続して束ねます。1〜2分間冷まして、4%アガロースのゲル化を可能にします。次に、細い鉗子を使用して、接続しているアガロースブリッジでマイクロコラムボートをピックアップします。
そして、DPBSの入ったシャーレに移します。マイクロコラムボートをバイオセーフティキャビネットに移し、紫外線に30分間さらして滅菌します。バイオセーフティキャビネット内に、共培養培地中のラットテール1型コラーゲンの1ミリグラム/ミリグラムの溶液を調製します。
そして、それを氷の上に置きます。必要に応じて、ECM溶液のpHを酸または塩基で調整し、pHが7.2〜7.4の範囲で安定するまで調整します。マイクロカラムボートを鉗子付きの35または60mLのペトリ皿に移します。
ステレオスコープをガイドとして使用して、マイクロピペットの10mLチップを各マイクロカラムの一方の端に配置し、吸引してDPBSのルーメンと気泡を空にします。P10マイクロピペットにコラーゲン溶液を充填します。10 mLチップを各マイクロカラムの一方の端に当て、内腔を満たすのに十分な溶液を送液します。
次に、マイクロカラムの両端にECMのリザーバーをピペットで移します。すべてのカラムが満たされたら、カラムが乾燥するのを防ぐために、ペトリ皿の周りのリングに共培養培地をピペットで入れます。マイクロカラムを含む皿を摂氏37度、二酸化炭素5%で少なくとも1時間インキュベートして、コラーゲンの重合を促進してから細胞を添加します。
その後、P10マイクロピペットの先端をマイクロカラムの一端に置き、約5 mLの細胞溶液をルーメンに移して充填します。すべてのマイクロカラムをボートに装着した後、摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートし、アストロサイトのECMへの付着を促進します。インキュベーション期間後、着座したマイクロカラムを含むディッシュに、それぞれ35 mLまたは60 mLのペトリ皿用の3 mLまたは6 mLの共培養培地を慎重に充填します。
めっきマイクロカラムと培養を摂氏37度と二酸化炭素5%に維持して、アストロサイトバンドルの整列した自己組織化を促進し、6〜10時間後に束ねられたケーブル状の構造を形成します。めっきの1時間後、アストロサイトは球形になり、構造体全体に分散します。めっき後5時間で、アストロサイトはプロセスの延長と収縮を開始します。
めっき後8時間で、アストロサイトが整列して収縮しています。この例では、めっき後24時間で、アストロサイトプロセスの密集した束が形成されています。この完全に形成されたアストロサイトバンドルは、めっきの24時間後に、ケーブルの端がルーメンの壁の明確な端に付着するジッパー効果を示しています。
このビデオは、めっき後3〜10時間後の結束の動作を示しています。アストロサイトスキャフォールドの免疫標識は、アストロサイトプロセスの縦方向の整列を示しています。このアストロサイトバンドルの共焦点画像では、アストロサイトマーカーGFAPが読み取られます。
そして、原子核は青く見えます。このバンドルの高倍率化により、マイクロカラム内のアストロサイトの細胞構造を可視化することができます。このビデオを見た後、生体材料のケース内に生物学的に触発された細胞構造を持つ縦方向に整列したアストロサイトバンドルからなる生きた足場を作製できるようになるはずです。
この手順に続いて、移植戦略を設計して、生体材料包み込みの有無にかかわらず、アストロサイト束を損傷した脳組織に送達して、神経原性領域からの指向性細胞移動を促進し、制限するCNS微小環境への誘導に作用するように設計できます。さらに、この技術は、ネイティブの3次元環境の模倣とin vitroシステムの固有の実験的制御の恩恵を受けるバイオフィデリックモデリングプラットフォームとして拡張できます。
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この研究は、ミクロンサイズのハイドロゲルマイクロカラム内に縦方向に整列したアストロサイトの体節とプロセスからなる自己組織化された三次元バンドルを製造するためのプロトコルを提示します。これらのエンジニアリングされたアストロサイトバンドルは、重要な神経解剖学的特徴を再現し、神経移行と軸索経路探索を導くことで神経再生を促進することを目的としています。
Engineered aligned astrocyte networks provide a biologically inspired platform to study neurodevelopmental mechanisms and support neuroregeneration strategies. By mimicking natural glial scaffolds, these constructs enable hypothesis testing of axonal pathfinding and neuronal migration in a controlled in vitro system. This approach addresses a key discovery-stage challenge in CNS repair by offering a scalable, reproducible model for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease and neurotrauma research.
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, supporting hypothesis-driven research on glial-guided neuroregeneration.