海馬シータバンドのチューニングインビトロ：隔離されたげっ歯類胸腺腫回路からの記録方法

ここでは、分離された全海馬調製物からのリズミカルなニューロンネットワークのシータおよびガンマ振動を記録するためのプロトコルを提示する。我々は、海馬の抽出からフィールド、ユニタリーおよび全細胞のパッチクランプ記録ならびにテータリズムの光発生ペーシングの詳細までの実験ステップを記載する。

このプロトコルの全体的な目標は、海馬全体の準備を抽出し、フィールド、ユニタリー、パッチクランプ記録、および光遺伝学的刺激を使用してリズミカルなニューロンネットワークの生成を探索する手順を提示することです。この方法は、海馬のリズミカルな振動の根底にある細胞およびシナプスメカニズムの研究を大幅に促進することにより、学習と記憶の神経科学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、最適化された準備を使用して、海馬に依存する記憶情報に重要な役割を果たす詳細な振動の回路を調査することです。

この手順を開始するには、脳を解剖皿に直立させて置き、かみそりの刃で小脳を取り除き、中央矢状面に沿って脳を半分に切断し、2つの孤立した半球を保持チャンバーに戻します。次に、片方の半切除された脳を解剖皿に直立させて置きます。中矢状構造が実験者の方を向くまで皿を回転させ、中隔複合体の埋め込まれた輪郭が視床の内部の組織の薄い洋ナシ形の層として見えるようにします。

次に、コーティングされたヘラを中隔の下に挿入し、解剖皿に到達するまで先端を下に動かし、中隔領域を心から接続する繊維を切断します。次に、中隔の前縁に沿って同じ操作を繰り返し、脳の前部につながる繊維を切断します。へらが海馬のすぐ上にある皮質の内側部分を直立位置で軽く保持し、マイクロヘラを使用して、視床、視床下部、および残りの脳幹核を慎重に引き下げます。

その後、へらを使って引き抜かれた組織を切り取り、取り除きます。その後、コーティングされたへらを背側海馬の吻側端の下の側脳室に挿入します。へらを水平に保持し、半切除された脳の中央矢状面に合わせ、先端が心から現れるまで、心室壁の滑らかな輪郭を滑り

ヘラを海馬の下に保持し、海馬が上にある皮質と結合する内側の層に沿って接続繊維に軽く押し付けてから、この層の外側にマイクロヘラを適用し、コーティングされたヘラに押し付けて、接続繊維をスライスします。抽出を完了するには、解剖皿を回転させ、コーティングされたヘラを腹側海馬の下に挿入します。ヘラで海馬を軽く保持し、へらに対してスライス動作を使用して内分泌接続を切断します。

分離が完了したら、海馬を皿の上に置いたまま、氷のように冷たいショ糖溶液を一滴加えて冷たく保ちます。残っている皮質と繊維を慎重に切り取り、かみそりの刃を円蓋にそっと当てて海馬を中隔から分離します。その後、調製物を室温のショ糖溶液に移し、15〜30分間回復させてから記録チャンバーに移します。

このステップでは、重力供給灌流システムを設定して、酸素化ACSFの連続高速流を可能にします。次に、ACSFの流れを止め、ガラスピペットの広い端を使用して海馬を記録チャンバーに移します。スクロース飽和製剤を沈め、底に沈殿させます。

調製物を記録チャンバーの中央に置き、CA1とsubiculumの滑らかな表面を上にします。中隔肢と側頭部の小さな重量で海馬を安定させ、ACSFの流れを再開します。この手順では、LFP電極を海馬の表面まで下げます。

LFP電極をパラメータ層に進め、個々のニューロンからの単一ユニット放電が検出されると、細胞外スパイク活性が増加するのを観察します。電極をさらに下げると、先端が放射状原子に交差すると、スパイクが再び消え始めることに注意してください。シータ周波数範囲ではっきりと見えるネットワーク振動が明らかになり、記録位置が放射原子を介して下降するにつれて最大振幅に達することを観察します。

CA1領域を横切る自発的なシータ振動の空間特性をテストするには、2番目のLFP電極をCA1サイトに配置し、CA1シータ振動が長距離にわたって同期することを確認します。海馬層全体のシータ振動の特性をテストするには、CA1 radiatom サイトに参照 LFP 電極を残します。層のオリエンスのすぐ上から始めて、2番目の電極をパラメータセル層に下げ、放射原子を通します。

パラメーター層全体で LFP 信号が徐々に反転するのを観察します。無傷の海馬でガンマ振動とシータガンマ結合をテストするには、CA1 subiculum境界にフィールド電極を配置し、パラメータと分子層の間の界面に収まるまで下げます。このレベルでは、局所的なシータリズムに位相がロックされた振幅の変化を伴う明確なガンマ振動を示す電界電位を記録できます。

次に、スケーリングを調整して、シータガンマ結合の低速時間スケールを観察します。ガンマバーストは、進行中のLFP信号中にバンドごとに、低速ガンマ範囲と高速ガンマ範囲で2つの異なる周波数帯域で発生することに注意してください。in vitro海馬シータ振動中の全細胞パッチクランプ記録では、低倍率および高倍率の蛍光ビデオ顕微鏡を使用して、PV tomマウスの海馬調製物の表面近くに位置するtdTomato陽性介在ニューロンを視覚化します。

海馬の低倍率下で、CA1 subiculumにLFP電極を配置し、パッチクランプ実験の準備をしながらシータ振動を監視します。次に、40倍の倍率に切り替えて、ターゲット領域に対物レンズを浸します。最上層が見えるまで下げ、蛍光顕微鏡で蛍光PV tom細胞を選択し、標準的な細胞間溶液を充填したパッチピペットでアプローチします。

全細胞構成になったら、自発的な海馬振動中の同定されたPV細胞の生理学的特性を調べます。PV細胞からの細胞内膜電位記録を観察します。これは、進行中のCA1 subiculum θリズムに同期した高速スパイク挙動と活動電位のバーストから特徴付けられます。この手順では、LFP電極をCA1亜細胞領域に配置し、マウスの孤立した海馬の近くのパラメータ細胞にパッチを当てて、PV介在ニューロンに青色光感受性興奮性オプシンCHR2を発現させます。

光ファイバーライトガイドを海馬の準備物の上に置き、記録された領域の中央に配置します。光遺伝刺激には、シータ周波数で送達される10〜20ミリ秒の光パルスまたは正弦波電圧コマンドで構成されるLED光源からの青色光を使用します。電流クランプでは、自発的なシータ振動中の記録された細胞の活動を特徴付けます。

次に、刺激プロトコルを開始し、光の反応を記録します。場面振動とシナプス活動、および記録されたニューロンは、光遺伝学的刺激中にますます同期し、PV細胞のリズミカルなペーシングがシータ振動の周波数とパワーの両方をしっかりと制御するようになることを観察します。ここに示されているのは、シータ振動中にパラメータセルから記録された電気生理学的活性です。

電流クランプトレースは、安静時の自発的ではあるがリズミカルではない発火と、ゆっくりと出現するLFP振動と明確に同期していない抑制性のシナプス後電位を示しています。電圧クランプの記録は、対応する抑制性シナプス後電流が約マイナス70ミリボルトで反転電位を持っていることを示しています。そして、ここには、シータ振動中の高速スパイク蛍光PV介在ニューロンから記録された電気生理学的活性があります。

電流クランプでは、この細胞は安静時に自発的に発火し、安定したLFP振動と位相的にロックされたリズミカルな興奮性シナプス後電位によって強く駆動されていました。電圧クランプ記録では、興奮性シナプス後電流反転電位はほぼゼロミリボルトでした。一度習得すると、この技術は、この手順を試みながら、それは激しく溶液を酸素化し、電気生理学的記録中に準備の上に武装ACSFの高速しかし安定した流れを可能にする灌流システムを使用することを覚えておくことが重要です、2〜3時間で実行できます。

この手順に続いて、海馬でシータ振動子を形成する細胞サブタイプの同定などの追加の質問に答えるために、光遺伝学刺激や特定の細胞型集団のサイレンシングなどの他の方法を使用できます。その開発後、この技術は、神経科学の分野の研究者が海馬の中隔側頭軸を横切るシータ振動のダイナミクスをin vitroで体系的に探求する道を開きました。このビデオを見た後、フィールド、ユニット、パッチクランプの記録、および光遺伝学的刺激を使用してリズミカルなニューロンネットワークの機能を探求するために、海馬全体の調製物を抽出する方法を十分に理解しているはずです。