N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

本手法の全体的な目的は、酸化アルミニウムコーティングガラススライド上に新しい糖鎖マイクロアレイを構築することにより、HIV抗体のヘテログリカン結合を検出するための、N-糖鎖合成に向けたモジュール式化学酵素的アプローチを開発することです。この手法は、さらなる発展に向けた細胞ウイルス特異的糖鎖の同定という、糖生物学における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、弱い結合を検出し、HIV患者由来の抗体などのタンパク質に結合する糖の混合物を同定できることです。

この手法の意義はインフルエンザ感染の診断にまで及びます。なぜなら、ヒト気道上皮細胞に発現しているシアル酸分解酵素は一般的であり、症状と共通しているためです。したがって、グリコアレイは野生型サブタイプの特異性を決定するための理想的なツールとなります。この方法はHIV抗体の糖鎖特異性に関する知見を提供できるだけでなく、表面にプリントされたヒト特異的血清抗原に対するヒト血清抗体の結合パターンに基づいた様々ながんの診断など、他のシステムにも応用可能です。

この手順を開始するには、あらかじめ調製した2-5 µmolのグリカンを5 mLの丸底フラスコに入れます。フラスコにマグネチックスターラーバーを加え、ゴムセプタムで密閉します。新鮮に脱水した400 µLのDMFと10-25 µmolのホスホン酸リンカーをフラスコに加えます。

次に、反応混合物を800 rpmで5時間撹拌します。反応完了後、ロータリーエバポレーターを用い、真空度5〜10 millibar、温度40 °Cで溶媒を留去します。その後、乾燥させた反応混合物を0.5 mLの水で溶解し、ポリアクリルアミドゲルのベッド上部にロードします。

水を溶離液として生成物を溶出し、1～2 mLの分画を回収します。回収した分画をTLCで確認するには、各分画をTLCプレートにスポットし、プレートを0.25 Mのモリブデン酸アンモニウムセリウム溶液に浸します。染色したプレートをホットプレートで加熱し、生成物を可視化します。

目的物を含む画分を合わせて溶液を凍結乾燥し、目的物を白色粉末として得ます。次に、乾燥させた生成物を2 mLの水に溶解し、水酸化パラジウムを加えます。フラスコに水素を充填したバルーンを取り付け、水素雰囲気下で反応混合物を800 rpmで15時間撹拌します。

反応完了後、混合物をCelite Bedでろ過し、2 mLのメタノールおよび2 mLの脱イオン精製水で洗浄します。次に、ロータリーエバポレーターを用いて、真空度300 millibar、温度40 °Cで溶媒を留去します。その後、粗混合物を約1 mLの水に溶解し、ポリアクリルアミドゲルベッドの上にアプライします。

水を用いて生成物を溶出し、1～2 mLの分画を回収します。生成物を含む分画を合わせ、溶液を凍結させた後、凍結乾燥して目的の生成物を白色粉末として得ます。生成物が乾燥したら、重水（Deuterium Oxide）を溶媒として用い、NMRおよび質量分析により特性評価を行います。

表面陽極酸化のため、温度制御インキュベーターを4 °Cに設定します。次に、あらかじめ調製した0.3 Mのシュウ酸水溶液を、マグネチックスターラーバーを入れた500 mLビーカーに移します。陰極として、長さ10 cmの白金棒を溶液の中に設置します。

陽極酸化プロセス全体を通じて、シュウ酸を300 rpmで撹拌し続けてください。ラボトレーサーソフトウェアでセットアップボタンをクリックし、次に機能選択のSweep Voltageをクリックします。開始電圧と停止電圧を25.8 voltsに設定してください。

データ点数を100に、コンプライアンスを1に、スイープ遅延を1200ミリ秒に設定します。その後、「OK」をクリックします。アルミニウムコーティングされたガラススライドをカソードに向けて固定します。

「run test」ボタンをクリックし、現在の測定値を確認します。表面陽極酸化後、ガラススライドを二回蒸留水で十分に洗浄し、窒素ガスでブローして乾燥させます。ガラススライドは、次に使用するまで相対湿度30%のチャンバー内で保存してください。

作製にあたり、すべての1価糖鎖をエチレングリコール中で10 millimolar濃度になるようにし、100 microlitersの溶液を調製します。これらの糖鎖溶液をプリンティングバッファーで希釈し、100 micromolar溶液を作成します。ヘテロリガンド研究では、各糖鎖溶液5 microlitersにMAN-5 Glycanを5 microliters加えます。

準備したグリカンを、マイクロアレイプリント工程用の384ウェルマイクロプレートに移します。プリンターアレイテックにマイクロプレートをセットした後、ロボットピンを用いて、アルミニウムコートガラススライドの各点にグリカン溶液を0.6 nanolitersずつ滴下し、マイクロアレイをプリントします。次に、一次抗体PG-9の70 microlitersと、3%BSAを含むPTSBバッファーを準備します。

次に、遮光下で、二次蛍光標識抗体（Donkey Anti-human Immunoglobulin G）120 µLと、3% BSA含有PBSTバッファーを準備します。PG9と二次蛍光標識抗体を1:1の比率で混合します。その後、混合した抗体を4 °Cで30分間インキュベートします。

インキュベーション後、16個のウェルに分割されたスライドインキュベーションチャンバーに、アルミニウムコーティングされたガラススライドをセットします。あらかじめ混合した抗体 100 microliters をグリカンアレイに分注します。4 °Cで16時間インキュベートした後、ピペットを用いてグリカンアレイから混合抗体を除去し、スライドインキュベーションチャンバーを取り除きます。

ガラススライドをPBSTバッファーおよび脱イオン水で洗浄します。その後、2000 ×gでスピン乾燥させます。次に、マイクロアレイ画像解析ソフトウェアを起動します。

ガラス乾燥スライドを、アレイ化された特徴面を下に向けてアレースキャナーに挿入します。設定メニューをクリックします。画像解像度を1ピクセルあたり5 µmに設定します。

波長を635 nanometersに設定し、PMTを450、出力を100%にします。スキャンボタンをクリックして、スライドのイメージングを開始します。最後に、ファイルアイコンをクリックして、画像解析用にスキャン画像をTIF形式で保存します。本研究では、モジュール式化学酵素的戦略を用いて、広範なN-Glycansを合成しました。

この戦略の有効性を実証するため、化学酵素的合成法を用いて二分枝等長構造を合成しました。二糖類 1 の酵素的ガラクトシル化に続き、三糖類 2 のフコシル化を行うことで、目的の四糖類 3 を得ました。ビルディングブロック 2 および 3 のペルアセチル化および還元末端の修飾により、目的の分子 4 および 5 が得られました。

三糖 6 のモジュール 4 に対する立体選択的な 3 回の O-グリコシル化により、六糖 7 が得られた。脱保護およびモジュール 5 との反応により、十糖 9 が得られた。全脱保護を行うことでグリカン 10 が得られ、NMR および質量分析によって特性評価を行った。

還元末端にペンチルアミン尾部を持つ糖鎖をホスホン酸リンカーで修飾し、ホスフィニド化学を用いてアルミニウムガラスコーティング表面に結合させました。広範中和HIV-1抗体PG9を用いて、ホモ糖鎖およびヘテロ糖鎖アレイによる糖鎖特異性のスクリーニングを行い、HIV-1 gp120表面のV1/V2ループにおける隣接するヘテロ糖鎖との相互作用を初めて実証しました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、糖鎖の固定化からベータ解析までを24時間で完了させることが可能です。

この手順を行う際は、Glycan 10に対して、陽極酸化処理をしたばかりのアルミニウムコーティングガラススライドを使用することが重要です。この手順では、医療技術者用スライドを使用します。目的の糖質とタンパク質の間の結合相互作用を定量化するために、ボディ定数の決定を行うことができます。

本技術の開発により、ケニアにおける感染症での炭水化物の役割への理解が深まり、疾患に対する新たな治療法の開発に道が開かれました。毒性物質を扱う際は非常に危険であるため、実験を行う際は常に、衣服、ゴーグル、マスクの着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。