Name: N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学ぼう、化学酵素合成法によるN型糖鎖アレイの構築とHIV広域中和抗体の結合プロファイリング手法。この技術は弱い結合を検出し、糖鎖特異性の理解と感染症診断への応用に貢献します。

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著者は、薄いフィルム技術部門、楽器技術研究センター (ITRC) と国立応用研究所、台湾・新竹サイエン スパークにありがとうございます。この作品は、国家科学委員会によって支えられた (付与なし。ほとんど 105-0210-01-13-01) と中央研究院。

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<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5499/performing-1d-thin-layer-chromatography">Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>de Castro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+approach+to+the+automation+of+analytical+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Automat+Chem%22%5BJournal%5D)">A useful approach to the automation of analytical processes?</a> J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5634/introduction-to-mass-spectrometry">Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
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<li><a target="_blank" href="https://classes.soe.ucsc.edu/bme210/Spring07/GenePix_Pro_6.0_Manual_RevL.pdf">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial</a>. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).</li>
<li>GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from:
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

HIV 1 菌株を循環の 70-80% の中和に非常に強力なことは、HIV-1 bNAbs PGTs 128、PG16、PG9 141-145 を含むのクラスが報告されました。これらの bNAbs のエピトープが全体の HIV-1 グループ M の変種の間で非常に節約される、従って彼らは23,抗体中和24,25 を引き出すために HIV ワクチンの有効な免疫原設計をガイドがあります。.、HIV-1 広く中和抗体の糖鎖エピトープを識別するために私たちの継続的な努力の一環としてパネル高マンノース、ハイブリッド、および糖鎖アレイ21、を形成する複合型糖鎖の化学的合成を報告しました。 22。ただし、 N-コーティング (NHS) スライド ガラスに一般的に使用される糖鎖配列がおそらくのために異種の糖鎖の分布の加水分解から生じる...

糖タンパク質糖鎖のN共有にリンクされて、アスパラギン コンセンサス Asn-Xxx-セリン/スレオニン sequon の (Asn) 残基蛋白質の構造、抗原性、溶解性、レクチン認識などいくつかの生物学的プロセスに影響を与える1,2。 Nの化学合成-糖鎖は彼らの巨大な構造マイクロ不均一性と高分岐建築のため重要な合成挑戦を表します。保護を慎重に選択グループ ビルディング ブロック、アノマー中心とプロモーターの適切な使用に選択性を達成するための反応性を調整する/activator(s) 複雑なオリゴ糖の合成における重要な要素です。N型糖鎖の合成を進める作業の偉大な量が報告された複雑なこの問題を解決するために最近3,4。これらの堅牢なアプローチにもかかわらず、(〜 20,000) 残る主要な挑戦のN型糖鎖の広い範囲の準備のための効果的な方法を見つけること。
広範な遺伝的多様性と中和抗体から脱出する能力を達成するために HIV-1 の急速な突然変異率は HIV 15,6に対して安全と予防ワクチンの開発に最大の課題の一つです。,7. HIV を使用してホストの免疫反応を回避する 1 つの効果的な戦術は多様なN封筒糖蛋白質 gp120 の翻訳後修飾糖鎖-ホスト糖機械8から派生した糖鎖のリンク 9。人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞からの組換えの単量体 1 HIV gp120 糖鎖の精密解析に関する最近の報告書は、セル固有の特徴10構造異種性の発生を示唆しています。,11,12します。 したがって、HIV-1 bNAbs の糖鎖特異性も特徴と gp120 が必要です理解関連N型糖鎖構造解析のための十分な量で。
糖鎖マイクロ アレイの技術の発見は、炭水化物結合蛋白質、ウイルス/細菌アドヘシン、毒素、抗体、および lectines1314,の多様な範囲の特異性の高スループットに基づく探査を提供.アレイ チップ ベース形式で体系的な糖鎖の配置は、多価プレゼンテーション15,16,17,18まで問題となる低親和性タンパク質糖鎖の相互作用を決定でした。このチップに基づく糖鎖の配置が効果的に細胞インターフェイスを模倣する便利に表示されます。技術を豊かにし従来の配列形式に関連付けられているムラの問題を克服する、私たちのグループは最近ホスホン酸終わった糖鎖を使用して信号強度を高めるのに酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの糖鎖アレイを開発均一性、そして感度19,20。
新たに単離した HIV 1 広く中和抗体 (bNAbs) の糖鎖エピトープに関する現在の理解を向上させるため、我々 はNの広範な配列の準備のための高効率モジュール戦略を開発している-リンク糖鎖21 、、ACG に印刷される22スライド (図 1参照)。ACG 配列の HIV-1 bNAbs のプロファイリング研究を提供して非常に強力な bNAb HIV からが分離された PG9 のヘテロ糖鎖連結動作の異常検出感染個人23,24,25特異性。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75058</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108247</td><td></td></tr><tr><td>無水硫酸マグネシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7487889</td><td></td></tr><tr><td>三フッ化ホウ素エチルエーテル酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109637</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048468</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P2 polyacrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td></td></tr><tr><td>ビス(シクロペンタジエニル)ハフニウム(IV) 二塩化</td>物 <td>Sigma Aldrich</td><td>12116664</td><td></td></tr><tr><td>&β;-1,4 牛乳からのガラクトシルトランスフェラーゼ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48279</td><td></td></tr><tr><td>BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)</td><td>Arrayit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モリブデン酸アンモ</td>ニウム <td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>硝酸アンモニウムセリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16774213</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス&nbsp;</td><td>ショット&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シチジン-5&prime;-モノホスホ-N-アセチルノイラミン酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>3063716</td><td></td></tr><tr><td>重水素化クロロホルム</td><td>Σ Aldrich</td><td>865496</td><td></td></tr><tr><td>ロバ 抗ヒト IgG (Alexa Fluor647 結合</td><td>Jackson Immuno Research, USA</td><td>709605098</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Σ Aldrich</td><td>75092</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルアミノ硫黄三フッ化物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38078090</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68122</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エ</td><td>チル Sigma Aldrich</td><td>141786</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>Acros 有機</td><td>107211</td><td></td></tr><tr><td>FASTフレームスライドインキュベーションチャンバー</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5'-ジホスホ-b-L-フコース二ナトリウム塩&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15839700</td><td></td></tr><tr><td>Lab tracer 2.0ソフトウェア&nbsp;</td><td></td><td></td><td>プロトコル</td></tr><tr><td>GenePix Pro 4300Aリーダー(マイクロアレイ画像解析)</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>GraphPad Prismソフトウェア(画像処理)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td>http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</td></tr> <tr><td>水酸化リチウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310652</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>7773015</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>N-ブタノール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>71363</td><td></td></tr><tr><td>シュウ酸</td><td>アクロス 有機</td><td>144627</td><td></td></tr><tr><td>パラジウム 水酸化物</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>12135227</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10010023 ピリジン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>110861</td><td></td></tr><tr><td>P-トルエン スルホン酸 一水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>773476</td><td></td></tr><tr><td>シルバー トリフレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2923286</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム炭酸水素塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムメトキシド&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>124414</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>7757826</td><td></td></tr><tr><td>トルエン&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>108883</td><td></td></tr><tr><td>トリスバッファ&nbsp;</td><td>アムレスコ</td><td>N/A</td><td>超高純度グレード</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>アムレスコ</td><td>9005645</td><td></td></tr><tr><td>ウリジン二リン酸ガラクトース(UDP-ガラクトース)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>137868521</td><td></td></tr></tbody></table>

n型糖鎖アレイ開発および hiv 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Nの広い範囲の急速な準備のための非常に効率的な方法を提案する-人間の糖タンパク質でよく見られる (20,000 構造を超過する推定) オリゴ糖をリンクします。目的の構造の多様性を達成するために戦略から始まった、3 -Oと 6 -Oで彼らの段階的 α-選択的グリコシル化に続いて、oligosaccharyl フッ化物モジュールの 3 種類の化学酵素合成の位置、重要な β-マンノシドのリンケージを持つ共通のコア三のマンノース残基。我々 はさらに、HIV 抗体とヘテロ-リガンド相互作用の分析のための共有結合混合配列を作成する酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの表面にN型糖鎖を添付しました。特に、バインディング動作を新たに単離した HIV 1 広く中和抗体 (bNAb)、PG9、密接に間隔をあけられた男5GlcNAc2の混合物の (男5) と 2, 6-ジ-還元末端 bi antennary 複合型N型糖鎖 (SCT) ACG 配列の HIV ワクチン開発のための効果的な免疫原設計に新しい道を開きます。また、ACG 配列は異種リガンド結合動作の他の HIV 抗体を研究する強力なツールを体現しています。

さまざまなN 型糖鎖の合成のためのモジュラー化学酵素の作戦は、図 1で示されます。戦略は、3 -Oおよび/または 6 -Oで α 固有マンノシル化に続いて、3 つの重要なモジュールの化学酵素合成法による初めの多様性を作成ことができますという事実に基づく共通のマンノース残基の位置N型糖鎖のコア三糖類です。Bi、トリ、テトラ antennary 複合型N型糖鎖構造の構造多様性を考慮した oligosaccharyl ドナーとプリインストールされているアルキル handlecould とコア三糖類受容体のセットの開始として使用することを信じた目的の構造多様性 (図 1) を生成するための材料。糖供与体フッ化物複雑な糖鎖のライブラリを構築する上での有効性は以前21を実証されています。
<p class="jove_co...

酸化アルミニウム コーティング ガラスに添付ファイルのN型糖鎖の合成にモジュラー アプローチは、糖鎖マイクロ アレイを開発し、広く中和抗体、HIV のプロファイリングの使用が示されている (ACG スライド) をスライドさせます。

N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

本手法の全体的な目的は、酸化アルミニウムコーティングガラススライド上に新しい糖鎖マイクロアレイを構築することにより、HIV抗体のヘテログリカン結合を検出するための、N-糖鎖合成に向けたモジュール式化学酵素的アプローチを開発することです。この手法は、さらなる発展に向けた細胞ウイルス特異的糖鎖の同定という、糖生物学における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、弱い結合を検出し、HIV患者由来の抗体などのタンパク質に結合する糖の混合物を同定できることです。この手法の意義はインフルエンザ感染の診断にまで及びます。なぜなら、ヒト気道上皮細胞に発現しているシアル酸分解酵素は一般的であり、症状と共通しているためです。したがって、グリコアレイは野生型サブタイプの特異性を決定するための理想的なツールとなります。この方法はHIV抗体の糖鎖特異性に関する知見を提供できるだけでなく、表面にプリントされたヒト特異的血清抗原に対するヒト血清抗体の結合パターンに基づいた様々ながんの診断など、他のシステムにも応用可能です。この手順を開始するには、あらかじめ調製した2-5 µmolのグリカンを5 mLの丸底フラスコに入れます。フラスコにマグネチックスターラーバーを加え、ゴムセプタムで密閉します。新鮮に脱水した400 µLのDMFと10-25 µmolのホスホン酸リンカーをフラスコに加えます。次に、反応混合物を800 rpmで5時間撹拌します。反応完了後、ロータリーエバポレーターを用い、真空度5〜10 millibar、温度40 °Cで溶媒を留去します。その後、乾燥させた反応混合物を0.5 mLの水で溶解し、ポリアクリルアミドゲルのベッド上部にロードします。水を溶離液として生成物を溶出し、1～2 mLの分画を回収します。回収した分画をTLCで確認するには、各分画をTLCプレートにスポットし、プレートを0.25 Mのモリブデン酸アンモニウムセリウム溶液に浸します。染色したプレートをホットプレートで加熱し、生成物を可視化します。目的物を含む画分を合わせて溶液を凍結乾燥し、目的物を白色粉末として得ます。次に、乾燥させた生成物を2 mLの水に溶解し、水酸化パラジウムを加えます。フラスコに水素を充填したバルーンを取り付け、水素雰囲気下で反応混合物を800 rpmで15時間撹拌します。反応完了後、混合物をCelite Bedでろ過し、2 mLのメタノールおよび2 mLの脱イオン精製水で洗浄します。次に、ロータリーエバポレーターを用いて、真空度300 millibar、温度40 °Cで溶媒を留去します。その後、粗混合物を約1 mLの水に溶解し、ポリアクリルアミドゲルベッドの上にアプライします。水を用いて生成物を溶出し、1～2 mLの分画を回収します。生成物を含む分画を合わせ、溶液を凍結させた後、凍結乾燥して目的の生成物を白色粉末として得ます。生成物が乾燥したら、重水（Deuterium Oxide）を溶媒として用い、NMRおよび質量分析により特性評価を行います。表面陽極酸化のため、温度制御インキュベーターを4 °Cに設定します。次に、あらかじめ調製した0.3 Mのシュウ酸水溶液を、マグネチックスターラーバーを入れた500 mLビーカーに移します。陰極として、長さ10 cmの白金棒を溶液の中に設置します。陽極酸化プロセス全体を通じて、シュウ酸を300 rpmで撹拌し続けてください。ラボトレーサーソフトウェアでセットアップボタンをクリックし、次に機能選択のSweep Voltageをクリックします。開始電圧と停止電圧を25.8 voltsに設定してください。データ点数を100に、コンプライアンスを1に、スイープ遅延を1200ミリ秒に設定します。その後、「OK」をクリックします。アルミニウムコーティングされたガラススライドをカソードに向けて固定します。「run test」ボタンをクリックし、現在の測定値を確認します。表面陽極酸化後、ガラススライドを二回蒸留水で十分に洗浄し、窒素ガスでブローして乾燥させます。ガラススライドは、次に使用するまで相対湿度30%のチャンバー内で保存してください。作製にあたり、すべての1価糖鎖をエチレングリコール中で10 millimolar濃度になるようにし、100 microlitersの溶液を調製します。これらの糖鎖溶液をプリンティングバッファーで希釈し、100 micromolar溶液を作成します。ヘテロリガンド研究では、各糖鎖溶液5 microlitersにMAN-5 Glycanを5 microliters加えます。準備したグリカンを、マイクロアレイプリント工程用の384ウェルマイクロプレートに移します。プリンターアレイテックにマイクロプレートをセットした後、ロボットピンを用いて、アルミニウムコートガラススライドの各点にグリカン溶液を0.6 nanolitersずつ滴下し、マイクロアレイをプリントします。次に、一次抗体PG-9の70 microlitersと、3%BSAを含むPTSBバッファーを準備します。次に、遮光下で、二次蛍光標識抗体（Donkey Anti-human Immunoglobulin G）120 µLと、3% BSA含有PBSTバッファーを準備します。PG9と二次蛍光標識抗体を1:1の比率で混合します。その後、混合した抗体を4 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、16個のウェルに分割されたスライドインキュベーションチャンバーに、アルミニウムコーティングされたガラススライドをセットします。あらかじめ混合した抗体 100 microliters をグリカンアレイに分注します。4 °Cで16時間インキュベートした後、ピペットを用いてグリカンアレイから混合抗体を除去し、スライドインキュベーションチャンバーを取り除きます。ガラススライドをPBSTバッファーおよび脱イオン水で洗浄します。その後、2000 ×gでスピン乾燥させます。次に、マイクロアレイ画像解析ソフトウェアを起動します。ガラス乾燥スライドを、アレイ化された特徴面を下に向けてアレースキャナーに挿入します。設定メニューをクリックします。画像解像度を1ピクセルあたり5 µmに設定します。波長を635 nanometersに設定し、PMTを450、出力を100%にします。スキャンボタンをクリックして、スライドのイメージングを開始します。最後に、ファイルアイコンをクリックして、画像解析用にスキャン画像をTIF形式で保存します。本研究では、モジュール式化学酵素的戦略を用いて、広範なN-Glycansを合成しました。この戦略の有効性を実証するため、化学酵素的合成法を用いて二分枝等長構造を合成しました。二糖類 1 の酵素的ガラクトシル化に続き、三糖類 2 のフコシル化を行うことで、目的の四糖類 3 を得ました。ビルディングブロック 2 および 3 のペルアセチル化および還元末端の修飾により、目的の分子 4 および 5 が得られました。三糖 6 のモジュール 4 に対する立体選択的な 3 回の O-グリコシル化により、六糖 7 が得られた。脱保護およびモジュール 5 との反応により、十糖 9 が得られた。全脱保護を行うことでグリカン 10 が得られ、NMR および質量分析によって特性評価を行った。還元末端にペンチルアミン尾部を持つ糖鎖をホスホン酸リンカーで修飾し、ホスフィニド化学を用いてアルミニウムガラスコーティング表面に結合させました。広範中和HIV-1抗体PG9を用いて、ホモ糖鎖およびヘテロ糖鎖アレイによる糖鎖特異性のスクリーニングを行い、HIV-1 gp120表面のV1/V2ループにおける隣接するヘテロ糖鎖との相互作用を初めて実証しました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、糖鎖の固定化からベータ解析までを24時間で完了させることが可能です。この手順を行う際は、Glycan 10に対して、陽極酸化処理をしたばかりのアルミニウムコーティングガラススライドを使用することが重要です。この手順では、医療技術者用スライドを使用します。目的の糖質とタンパク質の間の結合相互作用を定量化するために、ボディ定数の決定を行うことができます。本技術の開発により、ケニアにおける感染症での炭水化物の役割への理解が深まり、疾患に対する新たな治療法の開発に道が開かれました。毒性物質を扱う際は非常に危険であるため、実験を行う際は常に、衣服、ゴーグル、マスクの着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

chemo-enzymatic-synthesis-n-glycans-for-array-development-hiv

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

ナノモル親和性HIV - 1BA - Lのgp120に対するいくつかの2'...

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

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シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。...

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表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

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チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

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学ぼう、化学酵素合成法によるN型糖鎖アレイの構築とHIV広域中和抗体の結合プロファイリング手法。この技術は弱い結合を検出し、糖鎖特異性の理解と感染症診断への応用に貢献します。

N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

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