新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養
July 11th, 2017
この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。
この手順の全体的な目標は、さまざまな実験で使用できる脊髄ニューロンを繰り返し一貫して分離できるようにすることです。この方法により、脊髄ニューロンの生物学についてより深い洞察を得ることができ、うまくいけば、さまざまなストレッサーに対する脊髄ニューロンの応答を理解することができます。この手法の主な利点は、かなりの数のニューロンを分離できるため、それらのニューロンをさまざまな実験で使用できることです。
ニューロンが組織から機械的に単離されるトリチュレーションステップは、ニューロンを殺さずに健康なニューロンの分離を確保するために習得するのに時間がかかるため、この方法を視覚的に示示することは非常に重要です。この手順を開始するには、はさみを使用して、安楽死させたマウスの子犬の体から頭を分離します。次に、背側を上にして、尾と腕を処置台の上で安定させます。
次に、湾曲した虹彩ばさみを使用して皮膚を切り取ります。その後、腰部から腰のすぐ上まで脊髄を切除し、次に胸部の両側を切断して体から分離します。5ミリリットルの滅菌PBSをそれぞれ10秒間含んだ3つの10センチメートルシャーレでサンプルを順番に洗浄し、余分な組織を取り除きます。
続いて、5ミリリットルの滅菌PBSを充填した22ゲージの針とシリンジを脊柱の尾側端に挿入し、頭蓋で洗い流し、コードを4番目のシャーレに排出できるようにします。氷上に5ミリリットルのHABGを入れた15ミリリットルのチューブで脊髄を移します。脊髄をつぶさないようにし、残りの子犬についてもこの手順を繰り返します。
理想的には、このプロセスは、ニューロンの分離を確実にするために、子犬の1つのグループに対して30分以内で完了する必要があります。密度勾配を準備するには、4つの15ミリリットルチューブに4つの層のそれぞれを準備します。次に、各層の1ミリリットルを新しい15ミリリットルのチューブに追加します。
一番下のレイヤー 1 から始めて、一番上のレイヤー 4 に到達するまで順番に追加します。追加中にレイヤーを乱したり、激しい動きをしたりして、ミキシングの原因となる可能性があります。次に、刻んだ組織に消化培地を加えます。
サンプルを摂氏30度のウォーターバスのシェーカーに入れます。その後、ティッシュをウォーターバスから取り出し、数分間落ち着かせます。トリチュレーションを行うには、余分な消化媒体を吸引します。
ナローボアピペットを使用して組織を2ミリリットルのHABGに懸濁し、45秒で10回回転させ、空気の導入を避けると生存率が大幅に低下します。トリチュレーションは、手順の最も重要なステップの1つであり、組織は慎重に火で磨かれたピペットに引き込まれ、空にされるべきであり、ニューロンの死につながる可能性のある過度の活力を避けたり、穏やかになりすぎて歩留まりが低下したりすることはありません。その後、上清の上部2ミリリットルを吸引し、ラベル付けされた新しい15ミリリットルのチューブに移します。
収集手順をさらに2回繰り返して、6ミリリットルの上清を生成します。次に、収集チューブの内容物を事前に準備したグラジエントチューブにゆっくりと移します。勾配の乱れを回避します。
ニューロンを精製するには、グラジエントチューブをGの800倍、摂氏22度で15分間遠心分離します。目的のレイヤーを収集し、新しい15ミリリットルチューブに移します。最高純度のニューロン単離を得るには、第3層を収集します。
より少ない純度でより多くの収率を得るには、層2〜3を収集します。次に、新しく収集した層に5ミリリットルのHABGを追加して、密度勾配を希釈します。Gの200倍で、摂氏22度で2分間遠心分離します。
2分後、上清を捨て、口蓋をフリックして細胞を5ミリリットルのHABGに再懸濁します。その後、サンプルをGの200倍で22°Cで2分間再び遠心分離します。次に、上清を捨て、口蓋をフリックして、細胞を3ミリリットルの神経基底培地に再懸濁します。
その後、セルカウンターを使用して細胞密度を決定し、次いで、懸濁液を神経基礎培地1ミリリットルあたり300, 000細胞に希釈する。穏やかに振とうして細胞と溶液を分散させ、コード化された24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルのサンプルを加えます。ここに示されているのは、ウェルに播種した後の培養中のニューロンの時間経過です。
細胞は通常、最初の数時間以内に表面に付着し始めます。軸索は最初の24〜48時間以内に発芽し始め、さまざまなニューロンと培養との間の接続は、通常7日で成熟し、その時点で、ニューロンで実験が通常行われます。この図では、核染色を青色、細胞質染色を緑色で示し、ここでは、ニューロンの細胞骨格タンパク質微小管関連タンパク質2を染色し、培養後1週間後のニューロンの輪郭と軸索突起を示しています。
結合された画像は結合され、ニューロンの相対的な存在量を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、3〜4時間で完了できます。その開発後、この技術は、脊髄の生理学と病理学を研究する研究者が、通常の条件下で、そして薬理学的物質や酸素やグルコース欠乏などのストレッサーに応答して、私たちの外科的処置を模倣して脊髄ニューロンの振る舞いを探求する道を開きます。
この手順を実行するときは、不健康なニューロンの分離を防ぐために、手順を遅らせたり長引かせたりしないようにすることが重要です。このビデオを見た後、無血清培地で培養できる新生児マウスの脊髄から健康で生存可能なニューロンを分離する方法について十分に理解しているはずです。
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概要
この研究は、WT新生マウスから神経細胞を分離する技術を提示し、脊髄の解剖と機械的および酵素的方法による神経細胞の分離に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 神経生物学技術
背景
- 脊髄神経細胞の分離は、様々な実験応用にとって重要です。
- 神経細胞の生物学の理解は、ストレス要因に対するそれらの反応についての洞察を提供できます。
- 三攪拌ステップの習得は、健康な神経細胞分離に不可欠です。
- 視覚的な実演は、この複雑な技術の学習を強化します。
研究の目的
- 脊髄神経細胞を分離するための信頼できる方法を開発すること。
- 神経細胞生物学を調査する実験を促進すること。
- 異なるストレス要因に対する神経細胞の反応についての理解を深めること。
使用された方法
- 新生マウスからの脊髄の解剖。
- 神経細胞を分離するための機械的および酵素的切断。
- 神経細胞の生存を確保するための慎重な取り扱い。
- 三攪拌プロセスを実演するための視覚的補助。
主要な結果
- この技術を用いて多数の神経細胞を分離できます。
- この方法は、神経細胞の一貫した繰り返し可能な分離を可能にします。
- 様々な実験用途に健康な神経細胞を入手できます。
- 視覚的な実演は技術の習得に役立ちます。
結論
- 開発された技術は脊髄神経細胞の分離に効果的です。
- 神経細胞生物学のさらなる研究の基礎を提供します。
- この方法の習得は、実験結果の改善につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and culture of spinal cord neurons from neonatal mice enables high-fidelity in vitro models for early neurobiology discovery and mechanistic de-risking. This capability supports predictive confidence in target validation and functional screening for neurodegenerative and neuroregenerative research portfolios. Consistent neuron yield and viability underpin scalable assay development and translational continuity across preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal response to pharmacological agents and stressors in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary neuron cultures for pathway analysis.
- Facilitates functional target validation through reproducible neuron isolation and culture.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-yield neuron preparations for quantitative assay development.
- Ensures reproducibility and scalability for compound screening and phenotypic analysis.
- Delivers validated neuronal systems suitable for downstream high-content or functional assays.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of disease-relevant neuronal responses to injury or deprivation in vitro.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo preclinical models for translational biomarker exploration.
- Reduces biological risk by providing continuity from discovery through preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
This neuron isolation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuronal pathways and stress responses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables measurement of neuronal viability, maturation, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights with in vivo preclinical models when aligned with disease context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neurobiology and pharmacology studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible neuron preparations for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in neonatal dissection and trituration for optimal neuron viability.
- Needs access to sterile instrumentation, density gradient materials, and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of isolation and culture steps for reproducibility.
- Adaptation may be necessary for different mouse strains or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to timing and handling, impacting downstream assay reliability.
