Name: 新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルス救出法。2プラスミッド系を用いて安定した感染性ウイルスを回収し、フラビウイルス学におけるワクチン開発や病原性研究に応用可能です。

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著者らは、クローン由来ウイルスの特徴づけを支援してくれたKristen Bullard-Feibelman、Milena Veselinovic、ClaudiaRückertに感謝したいと思います。この研究は、NIHのAI114675（BJG）およびAI067380（GDE）の下での国立アレルギーおよび感染症研究所の助成によって部分的に支持された。

感染性クローンプラスミドの形質転換および回収<ol><li> いくつかの改変を加えた市販の形質転換プロトコール（ 例えば 、NEB 5分形質転換プロトコル）を用いて両方のプラスミド（別々に）を形質転換する。どちらのプラスミドもアンピシリン耐性をコードする遺伝子を含んでいるため、選択のためにアンピシリンまたはカルベニシリンを使用する。より安定であるので、カルベニシリンが好ましい。 <ol><li> -80°Cの冷凍庫から細胞を取り出し（材料表を参照）、氷上で5〜10分間解凍する。 （LB-carb）と呼ばれるPrewarm lysogeny broth（LB）（10g / LのNaClおよび25μg/ mLのカルベニシリンを含む）プレートおよびカタボライト抑制を有するブロス（抗生物質を含まないSOC-細胞とともに）37℃。 </li><li> 1μLのプラスミドDNA中100μg〜10ngをコンピテント細胞50μLを含むチューブに加える;チューブを軽く叩いて軽く混ぜる。 </li><li>チューブを氷上で5分間インキュベートする。 </li><li> 42℃30秒間の熱ショックチューブ水浴中で。熱ショックの直後に2分間氷に戻す。 </li><li> 950μLの室温SOCを各チューブにピペットで分注し、ピペットで混合します。 100μLの細菌混合物をLB-炭プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートする（約12-14時間）。 </li></ol></li><li> 12〜14時間のインキュベーション後に37℃のインキュベーターからプレートを取り除きます。コロニーを（約8〜9時間）増殖させ続けることができるように、プレートを室温の暗い引き出しに置きます。 </li><li> 5 mLのTerrificブロス（TB、25μg/ mLのカルベニシリンを含む、TB-carbと呼ばれる）を使用して、細菌シェーカー（およそ14〜16時間）中30℃で一晩各プラスミドについて5〜10個の小さなコロニーを増殖させます。 注：小さなコロニーは、プラスミドが無傷であることを示す指標です。欠失、再編成または突然変異（本明細書では不安定性事象と呼ばれる）を含むプラスミドを有するコロニーは、より速く増殖し、したがってより大きくなる。したがって、プレート上で最小のコロニーを選択しようとする必要があります。存在する最大のコロニーを選択する。いくつかの中位のコロニーもまた完全性のために選択することができる。使用される温度が低いほど、細胞が繁殖する確率が低下する（OD 600が0.6-0.8を超える）。ほとんどの研究者が一晩成長するので、より多くの制御と過成長の可能性を減らすことができます。 </li><li>液体培養物の濁度（約OD 600が0.6〜0.8）をチェックする。 4℃で濁ったチューブを置き、他のチューブを長く濁らせる。 注：プラスミドの不安定性事象が発生する可能性があるため、バクテリアを推奨値を超えるOD 600値まで増殖させないでください。 </li><li>市販のプラスミドミニプレップキット（材料表を参照）を用いてバクテリアからプラスミドDNAを抽出する。予め加熱した（加熱ブロック中70℃まで）溶出緩衝液15μLで溶出する。溶出緩衝液をカラム上で5分間インキュベートしてから遠心分離にかける。 注：4℃でこのスターター培養物を少なくとも1mL保存してください。次のステップでさらに使用します。 </li><li>培養中にプラスミドの不安定性事象が発生したかどうかを評価するために、回収したプラスミド10μLを消化する。 注：pIをSalI / NheIで、p2をBamHI / HindIIIで37℃で1時間消化します。ゲル電気泳動による消化後の正しいバンドの存在を確認し（ 図2a ）、ステップ2に進みます。ローリングサークル増幅（RCA）によりプラスミドDNAを調製する場合、ミニプレップ溶出液の一部を鋳型として確保します。 </li></ol>ライゲーションのための十分なプラスミドDNAの調製注：ライゲーションおよびその後のエレクトロポレーションには、maxiprepまたはRCAのいずれかを介して生成されなければならない十分な量のプラスミドDNAが必要です。マキシプレップは伝統的に使用されているアプローチですが、RCAはバクテリアを必要としないという利点を提供し、不安定な事象を引き起こす可能性のある細菌中のプラスミド誘発毒性の可能性を排除します。 <ol><li><strong&gt;次のmaxiprep手順を実行します。 <ol><li>前のセクションで正しい制限酵素消化パターンを示した各プラスミドについて、1LのTB-Carb（25μg/ mLカルベニシリン）ブロスに500μLのスターター培養液を加え、30℃で一晩振とうする（約14-16時間、およそ0.6〜0.8のOD 600 ）。 注：このOD 600値以上で培養液を増殖させないでください。これにより、プラスミド内で不安定な事象が生じる可能性がある。 </li><li>バクテリアを採取し、製造業者のプロトコールに従ってマキシプレップを行う（材料表参照）。 </li></ol></li><li> 手順1.6で保存したミニプレップを使用して、RCA手順について以下を実行します。 <ol><li> 1μLのプラスミドDNAを50μLのサンプルバッファーを含むチューブに移す。 </li><li>試料を95℃で3分間熱変性させ、使用するまで4℃でインキュベートする。 </li><li>商業的増幅を準備するプレミックス（ 材料表を参照）。氷上にセットしたチューブに50μLの反応バッファーと2μLの酵素ミックスを混合する。 注意：増幅プレミックスは、使用準備が整うまで氷上に置かなければなりません。必要な数の増幅反応のための十分な試薬を組み合わせることにより、マスターミックスを調製することが便利である。未使用のプレミックスはすべて破棄する必要があります。 </li><li>調製した増幅プレミックス50μLを変性サンプルに移す。 </li><li>反応管を30℃で18時間インキュベートする。 </li><li>チューブを65℃で10分間インキュベートし、φ29DNAポリメラーゼを不活性化する。 </li><li>使用準備が整うまで反応チューブを4°Cまたは-20°Cで保存する。 注：この時点で、両方の方法で調製したプラスミドDNAを定量する必要があり（260 nmでの吸光度を使用）、ZIKVゲノムは完全にSangerで配列決定して、不安定な事象（欠失および再構成） </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プライマー名</td><td>シーケンス（5 &#39;〜3&#39;） </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1。 </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conserved 632For。 </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKVは692Revを保存しました。 </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV保存1313Rev。 </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV保存された1201For。 </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV保存された1663For。 </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKVは2008年に保存されました。 </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKVは2350Revを保存しました。 </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV保存された2605For。 </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKVは3499Revを保存しました。 </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV保存3961Rev。 </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV保存4132For。 </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKVは4561Revを保存しました。 </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV保存4665For。 </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV保存5189Rev。 </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV保存5219用。 </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV保存された6086Rev。 </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKVは6119のために保存されています。 </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV保存された6721Rev。 </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV保存6769For。 </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKVは7209Revを保存しました。 </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV節約7343For。 </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV 8243用に保存されています。 </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev。 </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKVは9133Forを保存しました。 </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev。 </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKVは9686用に保存されています。 </td><td> GATGATAGGTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKVは10321Revを保存しました。 </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV保存された10455For。 </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV保存された10621Rev。 </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> 表1：cDNAクローンを配列決定するためのプライマー。プラスミドは、記載されたプライマーを用いて完全に配列決定することができる。 「保存された」インディ（indi）としてマークされたプライマーそれらがZIKVのすべての遺伝子型を配列決定/増幅する可能性が高いことを示す。 「PRVABC59」と命名されたプライマーはこの株に特異的であるが、他のアジアの遺伝子型株および場合によっては他の遺伝子型についても機能し得る。 インビトロで転写されたRNAの調製<ol><li> マキシプレップまたはRCA調製DNAの消化反応を設定する。 <ol><li> p1消化のために、10x反応バッファー、3μLのApaLI、3μLのBamHI-HF、3μLのrSAPまたはCIP、および3.3μgのp1DNAを混合する。 100μLにddH 2 Oを加える。 </li><li> p2消化のために、10×反応バッファー、3μLのApaLI、3μLのEcoRI-HF、および13.3μgのp2 DNAを混合する。 100μLにddH 2 Oを加える。 </li><li> 37℃で1〜2時間インキュベートする。 </li><li>市販のゲルとPCRクリーンアップキット（材料表を参照）を使用して精製する。加熱ブロック中で70℃に予熱した30μLの溶出緩衝液で溶出する（カラムを回転させる前に5分間）。 注：後でゲルに1μLを流してください。 </li></ol></li><li> ライゲーション反応を準備する。 <ol><li> 10μLの10×T4 DNAライゲーション反応バッファー、3μLのT4 DNAリガーゼ（400U /μL）、29μLの精製したp1、および29μLの精製したp2を合わせる。 100μLにddH 2 Oを加える。 </li><li>室温で2時間又は16℃で一晩インキュベートする。 </li><li>市販のゲルとPCRクリーンアップキット（材料表を参照）を使用して精製する。加熱ブロック（スピンする前に5分間インキュベートカラム）中で70℃に予熱した溶出緩衝液10μLで溶出する。 注：後でゲルに1μLを流してください。 </li></ol></li><li>消化されていないプラスミド、消化されたプラスミド、およびアガロースゲル上のライゲーションを実行する。連結産物は消化されたプラスミド単独よりも高い分子量バンド（約11kb）を有するべきであり、連結が成功したことを示している（ 図2b ）。</li><li> T7 インビトロ転写反応をセットアップする。 <ol><li> 2μLの2倍ARCA / NTPミックス、2μLのT7 RNAポリメラーゼミックス、および8μLの精製ライゲーション反応液を最終容量20μLに合わせて組み合わせます。 注記：ミックスに含まれるARCAは、排他的に正しい方向に組み込まれたキャップアナログです。標準キャップ類縁体は、転写物の約50％のみが正しい向きでキャップを有することができる。 </li><li> 37℃で4時間インキュベートする。 </li><li> UV分光光度計でRNA濃度を測定する。必要に応じて、RNA転写物の長さを確認するために変性アガロースゲルを流す。 </li></ol></li></ol> 4.エレクトロポレーションによる感染性ウイルスの救出<ol><li>回収すべき構築物当たり1細胞のT182フラスコ（T150とT182との間の許容可能なもの、DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）中で増殖させたもの）を調製する。モックトランスフェクションコントロールとして1 T182を含める。 Cellsは70〜80％のコンフルエンシーで使用する必要があります。 </li><li>細胞が準備ができたら、37℃に加熱した水槽にDMEM + 15％FBS + 10 mM HEPESを12 mL /反応させます。 </li><li>標準プロトコールを用いてトリプシン処理によって細胞を分離し、トリプシンを不活性化するために10％FBSを含む培地中の細胞を回収する; 4℃で5分間150 xgで細胞を遠心分離する。 </li><li>細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、細胞を150 xgで5分間4℃でペレット化します。この手順を2回繰り返し、合計3回洗浄します。 </li><li> 200μLのRPMI 1640 + 10 mM HEPES（無菌）/サンプル数で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液200μLを滅菌チューブに移す。細胞は〜0.5×10 7細胞/ mLでなければなりません。 </li><li>ステップ3.4で生成した20μLの水（偽陰性対照）または20μLのRNA（好ましくは5〜10μg）を細胞の各セットに加える。チューブをフリックして軽く混合し、チューブの内容物を2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。 </li><li> electrを設定する0Vと950μF（約625V / cm、20msの時定数）のオメガ（抵抗値）を170V LVに変換します。使用可能な場合は、0または∞のいずれかの最低設定値に抵抗を設定します。 </li><li>一度パルスし、ステップ4.2で温めたDMEM + 15％FBS + 10mM HEPES600μLを直ちに添加する。すべての細胞を除去するために、キュベットの内部を徹底的にすすぐ。 10mLの予熱した培地を含むT75組織培養フラスコに細胞を加える。キュベットに含まれているドロッパーを使用して、キュベットから追加のメディアを取り除きます。滅菌状態を維持するように注意してください。 </li><li>スワールフラスコを用いて培地と細胞を混合し、37℃のインキュベーターに入れます。 </li><li>翌日に細胞生存率を確認し、50〜75％の細胞死が観察されるまで毎日行う。細胞死は、模擬電気穿孔対照と比較することによって観察される。 注：ZIKV細胞変性効果（CPE）はVero細胞ではっきりしており、細胞を切り離して培養液中に浮遊させる。我々は持っています収穫に理想的であるとして8-10日の範囲を観察した。 </li><li>コニカルチューブで上清を回収し、4℃で10分間、&gt; 3000 xgで細胞破片を除去するために遠心分離する。 </li><li>清澄化した上清を新しいチューブに移し、20％FBS（100％ストック）の最終濃度で補充する。さらに、凍結している間（1Mの滅菌ストックから）のウイルス感染性を保存するための緩衝剤として最終濃度10mMの滅菌HEPESを添加する。 </li><li>ボルテックスでウイルスを混合し、アリコートをスクリューキャップのバイアルに入れます。将来の使用のために-80℃で保管してください。 </li></ol> 5.回収されたウイルスの滴定<ol><li>滴定の前日に、適切な数のVero細胞の6または12ウェルプレートに播種する。 </li><li>冷凍庫からウイルスを除去し、チューブまたは96ウェルプレート中のDMEM + 2％FBS中で連続的に10倍希釈する。 注：回収されたクローンの期待される力価は、1×10 6〜5×10 7 PFU / mLです。 </li><li> 200 oを追加各希釈液400μLを12ウェルプレートまたは6ウェルプレートのウェルにそれぞれ2回ずつ加える。 </li><li>プレートを37℃のインキュベーターに置き、15分ごとに揺り動かし、合計で約1-1.5時間の吸着期間をおきます。 </li><li>ウイルス接種物を除去し、各ウェルに1mLの（12ウェル）または2mL（6ウェル）DMEM-Tragacanthオーバーレイを加える。 注：ここでは、アガロース、寒天、メチルセルロースまたは他のオーバーレイ培地を使用することが可能です。 </li><li> 5日間37℃インキュベーターで細胞をインキュベートする。適切なプラーク形成の時間は、使用されるオーバーレイによって異なる。 </li><li>細胞を固定するには、インキュベーターからプレートを取り出し、オーバーレイを静かに消毒剤に移す。 </li><li>十分に20％エタノール/0.1%クリスタルバイオレット（CV）を各ウェルに加えて、混合して覆い、渦巻き状に混合する。 注：他の多くの固定剤が存在し、ここで使用することができます。さらに、アガロースまたは寒天オーバレイを使用する場合、ニュートラルレッドと組み合わせて第2オーバーレイを使用して、固定せずにプラークを視覚化することができる。 20％エタノールは、以前の研究でエンベロープウイルスを不活性化するのに効果的である;エンベロープを持たないウイルスにはこの量を使用しないでください。 </li><li>プレートを室温で30〜60分間インキュベートする（クラスIIバイオセーフティーキャビネット内）。 CV（地方条例に従って）を捨て、プレートを水道水で洗う。 </li><li>プレートを乾燥させ、プラークを手動で数える。 注記：参照番号20は、プラークアッセイを実施するためのさらなる参照として使用することができる。 </li></ol>

<ol><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%3A+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%2C+December+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveill. 19 (9), (2014).</li>
<li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5%27+end+of+dengue+virus+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLoS One. 6 (3), e18197(2011).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+propagate+flavivirus+infectious+cDNA+clones+in+bacteria+by+introducing+tandem+repeat+sequences+upstream+of+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li>
<li>Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+infectious+yellow+fever+RNA+from+full-length+cDNA+templates+produced+by+in+vitro+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.</a> New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).</li>
<li>Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+reverse+genetics+system+for+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.</a> J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).</li>
<li>Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+major+determinant+of+mouse+neurovirulence+of+dengue+virus+type+2+using+stably+cloned+genomic-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA.</a> J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).</li>
<li>Johansen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+insertion+facilitates+amplification+of+cloned+virus+cDNA+in+Escherichia+coli+while+biological+activity+is+reestablished+after+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).</li>
<li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence%2C+Mosquito+Transmission%2C+and+Antiviral+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li>
<li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497, 157-162 (2016).</li>
<li>Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+an+infectious+dengue+virus+type-2+RNA+genome+%28New+Guinea+C+strain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain).</a> Gene. 162 (2), 175-180 (1995).</li>
<li>Messer, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reverse+genetic+system+for+studying+dengue+virus+serotype+3+strain+variation+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).</li>
<li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li>
<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

ここでは、ZIKVの二部感染性cDNAクローンシステムを回収する方法について説明します。以前に説明されたZIKVのクローンは、減衰するか、イントロンの追加を必要とし、プラスミドを大きくし、昆虫細胞でのレスキューを妨げます。感染性ウイルスは、哺乳類または昆虫細胞のいずれかで2プラスミドクローンシステムを使用して回収できます(データは示していません)。さらに、このシステムから回収されたウイルスは、いくつかの細胞株、免疫不全マウスモデル、および蚊で野生型ウイルスと同様に振る舞います。 
フラビウイルスゲノム3には不可解な細菌プロモーターが存在するため、完全長フラビウイルスクローンは扱いが難しく、一般的にプラスミドの突然変異、挿入、欠失、または再構成を引き起こします。私たちは、ZIKVゲノムを2つのプラスミドに分離し、ウイルスNS1遺伝子に存在する毒性配列を破壊することで、これらの懸念を軽減しようとしました。その結果、より安定したシステムとなり、変更を取り入れることにも適していました。このクローンシステムを用いて、ZIKVゲノムにいくつかの点...

Zikaウイルス（ZIKV; Family Flaviviridae ： Flavivirus属）は、2013-14年にブラジルに到着した蚊媒介性フラビウイルスであり、以後、アメリカ全土に広がった熱性疾患の大規模な発生に関連しています1 。さらに、ZIKVは、成人のギラン・バレー症候群や胎児や新生児の小頭症などの重篤な疾患の結果と関連している2 。西半球で急速に普及する前はZIKVについてほとんど知られていなかった。これには分子ツールの欠如が含まれており、したがって機構的研究が妨げられている。感染性cDNAクローンなどのウイルスのための分子ツールは、ワクチンおよび抗ウイルス治療の開発を容易にし、差別的ウイルス病原性、免疫応答およびウイルスの進化に関連するウイルス遺伝因子の評価を可能にする。 フラビウイルスの感染性クローンは、crのため細菌中で非常に不安定であることが知られているそれらのゲノムに存在する恒温性原核生物プロモーター3 。この問題を改善するためにいくつかのアプローチが用いられてきた。ゲノムを複数のプラスミド6に分割すること、低コピー数のベクター（細菌人工染色体を含む） 7,8およびウイルスゲノム9にイントロンを挿入することを含む、ウイルスゲノム9の上流にタンデムリピートの挿入を含む。 ZIKVについては、変更のない1つの全長システムが記載されている。しかし、このクローンは細胞培養およびマウスにおいて弱毒化されているようであった10 。他のグループは、イントロンをZIKVゲノムに組み込んで、インビトロで感染性ウイルス11の産生のために哺乳類細胞でスプライシングされ得る細菌中の不安定な配列の破壊を可能にする、 12 。さらに、感染性サブゲノム - アンプリコンと命名されたPCRベースのシステムは、ZIKV 13の原型MR766株を救済するために首尾よく使用されている。ここに記載されているアプローチは外来配列を必要とせず、以前は黄熱病6 、デング14,15および西ナイルウイルス16で成功裡に使用されている複数のプラスミドを使用することによって、不安定性の高い領域でゲノムを破壊する。さらに、ウイルスゲノム末端でのD型肝炎リボザイム配列の付加は、線状化部位の追加を必要とせずに本物の3 &#39;末端の作製を容易にする。さらに、両方のプラスミドは、低コピー数ベクター（pACYC177、1細胞あたり約15コピー）で構築され、残留毒性を軽減する17 。回収されたウイルスは、哺乳動物および昆虫の両方から誘導された様々な細胞型を含む8細胞株におけるインビトロ増殖曲線における親ウイルスであり 、マウスにおいて同一の病原性プロファイルおよび蚊における感染、播種および感染率を示した18 。 本明細書では、感染性クローンプラスミドを増殖させ、インビトロで全長ウイルスRNA（ウイルスゲノム）を生成し 、細胞培養で感染性ウイルスを回収する方法を記載するプロトコルを詳述する。まず、バクテリアにおけるプラスミドの増殖またはローリングサークル増幅（RCA）を用いた無細菌増幅について説明する。次に、2つのプラスミドがどのように消化され、続いて完全な長さのウイルスを生成するために一緒に連結されるかを示す。最後に、転写されたRNAの産生およびその後のVero細胞への電気穿孔、続いて回収されたウイルスの滴定（ 図1 ）について説明する。説明されたアプローチは迅速であり、fo1〜2週間で感染性ウイルス株を回収する。

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン、二ナトリウム塩</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy プラスミド Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE プラスミド Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20,000 units/ml</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 Amplification Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 units/ml</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202S</td><td>400,000ユニット/mL</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNAキット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>ベロ細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 ハイスループットエレクトロポレーションシステム</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>その他のマシンも可。</td></tr><tr><td>寒天入りLBブロス(ミラー)</td><td>シグマ</td><td>L3147</td><td>自家製も可能です。</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>自家製にもなります。</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>セルトリート</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>培養チューブ</td><td>VWR インターナショナル</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>T75 フラスコ</td><td>セルトリート</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 フラスコ</td><td>セルトリート</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 L-グルタミン</td><td>コーニング</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミンと 4.5 g/L グルコースを含む DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Powder</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>エタノール変性</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Oligos</td><td>IDT</td><td>表1</td><td></td>参照</tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>その他の方法も可します。</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>他の方法も使用できます。</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>他の方法も可します。</td></tr><tr><td>クラスIIバイオセーフティキャビネット</td><td>N/A</td><td>これは</td><td>生きたウイルスの作業に必要です。</td></tr></tbody></table>

新世界zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

感染性cDNAクローンは、ウイルスの遺伝子操作を可能にし、したがって、ワクチン、病原性、複製、伝達およびウイルスの進化に関する作業を容易にする。ここでは、アメリカで爆発的な流行を引き起こしているZikaウイルス（ZIKV）の感染クローンの構築について説明します。フラビウイルス由来のプラスミドでよく見られる細菌への毒性を防ぐために、我々はNS1遺伝子のゲノムを分離し、突然変異を伴わずに正常に回収できなかった完全長構築物よりも安定な2プラスミドシステムを作製した。 2つの断片を連結する消化およびライゲーションの後、全長ウイルスRNAを、T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成することができる。転写されたRNAの細胞への電気穿孔の後、同様のインビトロでの増殖速度およびインビボでの病原性および感染表現型をマウスおよび蚊でそれぞれ示したウイルスが回収された。

ここに記載されたプロトコルは、感染性クローン由来Zikaウイルスの回収を可能にする。非常に不安定な全長バージョン（データは示されていない）と比較して、2プラスミドの感染性クローンシステムを操作することは、慎重に行う場合には容易である。 2つの別個の断片の消化およびライゲーションの後、T7ポリメラーゼによるインビトロ転写を用いてキャップされたRNAを生成し、次いでこれをVero細胞に電気穿孔する（ 図1 ）。正しいプラスミド配列は、ミニプレップ（ 図2a ）に続くプロキシとしての制限消化およびRCAまたはマキシプレップを用いた大規模DNA産生後のサンガー配列決定を用いてモニターすることができる。配列決定によるクローンの確認の後、感染性ウイルスの回収は消化、ライゲーション、 インビトロ転写および最後にエレクトロポレーションのみを必要とする。これらのステップは1日で実行できます。正しいダイジェストアガロース...

このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

この手順の全体的な目的は、2つのパーツからなるジカウイルスZ-DNAクローンから感染性ウイルスを回収することです。この手法は、ワクチン戦略、病原性、伝播、ウイルスの進化など、フラビウイルス学における重要な疑問を解決することができます。この技術の主な利点は、2パーツシステムが全長アプローチよりも安定していることです。この手法はジカウイルスに関する知見を提供するだけでなく、プラスミドの不安定性のためにクローニングが困難であることが証明されている他のウイルス系にも適用可能です。本手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるJames Wegerが行います。まず、ジカウイルスのゲノムをコードする2つのプラスミド、P1およびP2の制限酵素処理反応を準備してください。3.3 µgのP1を、適切に機能するホスファターゼの存在下で、ApaL1およびBamH1 High Fidelityを用いて、最終容量100 µLで消化します。P2について、13.3 µgのP2 DNAをApaL1およびEcoR1 High Fidelityで、最終容量100 µLで消化します。両反応を37 °Cで1.2時間インキュベートします。市販のゲルおよびPCR浄化キットを用いて消化したプラスミドを精製した後、70 °Cに予熱した溶出バッファー30 µLをカラムに加え、5分間インキュベートします。精製した消化済みプラスミドを遠心分離した後、精製したP1を29 µLと精製したP2を29 µLに、二回蒸留水で調製したT4 DNA ligation反応バッファーおよびT4 DNAリガーゼを加え、最終容量を100 µLとしてライゲーション反応液を調製します。ライゲーション反応液を室温で2時間インキュベートします。インキュベート後、前述と同様の手順でライゲーション済みプラスミドを精製します。今回は、あらかじめ加熱しておいた溶出バッファーを10 µL使用します。次に、未消化プラスミド、消化済みプラスミド、およびライゲーション産物をアガロースゲルで電気泳動します。ライゲーションが成功していれば、約11Kbのライゲーション産物が得られるはずです。プラスミドが正しい分子量で展開されていることを確認した後、精製したライゲーション反応液 8 µL を用いて T7 インビトロ転写反応をセットアップし、37 °C で 4 時間インキュベートします。インキュベート後、UV 分光光度計を用いて RNA 濃度を測定します。エレクトロポレーションの 1 または 2 日前に、回収予定のコンストラクトごとに 1 回分（T182 フラスコ 1 本）の Vero 細胞を準備します。擬電撃法コントロールとして使用するT182フラスコを1つ用意します。細胞のコンフルエンシーが70〜80%になったら、15% FBSおよび10 millimolar HEPESを含むDMEMを37 °Cに加熱したウォーターバスで温めます。標準的な方法に従ってトリプシン処理により細胞を剥離し、10% FBSを含む培地を加えて細胞を回収し、トリプシンを不活化させます。次に、細胞を 150 ×g で 4 °C、5 分間遠心分離します。PBS で細胞を 3 回洗浄した後、各細胞ペレットを 10 mM HEPES 添加 RPMI 1640 に懸濁し、細胞濃度を約 0.5 × 10⁷ cells/mL に調整します。細胞懸濁液 200 µL を滅菌チューブに移します。次に、擬似コントロールとして20 µLの水、またはRNA 20 µLを各細胞群に加えます。チューブを軽く弾いて細胞を穏やかに混ぜ合わせ、その後、チューブの内容物を2 mmギャップの電気穿孔用キュベットに移します。エレクトロポレーターを170 V、抵抗0 Ω、容量950 µFに設定します。細胞を1回パルスし、直ちに予熱した培地を600 microliters加えます。細胞を、10 millilitersの予熱した培地を含むT75組織培養フラスコに移します。キュベットに付属のドロッパーを使用して、キュベットに残っている培地をすべて取り除きます。フラスコを回転させて培地と細胞を混合し、37 °Cのインキュベーターに入れます。翌日以降、擬電撃穿孔コントロールと比較して50～75%の細胞死が観察されるまで、毎日細胞の生存率を確認します。50～75%の細胞死が確認されたら、上清をコニカルチューブに回収し、4 °Cで3,000 ×g以上、10分間遠心分離して細胞残渣を除去します。遠心分離後、清澄化した上清を新しいチューブに移し、FBSを最終濃度20%になるように加えます。さらに、凍結中のウイルスの感染性を維持するための緩衝剤として、滅菌したHEPESを最終濃度10 mMになるように加えます。最後に、ボルテックスでウイルスを混合し、スクリューキャップ付きのチューブに分注します。ウイルスは今後の使用のために-80 °Cで保存します。この画像は、野生型PRVABC59と感染性クローン由来ジカウイルスが、非ヒト霊長類由来のVero細胞株の増殖キネティクスに及ぼす同様の効果を示しています。また、この画像は、両ウイルスがヒト胎盤細胞に及ぼす影響を示しています。蚊由来のC6/36細胞株においても、同様の増殖キネティクスが認められます。この生存曲線は、PRVABC59または感染性クローン由来ウイルスを1,000 PFU接種した4週齢のインターフェロンα、β、およびγ受容体ノックアウトマウスから得られたデータを示しています。ジカウイルスを含む吸血から14日後に、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）を解剖しました。蚊の体内における感染はプラークアッセイを用いて評価し、脚では播散を、唾液分泌物では感染性ウイルスの伝播を測定しました。率は、検査した蚊の総数に対する割合として示されています。この手順を行う際は、ウイルス全体をシーケンシングすることが重要です。また、ウイルスの複製サイクルを最小限に抑えるために、50から75% CPEでウイルスを回収することが重要です。この手法は、ジカウイルスのワクチン、病原性、およびウイルス進化を探索するフラビウイルス学分野の研究において重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。...

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

このビデオでは、ヒト胎児の神経幹細胞にジカウイルスを感染させる手順を実演しています。感染した細胞は、さらなる研究に使用できます。...

胎児神経幹細胞のジカウイルス感染

クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。...

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ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。...

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脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

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ジカウイルスの最近の流行は、ワクチンや治療戦略を開発するための逆遺伝的アプローチを確立することの重要性を強調しています。ここでは、ヒトサイトメガロウイルスの制御下で細菌人工染色体に組み立てられた全長cDNAクローンから感染性組換キンジカウイルスを早期に促進するプロトコルについて説明する。...

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学ぶ Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルス救出法。2プラスミッド系を用いて安定した感染性ウイルスを回収し、フラビウイルス学におけるワクチン開発や病原性研究に応用可能です。

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

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