タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証

このプロトコルの全体的な目標は、タンパク質膜赤外電気化学またはPFIREを使用して、非ターンオーバーおよび定常状態の電気触媒ターンオーバー条件下で、ニッケル-鉄ヒドロゲナーゼ酸化還元酵素の活性側化学を調査することです。PFIRE技術の主な利点は、炭素電極に固定化された酸化還元タンパク質の正確な電気化学的制御と赤外分光サンプリングを同時に可能にすることです。この方法は、定常状態の触媒代謝回転中に酸化還元タンパク質のどの状態が存在するかについて、生物物理学および生物電気化学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

手順を開始するには、湿った嫌気性グローブボックスに、1ミリリットルの超純水に20ミリグラムの高表面積カーボンブラック粒子を懸濁します。懸濁液を低電力で少なくとも15分間、または粒子が均一に分散し、静止状態で1時間以内に沈殿物が形成されなくなるまで超音波処理します。次に、大腸菌ヒドロゲナーゼ1の1ミリリットルあたり約7ミリグラムの溶液の15マイクロリットルを50キロダルトンの遠心フィルターユニットにロードします。

ヒドロゲナーゼの等電点に近いpHの低イオン強度交換緩衝液450マイクロリットルで溶液を希釈します。27, 000倍gで遠心分離することにより、混合物を50マイクロリットルに濃縮する。混合物をさらに4回再濃縮して、バッファー交換を完了します。

次に、20ミリグラム/ミリリットルのカーボンブラック分散液の5マイクロリットルをバッファー交換ヒドロゲナーゼと組み合わせます。混合物を摂氏0度で一晩保存して、ヒドロゲナーゼがカーボンブラック粒子に吸収されるようにします。粒子の分散を維持するために、混合物を定期的にチェックしてください。

修飾された粒子を27, 000倍gで遠心分離し、上清がほぼ無色であり、粒子へのヒドロゲナーゼの良好な吸収を示すことを確認します。実験を成功させるには、高いレベルの吸収を達成することが重要です。低イオン強度の緩衝液を起点として、タンパク質の等電点に近いpHの吸収緩衝液を最適化します。

粒子を3〜5サイクルの遠心分離で洗浄し、新鮮な交換バッファーで再懸濁します。粒子混合物を約5マイクロリットルに濃縮して、20ミリグラム/ミリリットルの粒子負荷を達成します。PFIRE測定の準備を開始するには、硫酸中での低電力超音波処理により、シリコーン内部反射要素を15分間洗浄します。

続いて硝酸を1時間飲みます。次に、元素を超純水ですすぎ、乾燥窒素ガスの流れ下で乾燥させます。電気グレードのシリコンシーラントを使用して、IREを5反射ATRアクセサリのベースプレートに固定し、シーラントをIREの端に保つように注意します。

シーラントを完全に乾かします。次に、ベースプレートを乾燥した嫌気性グローブボックスに入れ、FTIR分光光度計の隣にIR透明の窓を置きます。ベースプレートをATRアクセサリーに取り付けます。

ラピッドスキャンモードでバックグラウンドスペクトルを取得します。次に、ATRアクセサリーベースプレートを取り外し、濡れた嫌気性グローブボックスに移します。酵素修飾カーボンブラック粒子の1マイクロリットルを、粒子が完全に乾燥しないように、IRE表面上に均一にドロップキャストします。

酵素修飾粒子混合物は、可能な限りミリグラム/ミリリットルに近い負荷で濃縮されていることが重要です。そうしないと、このステップで粒子をドロップキャストするときに、適切に接続された粒子膜を実現するのが難しくなる可能性があります。超純水に浸したカーボンペーパーをIRE表面にそっと置き、紙がシリコーンシーラントに接触しないように粒子膜が覆われていることを確認します。

カスタム分光電気化学セルをIREに取り付けます。溶液入口から200マイクロリットルの実験用バッファーを添加し、システム調製中に酵素を水和させます。溶液の入口と出口を、蠕動ポンプチューブを介して実験バッファーのバイアルに接続します。

次に、組み立てたセルを乾いたグローブボックスに移します。セルアセンブリをATRアクセサリに取り付け、チューブをペリスタルティックポンプに接続します。以前に取得したスペクトルを背景として、吸収性スペクトルを取得します。

MI2 バンドが 1, 540 逆センチメートルで強く見えること、およびヒドロゲナーゼ活性部位のピークが 1, 850 から 2, 150 の領域で検出可能であることを確認します。実験の準備として、飽和カロメル参照電極に対してマイナス0.8ボルトの還元電位を粒子膜に印加します。実験バッファーを嫌気性水素ガスで飽和させます。

次に、毎分約12ミリリットルで分光電気化学セルにバッファーを流し始めます。サンプルを水素飽和実験バッファーの流れの下に一晩放置して、ヒドロゲナーゼを活性化します。活性化されたサンプルの吸収スペクトルを取得し、活性部位のCOバンドとCNバンドが複数の還元状態を示すことを確認します。

次に、実験バッファーを嫌気性窒素ガスで飽和させ、バッファーをセルに流します。飽和カロメル参照電極に対して0ボルトの酸化電位を30分間印加し、吸収性スペクトルを取得します。次に、還元電位を30分間適用し、別のスペクトルを取得します。

酵素が完全に酸化され、その後還元されたことを確認します。そうでない場合は、セルの電気接続を確認してください。嫌気性水素飽和バッファーを使用して、増加する流量で一連のサイクリックボルタモグラムを取得し、実験に最適な流量を決定します。

この流量を使用して、さまざまな電位と溶液条件でスペクトルを取得します。大腸菌ヒドロゲナーゼ1のPFIRE測定は、不活性雰囲気および水素ガスの存在下でさまざまな電位で取得されました。水素雰囲気下で取得されたスペクトルは、触媒性水素酸化中に存在する活性サイト状態の定常状態分布を表していました。

次に、ニッケルSiからのニッケルB状態の形成によるヒドロゲナーゼの嫌気性酸化的および活性化を、潜在的な適用中のさまざまな時点でスペクトルを取得し、最初のスペクトルに対して異なるスペクトルを準備することにより調査しました。ニッケル-Siからニッケル-Bへの観察された緩やかな変換は、電流の単調な減少と一致していました。スペクトルはまた、ヒドロゲナーゼ触媒サイクルのプロトン移動ステップを調査するために、溶液pHの範囲にわたって取得されました。

低pHでは、ニッケル-C状態がより一般的であり、ニッケル-L状態は高pHでより一般的でした。ニッケルCとニッケルLの相対濃度のpH依存性は、実験で評価した各pHのそれぞれのピークにおける最大吸収剤値から決定しました。この技術は、生物電気化学の分野の研究者が、水素生成による水素活性化の定常状態の速度論を探求する道を開くものです。

このビデオを見れば、一般的なPFIRE実験について十分に理解できるはずです。この技術は、タンパク質膜電気化学で研究できるあらゆる酸化還元タンパク質に適しており、電気化学測定に直接化学的洞察を追加します。