Name: タンパク質フィルム赤外線電気化学 NiFe ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぼう、タンパク質フィルム赤外線電気化学（PFIRE）を用いて[NiFe]ヒドロゲナーゼの活性部位化学を解析する方法。電気化学制御と赤外分光を同時に行い、水素酸化反応における酵素の還元状態を詳細に調べることができます。

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K.A.V. と P.A.A. の仕事は、欧州研究評議会 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-ポンド-258600)、工学・物理科学研究協議会 IB 触媒賞 EP/N013514/1 バイオ ・生物科学研究に支えられ評議会 (BB/L009722/1 と BB/N006321/1)。相対湿度は、Ministerio デ サイエンス y Tecnologìa デ コスタリカ大学とリンカーンの大学、オックスフォードによって支えられました。著者は、デザインとこの作業で使用する分光電気化学セルの製造支援のためチャーリー ・ ジョーンズ氏、チャーリー ・ エバンス、機械のワーク ショップ (化学部門) のスタッフを認めます。

1. 嫌気性、乾いたグローブ ボックスと一般の実験的要件の中赤外分光計の内部試料室を再作成します。
<ol><li>外部水銀カドミウム テルライド (MCT) 検出器と ATR アクセサリ装備商業 FTIR 分光計を使用します。乾燥した空気や窒素、分光器の本体を削除またはまたは避難の光学ベンチを持つ分光計を使用します。</li>
	<li>嫌気性と同じ高さで、振動のない安定したテーブルの上に装置を置く (< 1 ppm O2)、ドライ (露点 <-75 ° C) グローブ ボックス。多重ビームを収容できる大きさである IR 透明な窓から、グローブ ボックスに分光器の赤外線ビームをそらします。 たとえば、KBr や NaCl などの吸湿性の窓材を使用される場合は特にメモ: グローブ ボックスと分光器の間のスペースはまたパージまたは避難、ことは重要です。</li>
	<li>
グローブ内部分光計の内部試料室をレプリケートします。
	<ol>
<li>分光器の内部集光ミラーと同じ焦点距離が理想的な軸から楕円面鏡にグローブ ボックス内ビームを直接します。 注: それは高さとグローブ ボックスの内部調整する赤外線ビームの方向の両方を許可するためにこの集光ミラーの前に置かれた 2 つの追加の平面鏡があると便利これは分光器の初期配置で任意の不正確さを相殺します。</li>
		<li>外部の MCT 検出器の配置、適切なとの完全な (短い焦点距離 ZnSe レンズ、短い焦点距離での軸外放物面鏡など)、グローブ ボックスの中の光を焦点内部試料寸法をレプリケートするよう配置されて分光器のコンパートメント。</li>
		<li>集光ミラーと MCT 検出器との間およそ等距離に赤外線ビームのフォーカスを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体窒素で外部の MCT 検出器のデュワーを冷却します。</li>
	<li>グローブ ボックスの試料室に ATR アクセサリをマウントします。入力と出力の光学系と ATR アクセサリ MCT 検出器に最大のスループットを達成するために焦点を合わせます。必要に応じて、検出器信号の過飽和を防ぐために開口部または他の適した減衰 (ワイヤー グリッド) などを使用します。 注: のデータ紹介、すべての反射光学系、反射要素 (怒り) を使用取り外し可能な台形 Si 5 反射 ATR アクセサリ (クリスタル GmbH、寸法ca 5 × 8 × 1 mm3顔の角度 39.5 °)。怒りは、ポリエーテルエーテルケトン (PEEK) から加工、取り外し可能なベース プレートにマウントされます。</li>
	<li>外部収納ポテンシオスタットへの接続を許可するように適切なフィードスルーと再現試料室を収容するためグローブ ボックスを使用 (ガス タイトな BNC 接続役にこの目的のため)、ガス アクセスと、MCT から信号を転送するケーブル検出器です。任意の導入のノイズや測定への干渉を避けるために検出器ケーブルのシールドを保持することが重要です。</li>
	<li>場所蠕動性ポンプ、流量、グローブ ボックス内 60 mL/分を超えることができます。分光器の概略図で、ATR アクセサリ、蠕動ポンプと電気化学測定装置のセットアップは図 1に示すです。</li>
	<li>図式的に示す図 2ATR にシール、アクセサリーなどの分光電気化学セルを構築します。セルには、作用電極 (カーボン棒)、ミニチュア参照電極の接続、高表面積カウンター電極 (Pt 線またはガーゼ) を含める必要があります。セルは、入口とセルを介してソリューションの急速な流れのための出口として、少なくとも 2 つのさらにポートを含める必要があります。 注: ミニチュア カロメル参照電極は、この目的のため最適です。36
</li>
</ol>2.大腸菌ヒドロゲナーゼ 1 カーボン ブラック粒子の調製
<ol><li>'ウェット' 嫌気グローブ ボックスのミックス高表面積の 20 mg カーボン ブラック粒子 (> 1,000 m3/g) 1 mL 超高純度水 (抵抗率 > 18 MΩ cm) 微量遠心チューブに。低出力超音波処理による粒子を分散 (< 100 W)、少なくとも 15 分間または分散が均一であり約 20 mg/mL のローディングとカーボン ブラック分散を与える 1 h 内沈降をしません。</li>
	<li>
〜 7 mg タンパク質/mL の濃度で大腸菌ヒドロゲナーゼ 1 (Hyd1、パブリッシュされたプロシージャ55にしたがって調製された約 50 μ L) の因数を取るし、(等電点に近い ph の低いイオン強さバッファーに交換例リン酸カリウム、pH 5.8、追加塩 15 mM)。最良の結果を達成するために可能な限り積極的にある酵素製剤を使用します。(50 kDa の作品は、Hyd1 の) 濃度と希釈、適切な分子量カットオフ遠心ろ過デバイスにバッファー交換を実行します。
	<ol>
<li>フィルター デバイスに、Hyd1 を追加します。</li>
		<li>交換バッファーの約 450 μ L で希釈します。</li>
		<li>穏やかなの遠心分離を使用して 50 μ L のボリュームを再び集中させるでしょう (< ~ 2700 × g) 不可逆的な沈殿物を防ぐために。</li>
		<li>(~ 5 サイクル) の内で通常バッファー交換が完了するまでは、2.2.2 と 2.2.3 手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バッファー交換 Hyd1 の 50 μ 因数とカーボン ブラック分散 (2.1 の準備) 20 mg/mL の 5 μ L のボリュームをミックスします。(0 の ° C) の冷凍庫で一晩吸着酵素を許可する酵素粒子の混合物を格納します。粒子が分散したままを確認して時折混合物を振るする必要があります。</li>
	<li>遠心機 (~ 2,700 × g) で連続堆積作用と再分散サイクルによって低いイオン強さバッファー (リン酸カリウム、15 ミリメートル、pH 5.8、追加塩) と Hyd1 変更の粒子を洗浄します。このプロセスに 3-5 回を繰り返す非吸着酵素を削除します。 注: 最初の洗浄の前に清が酵素の良い吸着を示す無色でする必要があります。</li>
	<li>〜 5 μ L の最終巻に粒子を集中すると、~ 20 mg/mL の酵素修飾粒子の最終的なロードを与えます。 注: Hyd1 変更粒子場合格納できます 4 ° C で 2 週間のまま水和物;これは最高 〜 50 μ L の超高純度精製水で希釈した粒子を格納することで実現されます。</li>
</ol>3. のE. 大腸菌ヒドロゲナーゼ 1 PFIRE 測定準備
<ol><li>ように低出力超音波 (< 100 W)、H2の最初で Si 怒りをクリーンアップ4 (< 90 %w/w) 〜 15 分間放置、HNO3 (70%/w) まで 1 時間。このクリーニングの手順は、親水性の怒り表面につながるはずです。ピラニア溶液中の怒りを置くことがそれ以上のクリーニングが必要な場合 (H2O2の比率 1:3: H2SO4) 残りの有機物を酸化します。 注: 過酷な酸性洗浄方法はすべて IRE 材料の使用に適していない場合があります。ピラニア ソリューションは強い酸化表面きれいにすべき合理的に準備中にピラニア ソリューションとケアの利用をすべきであるし、H2O を追加プロセスの - 常に発熱性質のピラニア溶液の使用前に、腐食性の高い2ゆっくりとH2SO4準備、利用及び処分のため適切な安全手順を参照してください。</li>
	<li>超高純度水のきれいな怒りをすすいで乾燥窒素ガスの流れの下で乾燥します。汚染を避けるためにクリーンなピンセットを使用してすべてのプリズム処理を実行します。</li>
	<li>電気用シリコーン ・ シーラントの薄いストリップを使用して ATR アクセサリー ベース プレートに怒りをシールします。怒りの端にシールを制限に注意してください。完全に乾燥剤を許可します。</li>
	<li>ATR アクセサリー ベース プレートを分光器グローブ ボックスに転送し、ATR アクセサリにマウントします。急速に標準を使用して、4 cm-1解像度で 4000 1,000 cm-1間の参照 (背景) スペクトル測定は、分光器のモードと 1024 の平均インターフェロ (計測時間 3 〜 5 分) をスキャンします。実験の後半に吸光度スペクトルの計算を許可するようにこのスペクトルを入力として使用します。 注意: 小さな吸光度 Hyd1 アクティブ サイトの予想により、ノイズ比に高信号とスペクトルを収集する必要は。</li>
	<li>ATR アクセサリー ベース プレートを事前に用意された Hyd1 変更粒子分散 (セクション 2) が含まれている 'ウェット' グローブ ボックスに転送します。ドロップ キャスト、怒りの大きな顔の上に粒子の分散の 1 μ L 因数の表面を渡って均等に広がる。注: は、怒りを完全に乾燥してしまう粒子は認めません。</li>
	<li>サイズ ~0.1 mm IRE (ca. すなわち8.2 × 4.9 mm2) の表面の寸法より小さくして、燃料電池のガス拡散層材料として使用などのカーボン紙の一部をカットします。カーボン紙の表面積はドロップ キャスト Hyd1 変更粒子をカバーするのに十分な大きさにする必要がありますが、重複しないように大きいシリコーン シール剤を使って怒りをセキュリティで保護します。炭素紙は水に浸し、優しく粒子フィルムの上に置きます。カーボン紙は全粒子フィルム間で良好な電気的接続を提供します。 注: それはカーボン紙のいくつかの部分を事前に準備し、超高純度水 'ウェット' 嫌気グローブ ボックス内部にあらかじめ浸して保存に有益です。</li>
	<li>怒りの分光電気化学セル (1.7 の説明および図 2に模式的に示すように) をマウント、ネジでベース プレートに固定します。〜 200 μ L の酵素水和を維持する実験的バッファーを追加します。広い pH 範囲でバッファリングできる混合バッファー システムは NiFe ヒドロゲナーゼの研究に役に立つ:56ナトリウム酢酸、2-[N'-morpholino] エタン-スルホン酸 (MES)、 N'-[2-ヒドロキシエチル] ピペラジン -N'-[2-エタン-スルホン酸] (HEPES)、 N'-トリス [ヒドロキシメチル] メチル-3-アミノ-プロパン-スルホン酸 (タップ) と 2-[N'-cyclohexylamino] エタン-スルホン酸 (CHES)、各コンポーネントは 15 mM の最終的な集中で、0.1 M を含む塩化ナトリウム ph 調整 pH 6 を使用する電解質のサポートとしては、水酸化ナトリウムと塩酸を集中しています。 注: 作業中の電極接続はべきである分光電気化学セルの上端 (~0.1 mm) カーボン紙 (図 2) に良い電子接続を確保するための面の下わずかに突出しています。</li>
	<li>液入口と分光電気化学セルのコンセントをローラー ポンプ用チューブと実験的バッファーのバイアルを含むフロー システムに接続します。分光計を含む '乾燥' グローブ ボックス組立セルに転送します。</li>
	<li>ATR アクセサリに分光電気化学セルの組み立てをマウントします。作業、カウンターおよび参照電極をポテンシオスタットに接続します。ローラー ポンプ用チューブをポンプに接続します。</li>
	<li>参照/背景として 3.4 で収集されたスペクトルを使用して、スペクトル範囲は 4,000 1,000 cm-14 cm-1解像度で平均 1024 インターフェロと吸光度スペクトルを記録します。この時点でスペクトルが重要な含める必要があります (> 100 mO.D) アミド II ~ 1,540 cm-1にバンドと Hyd1 のアクティブ サイト バンドはスペクトル領域 1,850 2,150 cm-1、酸化、非アクティブな状態 (図 3 で主に明らかにする必要があります。).</li>
</ol>4.大腸菌ヒドロゲナーゼ 1 と分光電気化学セルでテストの活性化
<ol><li>Hyd1 変更粒子フィルムに還元電位 (−0.8 V対SCE) を適用します。実験的バッファーと分光電気化学セルをゆっくりと H2とフロー バッファーを飽和させます。サンプルは、Hyd1 を完全に有効にするために一晩おきます。 注: それは重要、嫌気性の H2N2 等、およびすべての嫌気性ガス O2フィルターを介して渡す必要があります。</li>
	<li>活性化した後、サンプルの吸光度スペクトルを記録します。ΝCOとvCNバンド アクティブ サイトの減少、「アクティブ」状態の分布が表示されます。これは 3.10 (図 4) に記録されたスペクトルを基準の差スペクトルを使用して最も容易に観察されます。</li>
	<li>分光電気化学セルの電気的接続をテストします。これを行うには、N2ガス実験的バッファーを飽和させます。(0 V対SCE) を酸化・ Hyd1 変更粒子フィルムに ( ca 30 分の期間) の (−0.8 V対SCE) 電位を還元のシーケンスを適用し、それぞれの吸光度スペクトルを記録します。Hyd1 は急速に酸化して縮小した、する必要がありますになるし、サンプルの 100% が適用される可能性に応答粒子フィルムがよく接続されている場合。</li>
	<li>実験的バッファーの適切な流量を設定します。これを行うには、サンプルでは、減少の潜在性 (−0.8 V対SCE) に適用し、H2実験的バッファーを飽和します。-0.707 間サイクリックボルタモ グラムの一連の記録 - 0.039 V対SCE 10 mV/秒のスキャン レートで徐々 に増加 H2の流量-バラメーター触媒の波形に似ている平面回転までの間飽和バッファーディスク電極55と最大電流は関係なく流量 (図 5)。 注: H2水の溶解度限界は 293 K と 1 つのバーで ~0.8 ミリメートルです。</li>
	<li>サンプル PFIRE 測定の準備として、ソリューションの条件 (pH、温度、H2濃度など) の範囲の下で、電位の範囲でスペクトルを収集します。Hyd1 H2酸化反応などの触媒プロセスを勉強して場合は特に分光学的、電気化学的データを関連付けることができることが重要である電気化学測定装置ソフトウェアを使用してすべての電気化学的データを記録します。</li>
</ol>5. 分光データ処理
<ol><li>アクティブ サイトが 0 V と −0.8 V対実験の終わりに SCE にスペクトルを記録することによって測定の過程で恒久的に変更されていないことを確認します。これらは 4.3 に記録されたスペクトルと同一にする必要があり、(図 6) 測定時に活性部位の損失する必要がありますられなかった。</li>
	<li>適切な形式の装置ソフトウェアから絶対吸光度スペクトルをエクスポート (.csv、ASCII、'matlab' Jcamp等) 起源や Matlab などのソフトウェアを使用して処理します。</li>
	<li>
ベースラインは、図 7に示すプロセスを使用して、データを修正します。
	<ol>
<li>小さな識別するために各吸光度スペクトルの二次導関数は範囲 1,800 2,150 cm-1(< 1 mO.D。) 活性部位は、大きくカーブした水を背景にバンド。</li>
		<li>元の吸光度スペクトルのベースライン マーカー ポイントを配置し、'スナップ' 実験スペクトル ポイントを設定します。</li>
		<li>補間スプライン関数または多項式関数を使用して点を基準に適合します。このベースライン関数は実験データからを減算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者は競争の経済的利害関係を宣言しません。

PFIRE は、電極固定化酸化還元タンパク質に対処するために広く適用 IR 分光法です。特に、酸化還元酵素の触媒反応は、高速回転条件下で検出できます。PFIRE メソッドは、直接構造情報を提供しないし、炭素電極で IR の分光学にカップル PFE の技術によって提供される直接の電気化学的制御の時にビルドします。PFIRE アプローチはこうして単独で電気化学から入手可能な情報に化学の洞察力を追加し、非常勉強に適している小分子結合と活性化に関与する酸化還元タンパク質および酵素の。さらに、PFIRE は触媒回転率の依存性がない場合はタンパク質構造変化について情報を提供できます。このような非回転電子転送イベントが大成功.と PFE のフーリエ変換の AC ボルタンメトリーへの拡張が使用されていますが、PFE の '標準' アプリケーションを使用して検出することは困難多い45,46
PFIRE メソッドは、原則、PFE を使用して学ぶことができます任意の酸化還元タンパク質の研究に最適です。したがって、PFE とタンパク質吸着は PFIRE 実験が成功のための重要なステップです。このプロトコルではケーススタディとして大腸菌Hyd1 を用いた PFIRE 法の応用について述べる。36,43ただし、また行った PFIRE テクニックr. eutropha、44から細胞質規制ヒドロゲナーゼとフラビンモノヌクレオチド カーボン ブラックに吸着.40これらの場合は、未変更の高表面積カーボン ブラック (このプロトコルで記述されている)、単純な物理的な吸着は高ければ高い信号対雑音比とレコード良質 IR スペクトルにタンパク質の表面被覆を提供します。吸着のような高いレベルを達成ことはできませんの場合は、電極表面にタンパク質のキャラクタリゼーションを許可するようにたとえば、炭素粒子の表面を変更する必要があります。60,61,62 PFIRE 測定のためグローブ ボックスの使用では嫌気処理必要がありますサンプルを勉強するときのみ必須です。しかし非常に定数の練習と低 (< 80 ° C の露点) にグローブ ボックスの雰囲気によって提供される水蒸気のレベルは非常に小さい結果の抽出を許可する高い信号対雑音を与えます。44ある多くの場合嫌気的環境では、グローブ ボックス、によって提供されるようまたが望ましい (PFIRE 技術に不可欠な) 電気化学測定作用電極で O2削減のため現在を避けるために。
バルク水、実験的バッファーおよびサンプルの吸着を炭素粒子による IR カラムベッド実験スペクトルに大きく貢献するすべてとのバンドが重なる可能性があります、特にへの関心、アミド、II と III の地域、スペクトル。63アミド地域には、フラビンや多くの酸化・還元反応の製品と同様、ニコチンアミド補因子基板など有機の種からの情報も含まれています。NiFe ヒドロゲナーゼの場合アクティブ サイトのνCOとνCNバンド スペクトルの比較的明確な地域の秋、だから PFIRE 技術は、これらの酵素の研究にも最適です。しかし、他のケースは固定された蛋白質のための変更を分離する同位体ラベリング手法と相まって差スペクトルを必要ことがあります。同様のアプローチは、変更を特定する、たとえば、プロトン、構造およびミカエリス-メンテン型錯体の赤外分光法を用いた研究に使用されています。64,65,66 PFIRE したがって、ヒドロゲナーゼの研究に限定されていません, しかし、任意の酸化還元タンパク質を含む (またはその基板、製品や阻害剤を含む) に適用することができます診断赤外活性振動のグループ一酸化炭素 dehydrogeanses、67 nitrogenases、68,14フラビン蛋白、たとえば、40とギ酸脱。
関連技術、セイラは、バイオミメティック環境における膜準蛋白質の研究に非常によく適しています。32セイラは IR の分光学も ATR IR 構成を使用し、ATR プリズム (IRE) の表面 (数 nm) 内で近くにある分子の IR 吸光度を増幅させる表面増強効果を利用の適応です。セイラは絶妙な吸着タンパク質や膜のアーキテクチャ内で発生する、溶媒から競合する信号から比較的自由スペクトルの変化に敏感なため、ソリューションに存在する基質・阻害剤。これは、ここで説明する PFIRE 手法とは対照的やや怒りの表面の上の大きく浸透深さに依存している (〜 1 μ m)、PFIRE が基板により敏感であることを意味、阻害剤の製品やソリューションの提示します。「バルク」溶媒にこの感度向上ができます。基板または製品は、赤外線で直接観察できる、PFIRE スペクトルの長寿命活性種と電極間に関連付けられている製品の形成両方定常動力学をレポートします。69基板と製品の定常状態濃度を観察する能力は一酸化炭素デヒドロゲナーゼ (これは CO に CO2、強い赤外線吸収の可逆的な酸化を触媒する) などの酵素のため特に貴重になりますかギ酸脱水素酵素 (CO2にギ酸の可逆的な酸化を触媒する)。
現時点では、PFIRE は、'集中' のデータ収集と ATR IR ジオメトリの怒りの表面に酵素に使用される巨視的な炭素電極による酵素電極の定常状態速度論的研究に限定されます。この点で NiFe ヒドロゲナーゼの PFIRE 研究、49,50人のサブ売り上げ高反応速度論を研究する過渡吸収の光トリガー IR の分光学を使用してダイアーと同僚の仕事を補足。作業は進行中40分光電気化学セルを小型化して、電極の使用とミリ秒台の時間分解能を達成する必要があります。これは 100-500 の-1、 caまでの回転周波数と酵素のサブ売り上げ高速度論の研究を有効になります、還元と酸化過程の研究が有効になります。
全体的にみて、PFIRE、定常状態において酸化還元酵素の触媒反応の化学的特性を可能にする分光学的手法です。PFIRE のアプローチは、使用高表面積電極を提供する堅牢なタンパク質吸着 ATR IR ジオメトリにより、安易なソリューション exchange と同じ酵素サンプルに実施される複数の化学と電気化学滴定をことができます。酵素機能の中にこのような構造情報の in situ収集する能力は、広い生物電気化学コミュニティのための非常に貴重なツールです。

タンパク質の機能の研究の主な課題には、体内またはのいずれかを使用して、その生理学的役割を行うタンパク質の直接観察は蛋白質のサンプルを分離できるようにその場観察手法の開発が含まれます。同時に測定されるタンパク質の機能の中に両方反応、評価されることができるテクニックの併用の実験手続きおよび使用にプロセスをトリガーまたはコントロールの統合および化学の個々 のステップが必要です。酸化還元タンパク質の場合、これはしばしば正確に制御応用の可能性が、ない直接の化学物質については、化学的に固有に敏感な分光学的手法を提供する電気化学の手法を組み合わせることに相当します。タンパク質の機能に関連付けられている変更。1,2,3明滅現象は様々 な分光学的手法とレベルの電気化学的制御を含む結合の電気化学的および分光学的方法の範囲のための一般的な用語です。多くの蛋白質は人工、水溶性電子ドナーとアクセプターに電子を交換できるし、これは紫外可視、4、5との結合を含む電子伝達を仲介する小分子を使用しての研究で利用されてきた,6,7磁気円二色性8と赤外線5,9,10、11,12,13,14 (IR)分光学。場合の限られた数のそれは蛋白質と電極との間の直接的、拡散制御電子のやり取りを悪用すること証明しています。15,16
触媒反応の実施酸化還元酵素、現在ソリューション電気化学手法による明確な欠点。ソリューションにおける酸化還元メディエーターを介して拡散制御電子転送になるあるレートを制限します。酵素の速度論と機構については失われる、少なくとも実験方法から生じる拡散工芸品からようになりましたにくくなります。直接かつ直接的に電気化学的制御は従って酸化還元タンパク質および酵素の研究のための重要なツールです。タンパク質フィルム電気化学 (PFE) の手法では、電子には直接蛋白質の内で酸化還元補因子またはが転送されることもある電極は、電位のシリーズで偏波としてそのような方法で、電極を固定化した酸化還元タンパク質を採用しています。17,18,19 PFE は酸化還元酵素によって触媒の酸化または還元反応の研究の特定の値の界面電子移動が非常に高いレートで得られる、です。たとえば、 Allochromatium vinosumからのニッケル-鉄 ([NiFe]) ヒドロゲナーゼの触媒離職率 PFE ca 1,000-10,000 の− 1 H2酸化として測定した.20電極の電位は、'on' または 'off' に、触媒と酵素活性の触媒の現在のレポートを有効にするためのトリガーとして機能します。PFE したがって [FeFe] のディ-鉄の活性部位の反応などの可能性に密接に依存する複雑な酵素の反応を分析するための貴重な方法-CO と O2、21を潜在的な誘導やヒドロゲナーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼは22 、23その他複雑な酸化還元酵素の不活性化反応。24
分光学的手法を組み合わせて PFE によって与えられる直接の電気化学的制御にプリンシパルの障壁に起因 1 2 pmol cm-2 [NiFe] ヒドロゲナーゼA. vinosumからの順序の酸化還元酵素の低表面被覆20バルク金属電極上小分子吸着層の場表面科学研究を基準にしています。これは分光学的測定の感度のための課題を提示します。いくつかの分光電気化学的方法は、種類の異なる電極での酸化還元タンパク質を固定化した勉強の報告されている: 透明金属酸化物電極で紫外可視分光法25,26,27蛍光分光法による金電極;28,29表面増強赤外吸収 (セイラ) 分光金電極;30,31,32,33と表面は、主に銀電極のラマン分光学的手法を強化しました。34,35
ここでタンパク質フィルム赤外線電気化学 (PFIRE) と呼ばれる技術で、IR の分光学と PFE を結合する方法をについて説明します。36 PFIRE メソッドは、炭素表面への蛋白質の範囲の吸着性を利用して、減衰全反射率 IR (赤外 ATR) ジオメトリと組み合わせて高表面積炭素電極上に固定された酸化還元酵素を研究します。赤外分光法は、多くの低分子化合物、配位子と補因子の反応性、バインディング、抑制、酸化還元状態を評価するために使用することができます診断の結果として酸化還元酵素とタンパク質の研究に役立ちます。鉄硫黄の中心を NO37研究フラビン蛋白、38,39,40の小分子がヘム センター等へのバインディングの例などがあります。41 ATR IR ジオメトリ構造が最適化された 3 電極 (分光) 電気化学セル42したがって優れた電気化学的制御を提供しています。作用電極の近くに電極を配置することによって、耐溶剤性、潜在的なドリフトを最小限に抑えられます。高表面積カウンター電極を作用電極で酵素の高速回転による高触媒電流と互換性があるされます。分光電気化学セルによるソリューションの流れは、安易な基板, 阻害剤と pH の濃度制御をできます。36,43,44 PFIRE メソッドしたがって、持続的な酵素電極の間に記録されたその場でする IR スペクトルをことができます。36,44 PFIRE もする酸化還元酵素の非触媒プロセスから情報を抽出することは困難ことができます PFE と対照をなして触媒現在、43の不在で化学物質情報を提供することの可能です。45,46
バイメタルの活性部位で Fe に配位した組み込み CO および CN リガンドを含む [NiFe] ヒドロゲナーゼによって触媒 H2酸化に関する研究 PFIRE 法を説明してきました。36,43,44 [NiFe] ヒドロゲナーゼ、PFIRE による研究に特に適してしたがって。PFIRE メソッド定常回転時に存在している種について説明します、したがって実験制御なしヒドロゲナーゼの IR 分光に関する文献の富に加えて重要な追究を提供します上売り上げ高。47,48のダイアーと同僚に NiFe ヒドロゲナーゼ、49,50,51光トリガーを使用していずれか小さな負電位ステップ (を介して使用を適用するを研究する時分割 IR 手法を採用しています。ソリューションのメディエーターと 'ケージ' 電子源) または photolyse バインドされている水素。PFIRE メソッドは現時点では、これらの測定値に合わせて時間分解能を40それは明確に定義された電位の範囲でアクセス還元と酸化触媒プロセスの研究を許可する、大量輸送から無料を提供することはできませんが制限があります。
PFIRE メソッドは、セイラも ATR IR ジオメトリを使用し、電極表面に吸着した分子の IR 吸光度を強化するナノスケール粗金属電極を採用して酸化還元タンパク質の研究から区別されます。30セイラは特に吸着膜タンパク質を研究のための非常に貴重な技術または模倣膜内のアーキテクチャが32金属電極の必要性は、反応のため基質と阻害剤のスコープを制限できます。CN-CO、CO2 等のような小さい分子への電極支援のプロトン化と自己組織化単分子膜の脱離に非常に負の電位で金属表面上問題となります、1,52保護されていない酵素電極金属電極が報告されています。53,54セイラを基準にして PFIRE の不利な点はネイティブまたは模倣膜アーキテクチャで膜タンパク質を組み込むことの相対的な難しさです。ただし、競合する小分子活性化反応に炭素電極の相対的なケトンは、PFIRE 特に生物学的酸化還元に関連する低潜在的なドメインでの酵素電極を研究のための優秀な技術ヒドロゲナーゼによるプロトン還元などのプロセス。1,43
この資料の目的は、電極固定化酸化還元タンパク質、例として大腸菌由来 NiFe ヒドロゲナーゼ 1 (Hyd1) を研究するための手法として PFIRE メソッドを紹介します。サンプル準備、良い基板フローとデータ処理の要件の考慮事項を説明します。PFIRE は広く適用技術、勉強できる吸着炭素電極上にどちらか直接酸化還元のタンパク質 (特徴的な赤外線吸収特性) または電子を交換することができますように表面改質の使用に適して、電極。

<table><tbody><tr><td>分光器</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>外部MCT検出器付き</td></tr><tr><td>ATRアクセサリー</td><td>パイク・テクノロジー</td>ズ <td>GladiATR</td><td>5反射Si IRE</td></tr><tr><td>グローブボックス</td><td>・グローブボックス・テクノロジー・リミテッド</td>で使用するためにカスタマイズ<td>N/A</td><td>嫌気性サンプルの取り扱いと測定のためのカスタム設計の「ウェット」および「ドライ」ボックス</td></tr><tr><td>KBrウィンドウ</td><td>Crystran</td><td>カスタム</td><td>グローブボックスとFTIR分光器の外部ビームとの結合を可能にするため</td></tr><tr><td>追加の光学系</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>PM-IRRASアクセサリーのコンポーネント</td></tr><tr><td>Silicon IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>カスタム</td><td>台形:8.4 mm x 5 mm(大面)、厚さ1 mm、面角約39度</td></tr><tr><td>ポテンショスタット</td><td>メトローム</td><td>オートラボ PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>メトローム</td><td></td><td>ポテンショスタットを制御するためのソフトウェア</td></tr><tr><td>ペリスタルティックポンプ</td><td>ウィリアムソン マニュファクチャリング カンパニー リミテッド</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Pt ワイヤー</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99.95% 純プラチナ ワイヤー、0.014インチ</td></tr><tr><td>直径 カーボンロッド</td><td>WH スミス</td><td>30729209</td><td>0.7 mm HB ペンシル リード</td></tr><tr><td>カーボン ブラック</td><td>キャボット コーポレーション</td><td>ブラック パール 2000</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>遠心フィルター</td><td>メルク ミリポア</td><td>UFC5050BK</td><td>アミコン ウルトラ、50 KDa MW カットオフ</td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5452000018</td><td>ミニスピン</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>フィッシャー</td><td>S/9240/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>フィッシャー</td><td>N/2300/PB17</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンシーラント</td><td>カウ コーニング 東レ(株)</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>カーボンペーパー</td><td>東レ</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 ガス</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 ガス</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>データ分析/グラフ作成ソフトウェア</td></tr><tr><td>Resolutions Pro 4.0</td><td>FTIR分光計を制御するためのソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質フィルム赤外線電気化学 [nife] ヒドロゲナーゼによって h2酸化反応に関する研究の実証

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

蛋白質の内でセンター化学酸化還元を正確に制御を提供する酸化還元タンパク質要求メソッドを理解すること。タンパク質フィルム電気化学、タンパク質が電極表面固定化電極を置き換えます生理的電子ドナーやアクセプタ、その技術は別の範囲の酸化還元反応に機能的な洞察力を提供しています。蛋白質。完全な化学の理解には、追加の構造とメカニズムの洞察力を加えることができる他の手法と組み合わせることに電気化学的コントロールが必要です。ここに示す手法、タンパク質フィルム赤外線電気化学、蛋白質膜の電気化学酸化還元タンパク質の赤外分光法によるサンプリングを組み合わせた。技術は、高表面積カーボン電極上に固定された酸化還元タンパク質をプローブするのに多重反射減衰全反射率ジオメトリを使用します。この電極のフローセルへの取り込みには、pH または溶質濃度測定中に変更するができます。これは特に強力な酸化還元酵素、急速な触媒の売り上げ高を維持および触媒機構の中間的な長命種の分光学的観測を許可する電極で制御できますに対処。大腸菌ヒドロゲナーゼ 1 (H2酸化) の売り上げ高と非回転条件の下で実験手法を示す.

ここでは、我々 は技術、炭素電極の電気化学的直轄分光学的に調査される蛋白質が固定化酸化還元タンパク質フィルムの赤外線電気について説明します。単一蛋白質のサンプルの赤外吸収スペクトルは、さまざまなソリューションの条件の下でされた電位の範囲で記録できます。

タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

本プロトコルの全体的な目的は、タンパク質フィルム赤外分光電気化学（PFIRE）を用いて、非ターンオーバー条件下および定常状態の電極触媒ターンオーバー条件下における、ニッケル鉄ヒドロゲナーゼ還元酵素の活性部位の化学的性質を調査することです。PFIRE法の主な利点は、カーボン電極上に固定化された還元タンパク質に対して、精密な電気化学的制御と赤外分光サンプリングを同時に行うことができる点にあります。この手法は、定常状態の触媒ターンオーバー中に還元タンパク質のどのような状態が存在しているかという、生物物理学および生物電気化学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。手順を開始するために、湿式嫌気グローブボックス内で、20 mgの高比表面積カーボンブラック粒子を1 mLの超純水に懸濁させます。粒子が均一に分散し、静置後1時間以内に沈殿が生じなくなるまで、低出力で15分間以上超音波処理を行います。次に、約7 mg/mLのE.Coli hydrogenase one溶液15 µLを、50 kDa遠心フィルターユニットにロードします。溶液を、ヒドロゲナーゼの等電点に近いpHの低イオン強度交換緩衝液450 µLで希釈します。27,000 ×gで遠心分離し、混合液を50 µLまで濃縮します。緩衝液交換を完了させるため、この濃縮操作をさらに4回繰り返します。次に、20 mg/mLのカーボンブラック分散液5 µLを、バッファー交換後のヒドロゲナーゼと混合します。ヒドロゲナーゼをカーボンブラック粒子に吸着させるため、混合液を0 °Cで一晩保存します。粒子の分散状態を維持するため、定期的に混合液を確認してください。修飾した粒子を27,000 ×gで遠心分離し、上清がほぼ無色であることを確認します。これは、粒子へのヒドロゲナーゼの吸着が良好であることを示しています。高い吸着率を達成することが、実験の成功において極めて重要です。吸着バッファーの最適化は、タンパク質の等電点に近いpHの低イオン強度バッファーを出発点として行います。遠心分離と新鮮な交換バッファーでの再懸濁を3〜5サイクル繰り返し、粒子を洗浄します。粒子混合物を約5 µLまで濃縮し、粒子負荷量を20 mg/mLにします。PFIRE測定の準備を開始するため、硫酸中で15分間、低出力超音波処理を行い、シリコン内部反射素子を洗浄します。続いて硝酸で1時間処理します。その後、素子を超純水で洗浄し、乾燥窒素ガスの気流下で乾燥させます。電気グレードのシリコーンシーラントを使用して、IREを5回反射型ATRアクセサリーのベースプレートに固定します。この際、シーラントがIREの端にとどまるように注意してください。シーラントを完全に乾燥させます。その後、ベースプレートを、FTIR分光光度計の隣に設置されたIR透過窓付きの乾燥非好気性グローブボックス内に運びます。ベースプレートをATRアクセサリーに取り付けます。ラピッドスキャンモードでバックグラウンドスペクトルを取得します。次に、ATRアクセサリーのベースプレートを取り外し、湿式嫌気グローブボックスへ移動させます。酵素修飾カーボンブラック粒子 1 µL を、粒子が完全に乾燥しないように注意しながら、IRE表面に均一にドロップキャストします。酵素修飾粒子混合物を、可能な限り 20 milligrams per milliliter に近い濃度まで濃縮しておくことが重要です。そうでない場合、このステップで粒子をドロップキャストした際に、良好に接続された粒子膜を得ることが困難になる可能性があります。超純水に浸したカーボンペーパーをIRE表面にそっと置き、シリコンシーラントに触れないように注意しながら、粒子膜が完全に覆われるようにしてください。カスタム分光電気化学セルをIREの上に設置します。システムの準備中に酵素を水和状態に保つため、溶液入口から実験バッファーを200 µL加えます。溶液入口と出口をペリスタルティックポンプチューブを用いて実験バッファーが入ったバイアルに接続します。その後、組み立てたセルを乾燥グローブボックスに移します。セルアセンブリをATRアクセサリーに取り付け、チューブをペリスタルティックポンプに接続します。以前に取得したスペクトルをバックグラウンドとして、吸収スペクトルを測定します。MI2バンドが1,540 reciprocal centimetersで強く観察されること、およびヒドロゲナーゼ活性部位のピークが1,850から2,150の領域で検出可能であることを確認してください。実験の準備として、粒子膜に飽和カロメル参照電極に対して-0.8 voltsの還元電位を印加します。実験用バッファーを嫌気性水素ガスで飽和させてください。次に、分光電気化学セルにバッファーを約12 milliliters per minuteで流し始めます。水素飽和実験バッファーの流れにサンプルを一晩浸し、ヒドロゲナーゼを活性化させます。活性化したサンプルの吸収スペクトルを測定し、活性部位のCOおよびCNバンドが複数の還元状態を示していることを確認します。次に、実験用バッファーを嫌気性窒素ガスで飽和させ、セル内にバッファーを流します。飽和カリ形電極に対して0 Vの酸化電位を30分間印加し、吸収スペクトルを測定します。その後、還元電位を30分間印加し、別のスペクトルを測定します。酵素が完全に酸化され、その後還元されたことを確認します。そうでない場合は、セルの電気接続を確認してください。酸素を排除し水素で飽和させた緩衝液を用い、流速を上げて一連のサイクリックボルタモグラムを測定し、実験に最適な流速を決定します。この流量を用いて、さまざまな電位および溶液条件でスペクトルを取得します。E.coli hydrogenase oneのPFIRE測定は、不活性雰囲気下および水素ガスの存在下で、さまざまな電位において行われました。水素雰囲気下で取得されたスペクトルは、触媒的な水素酸化中に存在する活性部位状態の定常状態分布を表しています。その後、nickel-Siからnickel-B状態の形成を通じた、ヒドロゲナーゼの嫌気的酸化および活性化について、電位印加中の様々な時間点でスペクトルを取得し、最初のスペクトルに対する差スペクトルを作成することで調査した。観察されたnickel-Siからnickel-Bへの緩やかな変換は、電流の単調減少と一致していた。また、ヒドロゲナーゼの触媒サイクルのプロトン移動ステップを調査するため、一連の溶液pHにおいてスペクトルを取得した。低pHではニッケル-C状態がより支配的でありながら、高pHではニッケル-L状態がより支配的であった。ニッケル-Cとニッケル-Lの相対濃度のpH依存性は、実験で評価した各pHにおけるそれぞれのピークの最大吸光度から決定された。この手法は、生物電気化学分野の研究者が、ハイドロゲネシスによる水素活性化の定常状態速度論を探索するための道を開くものである。このビデオを視聴することで、典型的なPFIRE実験について十分に理解できるはずです。この手法は、タンパク質フィルム電気化学によって研究可能なあらゆるレドックスタンパク質に適しており、電気化学的測定に直接的な化学的知見を加えることができます。

protein-film-infrared-electrochemistry-demonstrated-for-study-h2

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H₂酸化反応に関する研究の実証

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