Name: 睡眠中のマウスにおけるスペクトルパワーおよび心拍数の低速ダイナミクスの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶマウスの非レム睡眠における神経・心臓活動の協調性の定量化法。標準ポリソムノグラフィーを用いて、外部刺激に対する睡眠応答性を評価し、睡眠障害研究への応用可能性を示す。

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私たちは、この原稿の執筆と慎重な読書への貢献について、すべてのラボメンバーに感謝します。外科手術プロトコールに関する有益なコメントをいただいたGisèleFerrand博士と騒音暴露のためのオリジナルのLabview実行ファイルを提供してくださったJean-Yves Chatton氏に感謝の意を表します。資金は、スイス国立科学財団（Grants 31003A_146244および31003A_166318）とEtat de Vaudによって提供されました。

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著者らは、競合する財務的関心がないと宣言している。

ここでは、EEG、EMG、およびECG変数を統合する非レム睡眠の連続時間プロファイルを確立する方法を示します。これは、ノイズに対して高及び低反発非REM睡眠1中編成され、その上、以前に認識されていないタイムスケールを識別するのに役立つことができ、マウスの睡眠の統合的記述を、開発に向けた最初のステップです。同様の時間的構造も、類似の分析1を介してヒト非レム睡眠において記載されている1 。 ここに示す手順は2つの目標を達成します。まず、我々は、睡眠ポリグラフ技術が、マウスの非レム睡眠期間の全体にわたって確実に脳波およびEMG-ECG信号の両方を提供できることに注目する。心拍は、筋萎縮のために睡眠中のEMGトレースで最も明白であり、筋緊張の増加および時折の筋肉の痙攣のため​​に、非レム睡眠においてより隠されるようになる。 EMG-ECG電極をもっと挿入する筋肉に深く入り込み、可能な限り遠くに置くことは、心臓のR波の振幅を増加させるので、それらは背...

哺乳動物の睡眠は、環境刺激に対する休息と回復力の行動状態である。このような見かけ上の一様性にもかかわらず、睡眠ポリグラフおよび自律神経パラメータは、様々な時間的および空間的スケールで質的および量的に異なる神経および体性状態間で睡眠が移動することを示している1 。数分から数十分にわたり、非REMとレム睡眠との間の切り替えが起こる。非レム睡眠は、脳波の大振幅、低周波活動を伴い、〜0.5〜4Hz付近のスペクトルピークを伴い、レム睡眠はシータバンド（6〜10Hz）において規則的なEEG活動を示し、筋肉atonia 2 。非レム睡眠では、人間は光（S2）と深いスローウェーブスリープ（SWS）を繰り返します。そのネーミングが示すように、これら2つの段階が低く示し、より高い覚醒は、それぞれ、4、3閾値、及びそれらが低frequの密度に主に異なりますスロー波活動（SWA; 0.75〜4Hz）と呼ばれる大脳皮質の脳波のパワー。不均一性は、として広く試合5,6にわたってだけでなく、EEGによってSWAの可変存在によって文書化電位リズムをフィールド、サブセカンドタイムスケールにminute-上S2及びSWSの個々の発作を通して持続しますシグマバンド（10-15 Hz）で、ガンマリズムにスピンドル波を含む高い周波数（80から120ヘルツ）（レビューのために、7、8、9、10を参照されたいです）。 微妙ではなく、これらのバリエーションは人間の睡眠中の皮質状態をスペクトルの極端にシフトさせます。ノンレム睡眠のために、SWAの優位性から、その近似覚醒様活性状態へのこれらの範囲、それらが高周波成分11の実質的な割合が含まれているため<sup&gt;、 12 。ノンレム睡眠は段階に細分化されていないが、げっ歯類や猫では、中間睡眠（IS）と呼ばれる短い期間は、REM睡眠開始13前に出てきます。このようなスピンドル波とSWA非REM睡眠の署名が、依然として存在している間IS中に、そのような海馬のシータ活性としてレム睡眠機能と先斗-geniculo-後頭部波は15、14 2つのスリープ状態のミックスを示す、開始します。それにもかかわらず、ISは、それが抗うつ薬16によって変調され、前の覚醒17の間に新規の物体提示によって変調され、覚醒閾値18の設定に寄与するので、機能的に異なる可能性がある。さらに、自由に動くラットのEEGおよびEMGパラメータの状態空間プロットは、非REM睡眠、REM睡眠および覚醒状態の間で連続する点14のクラスタを示す。 SWAにおける散発的減少は、連結非REM睡眠期間14、19、20の間に低および高周波数成分の相対的な存在下で実質的な変動につながる覚醒またはREM睡眠を入力せずに、またあります。最後に、非レム睡眠時のSWAと高周波数リズムの変化率は、時間的にのみならず、大脳皮質領域間の振幅と同期の地域差も示している19 。 哺乳類の非レム睡眠は一様ではありません。しかし、そのような不均一性が、機能および行動の属性が異なる状態につながるかどうかは不明である。いくつかのタイプの睡眠障害において、連続的な睡眠は、自発的な覚醒および不適切な運動行動によって中断される。また、スペクトルは、EEG 21に高い周波数の相対的な存在でshow変化を解析します呼吸数や心拍数などの自律的なパラメータが含まれます22 。したがって、安定した睡眠状態の秩序のあるシーケンスは撹乱され、皮質および/または自律神経覚醒の要素は制御されない方法で侵入する。したがって、睡眠状態の連続性を理解することは、疾患に関連する可能性がある。さらに、都市環境における環境騒音による睡眠の混乱は、一般的な健康リスクと関連しており、睡眠時の脆弱性が増す瞬間を特定することが重要です23 。 ヒトの睡眠における行動覚醒実験は光非REM睡眠（段階S2）とREM睡眠ショー同等と下覚醒に対し4閾値、SWA-支配非REM睡眠（段階S3）からウェイクアップするために最も困難なことがあることを示しています。短い音刺激の皮質処理は、REM睡眠、S2、およびS3 24の間で実質的に変化し、25、状態固有の皮質活動パターンが感覚処理の最初の段階を調節することを示します。ヒトにおけるノンレム睡眠のために、ノイズに応答してウェイクアップする傾向がEEG 26、27、28にスピンドル波とアルファリズムの存在によって変化します。スピンドルの視床皮質の律動性は、視床および皮質の両方のレベルでシナプスの抑制が増強され、これが知覚処理の減弱に寄与すると考えられている7 。 どのように騒音に耐えられ、脆弱な睡眠期間が時間内に整理され、その決定要因は何ですか？マウスおよびヒトの両方において、我々は最近、神経リズムにおける低速、0.02Hzの振動を同定した。この0.02Hzの振動の位相に依存して、マウスは、覚醒または睡眠のいずれかの外部刺激に対して可変反応性を示した雑音gh。興味深いことに、この振動は心拍数と相関し、自律神経系が睡眠の外部刺激に対する脆弱性の調節に関与することを示している1 。記憶関連の海馬リズムもこのリズムの中で組織されており、その強さは人間の記憶強化の質と相関していた。したがって、0.02Hzの振動は、環境に対する感受性と内部記憶処理の両方を調節するげっ歯類およびヒト非REM睡眠の組織原理であるようである。これは、睡眠状態のマルチパラメトリックかつ継続的な評価の必要性を再度強調し、その機能を認識し、潜在的な脆弱性の部位を特定する。 ここでは、これらの動態の波形を抽出する手順を提示します。これには、EEG / ECoGとEMG-ECG測定、感覚刺激への曝露、分析ルーチン。この手順は、異なる基本的な睡眠機能が連続的に実行される間、絶えず変化するが高度に組織化された警戒状態として睡眠を見るための基礎を提供する。より一般的には、この手順は、健康状態および疾患状態の両方において睡眠中の行動転帰に先行するスペクトルおよび自律神経の特徴を抽出することを目的とするアプローチに適用可能である。

<table><tbody><tr><td>2成分エポキシ接着剤</td><td>ヘンケル</td><td>ロックタイトEA 3450</td><td></td></tr><tr><td>吸収性縫合繊維(プロレン)</td><td>Ethicon</td><td>5-0 FS-3</td><td></td></tr><tr><td>adson鉗子FST</td><td></td><td>11006-12</td><td></td></tr>防<tr><td>腐剤スワブ</td><td>VWR</td><td>149-0332</td><td></td></tr><tr><td>Attane Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>Isoflurane 250mL</td><td></td></tr><tr><td>コネクタ3 x 2チャンネル</td><td>ENA AG</td><td>2.316</td><td>ラスター 2.54 x 2.54 mm; サイズ 5 x 8 x 9 mm; ピンサイズ 5 mm;</td></tr> <tr><td>http://www.ena.ch/ トンボ整流子</td><td>トンボ</td><td>モデル #SL-10</td><td></td></tr><tr><td>EMBLA増幅器</td><td>EMBLA</td><td>A10増幅器</td><td></td></tr><tr><td>細ハサミ</td><td>FST</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>フラットヘッド 金メッキ鋼ネジ</td><td>J.I. Morris</td><td>FF00CE125</td><td>https://jimorrisco.com/</td></tr><tr><td>金線</td><td>CMSA</td><td>T.69 5gr</td><td>http://www.cmsa.ch/en/</td></tr> <tr><td>止血スポンジ</td><td>ファイザー</td><td>ゲルフォーム</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素系消毒剤 (ベタジン)</td><td>ムンディファーマ</td><td>標準液 60mL</td><td></td></tr><tr><td>コメット ドリル鋼 1/005PM104</td><td>UNOR AG</td><td>22310</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 解析ソフトウェア</td><td>MathWorks</td><td>R2016b</td><td>https://ch.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>Fine Science Tools</td><td>96758</td><td></td></tr><tr><td>マウス ガス麻酔ヘッド ホルダー</td><td>Kopf Instruments</td><td>モデル 923-B</td><td>http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/</td></tr> <tr><td>眼軟膏</td><td>Pharmamedica</td><td>VITA-POS</td><td></td></tr><tr><td>Paladur (液体)</td><td>UNOR AG</td><td>2260215</td><td>歯科用セメント用</td></tr><tr><td>パラビット(粉末)</td><td>UNOR AG</td><td>5410929</td><td>歯科用セメント</td></tr><tr><td>小動物 定位固定装置 Kopf</td><td>Instruments</td><td>モデル 930</td><td>http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/</td></tr> <tr><td>はんだ付けワイヤ</td><td>スタノール</td><td>593072</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラー - ミニ直腸プローブ</td><td>Phymep</td><td>4090502</td><td>http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/</td></tr> <tr><td>温度コントローラー-加熱パッド</td><td>Phymep</td><td>4090205</td><td>http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/</td></tr></tbody></table>

睡眠中のマウスにおけるスペクトルパワーおよび心拍数の低速ダイナミクスの定量化

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

覚醒、非眼球運動（非REM）睡眠、およびレム睡眠の3つの警戒状態が哺乳動物の生活を支配する。行動の神経相関が自由に動く動物で同定されるにつれて、この3つの細分はあまりにも単純化する。覚醒時には、瞳孔径や交感神経のバランスなどの周辺パラメータとともに、大域的および局所的な皮質活動のアンサンブルが様々な程度の覚醒を定義する。感覚刺激および覚醒、およびおそらく他の睡眠機能に対する回復の程度が徐々に変化し、末梢の生理状態がどのように変化するかという点で、睡眠が脳状態の連続体を形成する程度は不明のままである。睡眠中の複数のパラメータをモニターする方法を進歩させ、これらの機能的属性の配置に帰属する研究は、睡眠の理解を、多くの有益な効果が存在しなければならない多機能プロセス生きる睡眠状態を特徴づける新規パラメータを特定することは、睡眠障害における新規な診断手段の機会を開くであろう。 我々は、標準的な睡眠ポリグラフ記録技術を用いて脳波（EEG）/電気コルチコグラム（ECoG）、筋電図（EMG）、および心電図（ECG）信号の組み合わせ監視および分析を介してマウス非REM睡眠状態の動的変化を記述する手順を提示する。このアプローチを使用して、我々は、マウス非REM睡眠が、外部刺激に対する高低の脆弱性の連続的な25秒の間隔を生成する調整された神経振動および心臓振動の周期に組織化されることを見出した。したがって、統合された非レム睡眠中に、中枢および自律神経系が協調して行動的に異なる睡眠状態を形成する。我々は、自由に眠っているマウスのこれらのサイクルを追跡するために、睡眠ポリグラフ（ すなわち、 EEG / EMGとECGとの組み合わせ）モニタリングのための手術操作を提示し、それらのダイナミクス、および覚醒の可能性におけるそれらの役割を評価するための音響刺激プロトコルを含む。私たちのアプローチはすでに人間の睡眠にまで拡張されており、哺乳動物の非レム睡眠状態の共通の組織原理を解明することを約束しています。

図 2A （上のパネル）は、説明したように埋め込まれた睡眠ポリグラフ電極を介して記録された自発睡眠 - 覚醒行動の100分のストレッチを示す（ 図1参照）。非レム睡眠発症時のEEGおよびEMG振幅の増減ははっきりとわかる。断続的なレム睡眠は、EEG振幅の減少と、この圧縮された時間スケールでは見えないEMGトーンのさらなる低下によって特徴付けられる。 1つの非レム睡眠時の試合をズームインすると、脳波の高振幅低速波と、EMG-ECGトレースにおいて、心拍数のRR間隔が垂直偏向として重ね合わされる低筋活動が明らかになる（ 図 2A 、中および下パネル）。 FFTは、すべての4-s期（ 図 2B ）におけるSWAの優位性を明らかにする。平均シ...

ここでは、聴覚刺激に対する睡眠応答性を調節するマウスにおける非レム睡眠の神経および心臓変数の時間的ダイナミクスを記述するための実験的および分析的手順を提示する。

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior ...

この手順の全体的な目標は、マウスのノンレム睡眠中に神経活動と心臓活動がどのように調整されるかを説明することです。脳波、筋電図、および心電図の信号を監視および分析します。この方法は、睡眠分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、睡眠が進化的に保存された2つの重要で保存されたニーズをどのように調和させるかなどです。これは、連続的で壊れやすいものです。この手法の主な利点は、標準的な睡眠ポリグラフ法を使用して、外部刺激に対するさまざまな行動反応に基づく新しい方法でノンレム睡眠をスコアリングすることです。この手法のアイデアを最初に思いついたのは、眠っているマウスが、目を覚ますときや寝るときなど、ノイズに対してさまざまな反応を示すことを観察したときでした。一般的に、この方法に不慣れな人は、外科的スキル、最小限の実験、および高度な分析が組み合わされているため、苦労するでしょう。この手法の視覚的なデモンストレーションは、いくつかの重要なステップがこの分野では新しいものであるため、非常に重要です。特に行動デザインとデータ分析に関して。この技術の意味は、人間の睡眠障害の診断にまで及びます。それは、非常に壊れやすい睡眠の瞬間を特定するからです。手順を開始するには、長さ0.5センチメートルの金線を使用してEEGエコジオレクトロードを準備し、それぞれが金メッキ鋼ネジの上にはんだ付けします。次に、70%エタノールでそれらをきれいにします。次に、長さ3〜4センチメートルの金線を備えた2つのEMG-ECG電極を準備します。ワイヤーを一方の端から1センチメートルの角度で90度の角度で曲げ、もう一方の端にコイルを準備します。両端の間でワイヤーを曲げて、小脳とラムダの間の骨の表面プロファイルに対応する小さな曲率を作成します。その後、ベースでメスピンとオスピンの両方のコネクタをテープで覆って、6チャネルのメス-オスヘッドコネクタを準備します。次に、はんだ付けプロセスを容易にするために、コーナーのピンにスズを追加します。このステップでは、麻酔をかけた動物を口の位置を特定して、定位固定装置の上に置きます。これにより、マウスの頭が固定されます。次に、イヤーバーを頭蓋骨に配置して頭を固定します。その後、頭蓋骨の中央にある皮膚を持ち上げ、首の上部から目の高さまで正中線に沿って皮膚の持ち上げた部分をそっと切ります。次に、頭皮を取り除きます。窓が、頭蓋骨のブレグマとラムダ亀裂がはっきりと見えるように十分に大きいことを確認してください。骨へのアクセスを確保するために、ブルドッグセラフィンで両側の皮膚を固定します。次に、メスで結合組織を慎重に取り除きます。ヨウ素ベースの消毒剤でその領域をきれいにし、消毒スワブで頭蓋骨を乾かします。次に、鋭利なメスの刃を使用して頭蓋骨を引っ掻き、きれいでつや消しの骨表面を取得します。メスの先端だけを使って、溝の間に1〜2ミリメートルの距離で木立のメッシュワークのようなグリッドを引っ掻きます。その後、マイクロドリルを使用して頭蓋骨の特定の場所で4回の開頭術を行います。穴を開ける際には、パスツールピペットで骨の粉を吹き飛ばし、消毒スワブで出血をきれいにします。出血が発生した場合は、プロセスを再開する前に、出血が完全に停止していることを確認してください。止血スポンジを使用して止血を促進します。止血クランプにネジを固定します。左半球で、開頭術に2本の金メッキネジを通します。クランプを開頭術の上で垂直に保持し、垂直位置から逸脱しないようにネジを回転させます。止血クランプを静かに開いてネジを外します。右半球で、開頭術を通して以前に準備した電極をねじ込みます。頭蓋骨の中央部分に接着剤を一滴垂らして、左のEMG-ECGがしっかりと接着するようにします。鉗子で首の筋肉から皮膚の境界を慎重に持ち上げ、コイル状の端を筋肉に巻き付けてEMG-ECGワイヤーを挿入します。睡眠中に心臓のECG信号を検出するには、EMG-ECGワイヤーが筋肉に約0.8〜1センチメートルの深さまで挿入されていることを確認してください。左のEMG-ECGを左後部の固定ネジの隣に置きます。手順を繰り返して、正しいEMG-ECGを挿入します。右のEMG-ECGを左前方の固定ネジの隣に配置します。ループの端が互いにできるだけ離れて配置されていることを確認してください。心拍数を確実に検出するためには、EMG-ECGワイヤーを筋肉に十分に深く挿入することが重要です。へらを使用して、2液性エポキシ接着剤をネジの間と周りの頭蓋骨に塗布します。光の中で乾かしますが、過度の照明から動物の目を保護してください。小さなワニ型ランプを使用して、インプラントの高さを最小限に抑えるために、コネクタピンをできるだけ近くに配置するようにしてください。コネクタの角にある4つのピンを4本のワイヤにはんだ付けします。はんだ付けチップとの接触時間を最小限に抑えると、ネジが急速に加熱されます。次に、接着剤とコネクタの間のスペースを歯科用セメントで満たし、はんだ付けされた部品を覆います。滑らかな表面を作成し、動物を傷つける可能性のある鋭いエッジを避けます。また、皮膚に触れるとかゆみの原因になりますので避けてください。次に、ブルドッグセラフィンを取り外します。ヨウ素ベースの消毒剤で傷口を消毒します。必要に応じて、コネクタの前面と後ろに縫合糸点を設けて傷口を閉じます。その後、1週間毎日動物を監視し、体重減少、活動の低下または異常な活動、および感染の兆候を探します。手術後5〜6日で、録音ケーブルを動物のヘッドコネクタに接続し、ホームケージに入れておきます。動物がその状態に慣れて自然に眠るように、録音開始のさらに4〜5日待ってください。市販の睡眠ポリグラフ検査ソフトウェアを使用して、2000 x ゲイン、取得時の 2000 ヘルツのサンプリング レート、取得後の 200 ヘルツにサンプリング ダウン サンプリングなどの一般的な設定を使用して、48 時間にわたって EEG および EMG-ECG データを記録します。すべてのEEGトレースに0.7ヘルツのハイパスフィルターを適用し、すべてのEMG-ECGトレースに10ヘルツのハイパスフィルターを適用します。このデモでは、マウスは 40 秒以上スリープ状態になっています。これは、EEGの特徴的な低周波、高振幅信号とEMGトレースの低筋緊張です。マウスがノイズを再生する前に少なくとも40秒間安定して眠り、睡眠の分析のための長いベースラインを確保するために、目覚めたり眠ったりする前に眠ることが重要です。さて、音響刺激、ここではホワイトノイズが配信されます。この場合、マウスは 10 秒以内にウェイクアップします。マウスがウェイクアップすると、EEGは非同期になることに注意してください。別のケースでは、ノイズが20秒以上配信されていても、マウスはウェイクアップしません。EEGは非同期ではないことに注意してください。ここに示されているのは、ノイズが発生する前の40秒間とノイズの20秒間のEEGの生のトレースと灰色の対応するEMG-ECG信号です。これはスリープスルーイベントです。そして、これはウェイクアップイベントの一例です。ここでは、ノイズが発生する前の 40 秒のウィンドウでのシグマ パワー ダイナミクスの対応する分析データを、スリープ スルーとウェイクアップについて示しています。この分析の主な結果は、シグマパワーが、スリープスルーイベントではノイズ発生前の谷にあり、ウェイクアップイベントではピークに達することです。以前に提示したイベントによる起床と睡眠とは対照的に、レム睡眠への早期移行ではイベントを破棄しました。また、ノイズが発生する前に早めに起きるというイベントも破棄しました。この手順を試行する際は、EMG信号がノンレム睡眠中に心拍数を検出することを確認することが重要です。さらに、解析手順を理解し、ソフトウェアスクリプトで実装して、インフラ低速振動を抽出する必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、局所的な電気生理学的記録やイメージングアプローチなどの他の方法を実行して、定義された脳領域の活動パターンを追跡することができます。再開発後、この技術は、人間の睡眠の分野の研究者が、健康な睡眠者と睡眠障害患者のさまざまな睡眠段階で神経活動と心臓活動がどのように組織化されているかを調査する道を開きます。このビデオを見た後、音響刺激に対する睡眠マウスの行動反応性に基づいて、ノンレム睡眠を遡及的にスコアリングおよび分析する方法を十分に理解できるはずです。

quantifying-infra-slow-dynamics-spectral-power-heart-rate-sleeping

Research

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神経科学

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