睡眠中のマウスにおけるスペクトルパワーおよび心拍数の低速ダイナミクスの定量化

この手順の全体的な目標は、マウスのノンレム睡眠中に神経活動と心臓活動がどのように調整されるかを説明することです。脳波、筋電図、および心電図の信号を監視および分析します。この方法は、睡眠分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、睡眠が進化的に保存された2つの重要で保存されたニーズをどのように調和させるかなどです。これは、連続的で壊れやすいものです。この手法の主な利点は、標準的な睡眠ポリグラフ法を使用して、外部刺激に対するさまざまな行動反応に基づく新しい方法でノンレム睡眠をスコアリングすることです。

この手法のアイデアを最初に思いついたのは、眠っているマウスが、目を覚ますときや寝るときなど、ノイズに対してさまざまな反応を示すことを観察したときでした。一般的に、この方法に不慣れな人は、外科的スキル、最小限の実験、および高度な分析が組み合わされているため、苦労するでしょう。この手法の視覚的なデモンストレーションは、いくつかの重要なステップがこの分野では新しいものであるため、非常に重要です。

特に行動デザインとデータ分析に関して。この技術の意味は、人間の睡眠障害の診断にまで及びます。それは、非常に壊れやすい睡眠の瞬間を特定するからです。

手順を開始するには、長さ0.5センチメートルの金線を使用してEEGエコジオレクトロードを準備し、それぞれが金メッキ鋼ネジの上にはんだ付けします。次に、70%エタノールでそれらをきれいにします。次に、長さ3〜4センチメートルの金線を備えた2つのEMG-ECG電極を準備します。

ワイヤーを一方の端から1センチメートルの角度で90度の角度で曲げ、もう一方の端にコイルを準備します。両端の間でワイヤーを曲げて、小脳とラムダの間の骨の表面プロファイルに対応する小さな曲率を作成します。その後、ベースでメスピンとオスピンの両方のコネクタをテープで覆って、6チャネルのメス-オスヘッドコネクタを準備します。

次に、はんだ付けプロセスを容易にするために、コーナーのピンにスズを追加します。このステップでは、麻酔をかけた動物を口の位置を特定して、定位固定装置の上に置きます。これにより、マウスの頭が固定されます。

次に、イヤーバーを頭蓋骨に配置して頭を固定します。その後、頭蓋骨の中央にある皮膚を持ち上げ、首の上部から目の高さまで正中線に沿って皮膚の持ち上げた部分をそっと切ります。次に、頭皮を取り除きます。

窓が、頭蓋骨のブレグマとラムダ亀裂がはっきりと見えるように十分に大きいことを確認してください。骨へのアクセスを確保するために、ブルドッグセラフィンで両側の皮膚を固定します。次に、メスで結合組織を慎重に取り除きます。

ヨウ素ベースの消毒剤でその領域をきれいにし、消毒スワブで頭蓋骨を乾かします。次に、鋭利なメスの刃を使用して頭蓋骨を引っ掻き、きれいでつや消しの骨表面を取得します。メスの先端だけを使って、溝の間に1〜2ミリメートルの距離で木立のメッシュワークのようなグリッドを引っ掻きます。

その後、マイクロドリルを使用して頭蓋骨の特定の場所で4回の開頭術を行います。穴を開ける際には、パスツールピペットで骨の粉を吹き飛ばし、消毒スワブで出血をきれいにします。出血が発生した場合は、プロセスを再開する前に、出血が完全に停止していることを確認してください。

止血スポンジを使用して止血を促進します。止血クランプにネジを固定します。左半球で、開頭術に2本の金メッキネジを通します。

クランプを開頭術の上で垂直に保持し、垂直位置から逸脱しないようにネジを回転させます。止血クランプを静かに開いてネジを外します。右半球で、開頭術を通して以前に準備した電極をねじ込みます。

頭蓋骨の中央部分に接着剤を一滴垂らして、左のEMG-ECGがしっかりと接着するようにします。鉗子で首の筋肉から皮膚の境界を慎重に持ち上げ、コイル状の端を筋肉に巻き付けてEMG-ECGワイヤーを挿入します。睡眠中に心臓のECG信号を検出するには、EMG-ECGワイヤーが筋肉に約0.8〜1センチメートルの深さまで挿入されていることを確認してください。

左のEMG-ECGを左後部の固定ネジの隣に置きます。手順を繰り返して、正しいEMG-ECGを挿入します。右のEMG-ECGを左前方の固定ネジの隣に配置します。

ループの端が互いにできるだけ離れて配置されていることを確認してください。心拍数を確実に検出するためには、EMG-ECGワイヤーを筋肉に十分に深く挿入することが重要です。へらを使用して、2液性エポキシ接着剤をネジの間と周りの頭蓋骨に塗布します。

光の中で乾かしますが、過度の照明から動物の目を保護してください。小さなワニ型ランプを使用して、インプラントの高さを最小限に抑えるために、コネクタピンをできるだけ近くに配置するようにしてください。コネクタの角にある4つのピンを4本のワイヤにはんだ付けします。

はんだ付けチップとの接触時間を最小限に抑えると、ネジが急速に加熱されます。次に、接着剤とコネクタの間のスペースを歯科用セメントで満たし、はんだ付けされた部品を覆います。滑らかな表面を作成し、動物を傷つける可能性のある鋭いエッジを避けます。

また、皮膚に触れるとかゆみの原因になりますので避けてください。次に、ブルドッグセラフィンを取り外します。ヨウ素ベースの消毒剤で傷

必要に応じて、コネクタの前面と後ろに縫合糸点を設けて傷口を閉じます。その後、1週間毎日動物を監視し、体重減少、活動の低下または異常な活動、および感染の兆候を探します。手術後5〜6日で、録音ケーブルを動物のヘッドコネクタに接続し、ホームケージに入れておきます。

動物がその状態に慣れて自然に眠るように、録音開始のさらに4〜5日待ってください。市販の睡眠ポリグラフ検査ソフトウェアを使用して、2000 x ゲイン、取得時の 2000 ヘルツのサンプリング レート、取得後の 200 ヘルツにサンプリング ダウン サンプリングなどの一般的な設定を使用して、48 時間にわたって EEG および EMG-ECG データを記録します。すべてのEEGトレースに0.7ヘルツのハイパスフィルターを適用し、すべてのEMG-ECGトレースに10ヘルツのハイパスフィルターを適用します。

このデモでは、マウスは 40 秒以上スリープ状態になっています。これは、EEGの特徴的な低周波、高振幅信号とEMGトレースの低筋緊張です。マウスがノイズを再生する前に少なくとも40秒間安定して眠り、睡眠の分析のための長いベースラインを確保するために、目覚めたり眠ったりする前に眠ることが重要です。

さて、音響刺激、ここではホワイトノイズが配信されます。この場合、マウスは 10 秒以内にウェイクアップします。マウスがウェイクアップすると、EEGは非同期になることに注意してください。

別のケースでは、ノイズが20秒以上配信されていても、マウスはウェイクアップしません。EEGは非同期ではないことに注意してください。ここに示されているのは、ノイズが発生する前の40秒間とノイズの20秒間のEEGの生のトレースと灰色の対応するEMG-ECG信号です。

これはスリープスルーイベントです。そして、これはウェイクアップイベントの一例です。ここでは、ノイズが発生する前の 40 秒のウィンドウでのシグマ パワー ダイナミクスの対応する分析データを、スリープ スルーとウェイクアップについて示しています。

この分析の主な結果は、シグマパワーが、スリープスルーイベントではノイズ発生前の谷にあり、ウェイクアップイベントではピークに達することです。以前に提示したイベントによる起床と睡眠とは対照的に、レム睡眠への早期移行ではイベントを破棄しました。また、ノイズが発生する前に早めに起きるというイベントも破棄しました。

この手順を試行する際は、EMG信号がノンレム睡眠中に心拍数を検出することを確認することが重要です。さらに、解析手順を理解し、ソフトウェアスクリプトで実装して、インフラ低速振動を抽出する必要があることを忘れないでください。この手順に続いて、局所的な電気生理学的記録やイメージングアプローチなどの他の方法を実行して、定義された脳領域の活動パターンを追跡することができます。

再開発後、この技術は、人間の睡眠の分野の研究者が、健康な睡眠者と睡眠障害患者のさまざまな睡眠段階で神経活動と心臓活動がどのように組織化されているかを調査する道を開きます。このビデオを見た後、音響刺激に対する睡眠マウスの行動反応性に基づいて、ノンレム睡眠を遡及的にスコアリングおよび分析する方法を十分に理解できるはずです。