光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

本実験の全体的な目的は、光干渉断層計（OCT）を用いて、網膜厚の正確な評価を迅速に得ることです。OCTは、視神経症などの眼科学分野における重要な疑問の解決に寄与します。この手法の主な利点は、マウスの網膜神経節細胞における構造的変化を検出するための非侵襲的な方法であることです。

この手法は、非侵襲的で安全であり、視神経症における治療効果を検証するための信頼性の高い方法であるため、非常に有用です。まず、レンズに適した参照アームの設定を調整します。次に、電源とコンピュータを起動します。

コンピュータの準備ができたら、イメージングプログラムを起動します。新しい臨床研究を作成し、必要なプロトコルを追加してください。患者検査セクションに移動し、検査のデフォルト設定を行います。

「患者検査」セクションの「患者を追加」をクリックして新しい患者を追加し、関連する患者情報を入力します。次に、「検査を追加」、「検査開始」をクリックし、リストからプリセットスキャンを追加して、最初に測定する眼から始まる目的のプロトコルを選択します。データ取得の少なくとも15分前に、テスト対象となるすべてのマウスの両眼に、室温の10%phenylephrine点眼液を点眼します。

その後、過剰な試薬を除去し、室温の0.5% tropicamideを点眼します。撮影の約5分前に全身麻酔を導入します。直後に、各眼に0.4% oxybuprocaine hydrochlorideを投与し、溶液を3秒間保持して眼の麻酔および固定を行います。

次に、点眼薬を取り除き、10%フェニレフリンおよび0.5%トロピカミドの点眼を繰り返します。撮像に十分な散瞳が得られたら、角膜の水分を保持するために粘性の高いグリコールベースの点眼薬で眼を潤し、マウスを外科用ガーゼで包んで保温します。スポンジまたは綿芯を用いて、0.3%ヒプロメロースを添加した眼科用ゲルを各眼に薄く塗布します。

その際、まつ毛とひげを脇に避けておきます。マウスをカセットに配置し、頭をまっすぐ前方に向けさせ、バイトバーを慎重に口に装着します。検査対象となる眼側の動物の下にコットンロールを敷きます。

次に、マウス専用レンズにエイミングチップのクリップを留めたまま、z軸トランスレーターねじを反時計回りに回して、レンズを目に近づけます。カセットを回転・旋回させ、バイトバーおよびx軸トランスレーターねじを回して、実験対象の目がレンズを直視するようにマウスの位置を調整します。目の光軸とレンズが一致したら、検査における最初のスキャンを選択してください。

「start aiming」をクリックし、z-translatorネジを使用して、左パネルで網膜を垂直方向に、右パネルで水平方向に移動させます。カセットを回転させて視神経乳頭を上下に動かし、右パネルの中央に配置します。bite barネジを使用して右パネル内の網膜を真っ直ぐにし、カセットを旋回させて視神経乳頭を左パネルの中央に配置します。

次に、x-translatorネジを使用して左パネル内で網膜の水平を出し、各モジュレーターの主な機能を念頭に置きながら、視神経乳頭が完全に中心にくるように網膜の位置をさらに調整します。網膜が所定の位置に配置されたら、[start snapshot]をクリックしてスペクトラルドメイン光干渉断層計（SD-OCT）によるスキャンを開始してください。スキャンデータとレポートの保存を忘れないようにしてください。

必要に応じて中心合わせを調整します。スキャンが完了したら、レンズを後退させ、先ほど実演した通りに2つ目の眼を配置します。2つ目の眼のスキャンが終了した後、マウスをカセットから取り出し、両眼に0.3% hypromellose含有の眼科用ゲルを塗布し、完全に回復するまでモニタリングを行いながら加熱プレートの上に置いてください。

網膜神経節細胞に焦点を当てるには、ImageJ用に作成されたMRI retina toolマクロを使用します。MRI retina toolを開き、polygon selection toolを修正して、対象の画像を読み込みます。Mをクリックして測定を開始し、次にEをクリックして水平位置を調整します。新しく開いたregion of interest managerウィンドウで、最初のカセットを選択してください。

青いポリゴンをクリックし、画像内の測定レイヤーの境界をクリックして、1つ目のカセットの位置を調整します。関心領域（ROI）マネージャーウィンドウで2つ目のカセットを選択し、2つ目のカセットを調整します。その後、「R」をクリックして網膜を再測定し、測定ウィンドウで結果を確認します。

スペクトラルドメインOCTスキャンの画質は、網膜断層像ほど高くはありませんが、OCTを用いることでより多くの層を可視化することが可能です。OCTスキャンでは網膜層の測定が容易であり、神経節細胞層を含む網膜神経線維層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、内節・外節層、網膜色素上皮、および脈絡膜までを網羅できるため、網膜全体の複雑な解析が行えます。ここで実演する網膜厚のOCT測定では、視覚障害を持つOPA1遺伝子変異女性マウスにおいて、神経節細胞複合体および乳頭周囲網膜神経線維層の漸進的な肥厚が認められることが示されます。

標準的なキャリパーと自作のキャリパーを用いて神経節細胞層の網膜神経線維厚を比較したところ、標準的なキャリパーは厚みがあり、薄い層の境界に配置することが困難であるため、自作のキャリパーよりも有意に薄い測定値を示すことが実証されました。習得すれば、正しく実施することでこの手法は15分で完了できます。OCTの開発後、眼科学分野の研究者がマウス網膜の構造的変化を分析することが可能となりました。

このビデオを視聴することで、マウスの網膜神経節細胞に対するOCTイメージングの実施および解析方法について十分に理解できるはずです。