PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

PIP-on-a-chipアッセイの全体的な目標は、定量的なラベルフリーの方法でタンパク質膜相互作用を評価することです。タンパク質膜の相互作用は、細胞とその病原体の非常に多くのプロセスの中心ですが、これらの相互作用を研究する技術はほとんどありません。この技術の利点は、単純体積が少なく、リガンドや受容体の標識要件がないこと、および生理学的に適切な方法で膜相互作用を試験できることです。

ウイルスの多くの治療標的は膜タンパク質であり、これらの標的タンパク質の研究はしばしば界面活性剤を用いた溶液中で行われる。私たちの技術は、より生物学的に関連性のある代替手段を提供します。このアッセイは、タンパク質と膜との相互作用をモニタリングできることがわかりますが、実際には非常に汎用性の高いアッセイであり、鉄膜、低分子膜、さらにはペプチド膜の相互作用をモニタリングするために使用できます。

まず、ポリジメチルシロキサンまたはPDMSプレポリマーと硬化剤を10:1の比率で、大型のプラスチック製計量ボートで混合します。混合物を真空中で1時間、真空強度500tor以下で脱気します。同じSU8マイクロパターンの複数の複製を含むシリコンマスターを大きなプラスチック計量ボートに置き、脱気PDMSを注ぎ、60°Cのドライオーブンで一晩硬化させます。

翌日、シリコンマスターからPDMSを手でそっと剥がします。各マイクロパターンの境界を長方形でマークするには、外科用メスと定規を使用します。次に、PDMSをブロックに切断し、各マイクロチャネルの両端に生検パンチで16個の穴を開けて、直径1.0ミリメートルの穴を開けます。

ピペットは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール4、5-ビスリン酸、およびpH感受性蛍光プローブの体積を1つの20ミリリットルガラス換気バイアルに計算しました。混合物を化学ヒュームフード内の窒素ガスの流れで10分間、または溶媒が蒸発してバイアルの底に薄い脂質膜が形成されるまで乾燥させます。次に、混合物を真空下で10ミリターの真空強度で少なくとも3時間乾燥させ、残留有機溶媒を除去します。

乾燥した脂質フィルムを5ミリリットルのランニングバッファーで再水和し、再水和した脂質を室温で30分間、動作周波数35キロヘルツの超音波浴に入れます。小胞懸濁液を液体窒素と摂氏40度の水浴で凍結融解して、単層小胞を取得します。凍結融解を10回繰り返し、小胞懸濁液を0.1ミクロンのトラックエッジポリカーボネート膜に押し出し、脂質押出機を使用して小さな単層小胞を濃縮します。

押し出しを10回繰り返します。水洗浄ボトルを使用して穴から脱イオン水を噴射し、PDMSブロックの入口と出口に詰まりがないかテストし、PDMSブロックを窒素ガスで乾燥させます。次に、PDMSブロックと事前に洗浄したカバースリップを酸素プラズマシステムのサンプルチャンバー内に置きます。

PDMSブロックとカバースリップを酸素プラズマで45秒間露出させ、電力設定を75ワット、酸素流速を毎分10立方センチメートル、真空強度を200ミリターに設定します。次に、酸素プラズマ処理直後のカバースリップとの接触にPDMSブロックのパターン面を配置します。軽く押して、接触部の気泡を取り除きます。

デバイスを摂氏100度の水平なホットプレートに3分間置き、接着を強化します。100%エタノールを含む濡れた糸くずの出ないワイプを使用して、デバイスの上部と下部からほこりの粒子を取り除きます。次に、ガラス製の顕微鏡スライドの上にデバイスをテープで貼り付けます。

100マイクロリットルのホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート含有小胞を0.65ミリリットルの微量遠心チューブに移します。6.4マイクロリットルの0.2正常塩酸を追加して、溶液のpHを約3/2に調整します。pH調整された小さな単層小胞溶液の10マイクロリットルを入口から各チャネルにピペットで固定し、溶液が出口に到達するまでピペットで圧力をかけます。

チップをピペットから取り外し、デバイスに接続したままにします。各チャネルについてこの手順を繰り返した後、室温で10分間デバイスをインキュベートし、デバイスアセンブリの直後にマイクロチャネルへの小胞の注入を行う必要があります。一方、インレットチューブとアウトレットチューブのセットをピンセットでカットし、アウトレットチューブセットをデバイスに接続し、デバイスを顕微鏡ステージにテープで固定します。

インレットチューブセットの一端を円錐形のチューブに含まれる25ミリリットルのランニングバッファーに沈め、テープで固定されていることを確認します。ラボジャッキを使用して、コニカルチューブをデバイスよりも高い地面に置き、重力流を介して溶液をマイクロチャネルに押し込みます。インレットチューブごとに、シリンジを使用して、チューブの自由端から1ミリリットルのランニングバッファーを引き出します。

ピペットチップをインレットから取り外し、インレットチューブの自由端をデバイスに挿入します。このプロセスを繰り返して、すべてのインレットチューブピースをデバイスに接続します。チャネルに流れるランニングバッファーは、破裂していない余分な小胞を除去し、二重層を実験条件に平衡化するのに役立ちます。

次に、顕微鏡制御ソフトウェアを開きます。左側のパネルで、顕微鏡タブをクリックし、10倍対物レンズを選択します。ライブをクリックしてから、ツールバーのAlexa 568画像アイコンをクリックし、微調整ノブと粗調整ノブを使用して、マイクロチャネルに焦点を合わせます。

デバイスをスキャンして、SLBとチャネルの品質を確認します。次に、ツールバーのFLシャッター閉じ画像アイコンをクリックし、取得タブをクリックして、基本調整の下で露光時間を選択します。露光時間を 200 ミリ秒に設定します。

左側のパネルで、多次元集録をクリックします。フィルターメニューで、赤いチャンネルを選択します。次に、タイムラプスメニューをクリックし、時間間隔を5分、期間を30分、ラプスメニューを設定します。

測定タブで円ツールを選択し、任意のチャネルに円を描きます。円を選択した状態で右クリックし、プロパティを選択します。プロファイルタブで、すべてのTをチェックして、蛍光強度を時間の関数として表示します。

次のステップに進む前に、この曲線が平衡を示すプラトーに達していることを確認してから、バッファー溶液をデバイスと同じ地面に下げて流れを停止します。一度に1つずつ、各出口チューブを取り外し、ピペットを使用して各タンパク質希釈液の200マイクロリットルを出口チャネルに適用します。圧力をかけず、重力に任せてください。

チップをピペットから取り外し、マイクロ流体デバイスに取り付けたままにします。チャネルごとにこのプロセスを繰り返し、このプロセス中に気泡がチャネルに導入されないようにします。次に、インレットチューブをマイクロ流体デバイスの下の地面まで下げて、マイクロチャネルを介してタンパク質の流れを開始します。

チューブの自由端を廃棄物容器にテープで固定します。プレクストリンホモロジードメインの希釈液を30分間流します。ソフトウェアの左側のパネルにある[タイムラプス]タブで、[開始]をクリックして、イメージングを再開します。

ここに示されているのは、マイクロチャネル内のSLBを含むホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェートの代表的な図です。プレクストリンホモロジードメインを指示された濃度で追加する前と後で。マイクロチャンネル全体でスキャンされたラインからの蛍光強度は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール4リン酸、およびホスファチジルイノシトール4、5-ビスリン酸結合実験の距離とピクセルの関数としてプロットされます。

次いで、個々の実験からの結合データを正規化し、ホスホリパーゼCデルタ1プレクストリンホモロジードメイン濃度の関数としてプロットし、結合アイソタームに適合させ、見かけの関連定数を抽出する。見かけの関連定数の比較は、ホスホリパーゼCデルタ1プレクストリン相同性ドメインが、予想通り、ホスファチジルイノシトール4,5−ビスリン酸と特異的に相互作用することを示している。このビデオを見た後、このアッセイとPIP-on-a-chipアプローチを使用して、小さな単層小胞の作り方、マイクロ流体デバイスの作り方、これらのマイクロ流体デバイス内でのタンパク質膜結合相互作用としての支持脂質二重層の形成方法についてよく理解できるはずです。

このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順に続いて、光退色後の蛍光回復などの他の方法を実行して、脂質の側方拡散に対するタンパク質膜結合の影響を評価することができます。この技術は、一度に1つずつではなく、細胞に見られる脂質の集合体とのタンパク質膜相互作用を研究する道を開くため、このアプローチは、タンパク質膜相互作用の生化学と細胞生物学に広く影響を与えるでしょう。