Name: PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 学ぶPIP-on-a-chipアッセイによるタンパク質-ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー定量解析。マイクロ流体デバイスを用いて生体的に関連性の高い膜結合を評価し、創薬標的研究に応用可能です。

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著者は何も開示することはない。

各PIP変異体は、低濃度ではあるが、それらは独特の物理的組成およびオルガネラ膜1の機能的特異性の確立に寄与する特定の細胞小器官の細胞質表面に存在します。 PIPの最も重要な用途の一つは、特定の細胞内局在および/または活性化6,7を必要とするタンパク質の多数のための特定のドッキングプラットフォームとしてあります。細胞生理学および疾患におけるそれらの役割のために、生理学的に関連する状況において、 インビトロでタンパク質-PIP相互作用を研究する能力が重要である。本明細書に記載されたアッセイフォーマットは、極性脂質の混合物の存在下、極性頭部基および天然長の脂肪アシル鎖の正常な提示と、流体脂質二重層との関連でタンパク質-PIP相互作用を考慮することを可能にする。 このアッセイは、組み合わせてpHシステムを検出システムとして使用し、SLBをマイクロ流体プラットフォームにセットされたモデル膜システムとして使用する...

無数の相互作用および生化学プロセスは、二次元的に流体の膜表面上で起こる。真核細胞における膜封入オルガネラは、生化学プロセスおよびそれらの関連プロテオームだけでなく、それらの脂質組成においてもユニークである。例外的な種類のリン脂質の1つはホスホイノシチド（PIP）である。それらは細胞リピドームのわずか1％を占めるにもかかわらず、それらは他の1、2、3、4間の信号伝達、オートファジー、および膜輸送において重要な役割を演じます。細胞PIPキナーゼによるイノシトール頭部基のダイナミックリン酸化は、7つのPIPモノある頭部基、ビス- 、またはトリス-リン酸化5を生じます。さらに、PIPは、膜の細胞内同一性を規定し、1つまたは複数のホスホイノを含むタンパク質/酵素の特殊な膜ドッキング部位として機能するitide結合ドメイン、例えば、プレクストリン相同性（PH）、PHOX相同性（PX）、及びepsin N末端相同性（ENTH）6、7。最もよく研究PIP結合ドメインの一つは、ホスホリパーゼC（PLC）は、特に高ナノモル、低マイクロモルの範囲の親和8内ホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート（PI（4,5）P 2）と相互作用-δ1PHドメインであります、9、10、11。 種々の定性的および定量的インビトロ法が開発され、これらの相互作用の機構、熱力学および特異性を研究するために使用されている。最も一般的に使用されるPIP結合アッセイは、表面プラズモン共鳴（SPR）、等温熱量測定（ITC）、核磁気共鳴（NMR）分光法、リポソーム浮遊/沈降アッセイ、および脂質ブロット（脂肪 - ブロット/ PIP-ストリップ）12、13。これらは広範囲に利用されていますが、それらには多くの欠点があります。例えば、SPR、ITC、およびNMRは、サンプル、高価な計測機器、および/または訓練された人員12、13を大量に必要としています。そのような抗体ベースの脂質ブロットのようないくつかのアッセイ形式は、のPIPの水溶性形態を利用し、非生理的方法12、14、15、16にそれらを提示します。また、脂質ブロットは確実に定量することができないと、彼らは多くの場合、偽陽性/陰性所見12、17、18をもたらしました。これらの課題を克服し、現在のツールセットを改善するため、サポートされている脂質二重層（SLB）に基づいて新しいラベルフリーの方法が確立されました。<html>これはタンパク質-IPP相互作用の研究に成功裏に適用された（ 図1 ） 19 。 タンパク質-PIP相互作用を検出するために使用される戦略は、pH調節感知に基づく。これには、ホスファチジルエタノールアミン脂質頭部群20に直接コンジュゲートされたオルト -スルホローダミンB（ o SRB）を有するpH感受性色素が関与する。 Oの SRB-POPEのプローブ（ 図2A）は低pHで強い蛍光と7.5モル％のPI（4,5）P 2つの含有のSLB（ 図5B）内を6.7のpKaを有する高pHでクエンチします。ドメインは、PIに向かってその高い特異性タンパク質PIP結合の方法論を検証するために広く使用されてきたPLC-δ1のPH（4,5）P 2（ 図5A）、21、22、「&gt; 23、24、25 .Hence、我々は、PLC-δ1のPHドメインは、そのは、PIPオンチップアッセイを介してPI（4,5）P 2への結合を試験するために使用することができると推論した。PHドメイン構築物をこの研究において正味の正電荷（PI 8.4）を有し、したがってOHを集めて使用-イオン（ 図5C）、PI（4,5）P 2含有のSLBに結合すると、PHドメインはOHをもたらす-にイオンを今度は界面電位を変調してO SRB-POPE（ 図5C）26。PHドメイン濃度の関数として、蛍光が消光される（ 図6A）のプロトン化状態をシフト膜表面は、最後に、正規化されたデータでありますPHドメイン-PI（4,5）P 2相互作用の親和性を決定するために結合等温線に適合させた（ 図6B 、 6C ）/ p&gt; この研究では、マイクロ流体プラットフォーム内のPIP含有SLBへのタンパク質結合を行うための詳細なプロトコールが提供される。このプロトコルは、読者に、マイクロ流体デバイスおよび小胞調製物をSLB形成およびタンパク質結合に組み立てることを要する。さらに、PLC-δ1PHドメイン-PI（4,5）P 2相互作用の親和性情報を抽出するためのデータ分析のための指示が提供される。

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ:長方形フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm、No. 1 1/2;ホウケイ酸ガラス</td></tr><tr><td>7X洗浄液</td><td>MPバイオメディカルス</td><td>976670</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>PYREX結晶化皿</td><td>コーニング</td><td>3140-190</td>平<td>底のホウケイ酸ガラス皿。直径x高さ(190 x 100 mm);ディストリビューター:VWR(89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>パラゴンインダストリー</td><td>ズSC-2</td><td></td></tr>キル<tr><td>ン名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>4019862</td><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS);ディストリビューター:エルスワース接着剤</td></tr><tr><td>PYREXデシケー</td><td>ターVWR</td><td>89134-402</td><td>真空定格</td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td>ハリス</td><td>15110-10</td><td>ハリスユニコア;直径1.0ミリメートル;ミルテックス バイオプシー パンチ プランジャー付き (Cat.No. 15110-10) は、代替</td></tr><tr><td>Name</td><td><strongstrong>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma クリーニング システム</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>2 段ダイレクト ドライブ オイル真空ポンプとして使用できます。 O2サービス(Krytox有料)</td></tr><tr><td>デジタルホットプレート</td><td>ベンチマーク</td><td>H3760-H</td>デン<td>ビルサイエンティフィックを通じて購入(Cat.No. 1005640)</td></tr> <tr><td>つや消しマイクロスライド</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>つや消し、選択され、事前に洗浄されています。スイスガラス製。厚さ:1 mm;寸法:75 x 25 mm;GR 144</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>フォトマスクデザインの製図ソフトウェア</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>黒の背景と明確な特徴を持つデザインは、CAD / Art Services</td></tr><tr><td>Silicone Wafers</td><td>University Wafers</td><td>1575</td><td>Prime Grade、片面研磨、直径100 mm(4インチ)、厚さ525 um</td></tr>の<tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td>によって、透明なマスク(5 x 7インチ)に20k dpiの解像度で印刷されました。<td>N / A</td><td>ネガトーンフォトレジスト;ペンシルベニア州立大学ナノファブリケーション施設プロパティ</td></tr><tr><td>SU-8開発者</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>ペンシルベニア州立ナノファブリケーション施設 Property</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルイノシトール-4-リン酸</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alpha;-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスフェート</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td>POPE;oSRB-POPE</td></tr><tr><td>リサミンローダミン B 塩化スルホニル (混合異性体)</td> の合成に必要<td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>oSRB-POPE</td></tr><tr><td>pH 感受性蛍光脂質プローブ (oSRB-POPE)</td> の合成に必要<td>In-house</td><td>N/A</td><td>In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Glass Scintillation Vial</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>20 mL 容量</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N / A</td><td>超音波ウォーターバス</td></tr><tr><td>核孔トラックエッチング膜Whatman</td><td></td><td>110605</td><td>ポリカーボネート膜;直径:25 mm;細孔サイズ:0.1 um;ディストリビューター: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>HPLC グレード</td></tr><tr><td>LIPEX 押出機</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL サーモバレル押出機</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>動的光散乱;ペンシルベニア州立大学X線結晶学施設 プロパティ</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v.6</td><td>データ分析用のカーブフィッティングソフトウェア</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M 落射蛍光顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>N/A</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>AxioCam MRm カメラ</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>N/A</td><td>カメラ</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>光源</td></tr><tr><td>Alexa 568 フィルターセット</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A 画像処理ソフトウェア N/A</td><td>画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>名名</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>その他Tips</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>200 uL ピペットチップ;タンパク質溶液をマイクロ流体チャネルに適用するための薄くて滑らかなチップ</td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 uL ピペットチップ;小胞溶液をマイクロ流体チャネルに適用するための薄くて滑らかな先端</td></tr><tr><td>Orion Star A321 pHメーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA3210</td><td>pHメーター</td></tr><tr><td>Orion マイクロ pH プローブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>マイクロ pH プローブ</td></tr><tr><td>N-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES、遊離酸塩化</td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>連合線&ケーブル</td><td>TFT-200-24 N</td><td>内径:0.020-0.026インチ(0.051-0.066 cm);壁の厚さ:0.010インチ(0.025 cm);柔軟なポリテトラフルオロエチレン薄肉チューブ。ナチュラルカラー</td></tr><tr><td>窒素ガス - 工業用</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>ローカルプロバイダー</td></tr><tr><td>酸素ガス - 工業用</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>ローカルプロバイダー</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>ローカルプロバイダー</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

数多くの細胞タンパク質が膜表面と相互作用して必須の細胞プロセスに影響を与えます。これらの相互作用は、ホスホイノシチド（PIP）の場合のように、特定の細胞内局在および/または活性化を確実にするために、膜内の特定の脂質成分に向けられ得る。 PIPおよび細胞PIP結合ドメインは、細胞生理学におけるそれらの役割をよりよく理解するために広範に研究されている。本発明者らは、タンパク質-IPP相互作用を研究するためのツールとして、支持された脂質二重層（SLB）上にpHモジュレーションアッセイを適用した。これらの研究では、pH感受性オルソ -スルホローダミンB結合ホスファチジルエタノールアミンを用いてタンパク質-PIP相互作用を検出する。タンパク質がPIP含有膜表面に結合すると、界面電位が調節され（ すなわち 、局所pHの変化）、プローブのプロトン化状態がシフトする。 pH調節アッセイの成功した使用の事例研究は、ホスホリパーゼC delta1 Pleckstr相同性（PLC-δ1PH）ドメインおよびホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート（PI（4,5）P 2 ）相互作用を例として示す。この相互作用の見かけの解離定数（ K d、app ）は、他のものによって得られたK d、app値と同様に、0.39±0.05μMであった。以前に観察されたように、PLC-δ1PHドメインはPI（4,5）P 2特異的であり、ホスファチジルイノシトール4-リン酸に対するより弱い結合を示し、純粋なホスファチジルコリンSLBへの結合は示されない。 PIP-on-a-chipアッセイは、従来のPIP結合アッセイよりも有利であるが、これには、限定されるものではないが、サンプル量が少なく、リガンド/レセプターの標識化要件がないこと、小型および低親和性膜相互作用大分子、および改善された信号対雑音比。したがって、PIP-on-a-chipアプローチの使用は、広範囲の膜相互作用のメカニズムの解明を容易にするであろう。さらに、この方法は潜在的にu膜と相互作用するタンパク質の能力を調節する治療薬を同定することには魅力的である。

我々はPIP-on-a-chipマイクロデバイス（ 図1 ）内のPLC-δ1PHドメイン-PI（4,5）P 2相互作用を研究するためにpH調節アッセイを使用した。詳細なプロトコールを通して、マイクロ流体デバイスコンポーネントの準備と組み立て、小型ユニラメラベシクル（SUV）の作成（ 図2 ）、デバイス内でのSLBの作成（ 図3 ）、PIP含有SLBへのタンパク質結合のテスト方法を示しました。典型的なSLB結合実験のフローチャートを図4に示す 。 pH調節アッセイの原理を、例としてPHドメイン-PI（4,5）P 2結合を用いて図5に示す。この研究から得られた結果は、PHドメイン...

ここでは、pH調節に基づく無標識法を用いてタンパク質 - ホスホイノシチド相互作用を研究するためのマイクロ流体プラットフォームの文脈で、支持された脂質二重層を提示する。

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

PIP-on-a-chipアッセイの全体的な目標は、定量的なラベルフリーの方法でタンパク質膜相互作用を評価することです。タンパク質膜の相互作用は、細胞とその病原体の非常に多くのプロセスの中心ですが、これらの相互作用を研究する技術はほとんどありません。この技術の利点は、単純体積が少なく、リガンドや受容体の標識要件がないこと、および生理学的に適切な方法で膜相互作用を試験できることです。ウイルスの多くの治療標的は膜タンパク質であり、これらの標的タンパク質の研究はしばしば界面活性剤を用いた溶液中で行われる。私たちの技術は、より生物学的に関連性のある代替手段を提供します。このアッセイは、タンパク質と膜との相互作用をモニタリングできることがわかりますが、実際には非常に汎用性の高いアッセイであり、鉄膜、低分子膜、さらにはペプチド膜の相互作用をモニタリングするために使用できます。まず、ポリジメチルシロキサンまたはPDMSプレポリマーと硬化剤を10:1の比率で、大型のプラスチック製計量ボートで混合します。混合物を真空中で1時間、真空強度500tor以下で脱気します。同じSU8マイクロパターンの複数の複製を含むシリコンマスターを大きなプラスチック計量ボートに置き、脱気PDMSを注ぎ、60°Cのドライオーブンで一晩硬化させます。翌日、シリコンマスターからPDMSを手でそっと剥がします。各マイクロパターンの境界を長方形でマークするには、外科用メスと定規を使用します。次に、PDMSをブロックに切断し、各マイクロチャネルの両端に生検パンチで16個の穴を開けて、直径1.0ミリメートルの穴を開けます。ピペットは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール4、5-ビスリン酸、およびpH感受性蛍光プローブの体積を1つの20ミリリットルガラス換気バイアルに計算しました。混合物を化学ヒュームフード内の窒素ガスの流れで10分間、または溶媒が蒸発してバイアルの底に薄い脂質膜が形成されるまで乾燥させます。次に、混合物を真空下で10ミリターの真空強度で少なくとも3時間乾燥させ、残留有機溶媒を除去します。乾燥した脂質フィルムを5ミリリットルのランニングバッファーで再水和し、再水和した脂質を室温で30分間、動作周波数35キロヘルツの超音波浴に入れます。小胞懸濁液を液体窒素と摂氏40度の水浴で凍結融解して、単層小胞を取得します。凍結融解を10回繰り返し、小胞懸濁液を0.1ミクロンのトラックエッジポリカーボネート膜に押し出し、脂質押出機を使用して小さな単層小胞を濃縮します。押し出しを10回繰り返します。水洗浄ボトルを使用して穴から脱イオン水を噴射し、PDMSブロックの入口と出口に詰まりがないかテストし、PDMSブロックを窒素ガスで乾燥させます。次に、PDMSブロックと事前に洗浄したカバースリップを酸素プラズマシステムのサンプルチャンバー内に置きます。PDMSブロックとカバースリップを酸素プラズマで45秒間露出させ、電力設定を75ワット、酸素流速を毎分10立方センチメートル、真空強度を200ミリターに設定します。次に、酸素プラズマ処理直後のカバースリップとの接触にPDMSブロックのパターン面を配置します。軽く押して、接触部の気泡を取り除きます。デバイスを摂氏100度の水平なホットプレートに3分間置き、接着を強化します。100%エタノールを含む濡れた糸くずの出ないワイプを使用して、デバイスの上部と下部からほこりの粒子を取り除きます。次に、ガラス製の顕微鏡スライドの上にデバイスをテープで貼り付けます。100マイクロリットルのホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート含有小胞を0.65ミリリットルの微量遠心チューブに移します。6.4マイクロリットルの0.2正常塩酸を追加して、溶液のpHを約3/2に調整します。pH調整された小さな単層小胞溶液の10マイクロリットルを入口から各チャネルにピペットで固定し、溶液が出口に到達するまでピペットで圧力をかけます。チップをピペットから取り外し、デバイスに接続したままにします。各チャネルについてこの手順を繰り返した後、室温で10分間デバイスをインキュベートし、デバイスアセンブリの直後にマイクロチャネルへの小胞の注入を行う必要があります。一方、インレットチューブとアウトレットチューブのセットをピンセットでカットし、アウトレットチューブセットをデバイスに接続し、デバイスを顕微鏡ステージにテープで固定します。インレットチューブセットの一端を円錐形のチューブに含まれる25ミリリットルのランニングバッファーに沈め、テープで固定されていることを確認します。ラボジャッキを使用して、コニカルチューブをデバイスよりも高い地面に置き、重力流を介して溶液をマイクロチャネルに押し込みます。インレットチューブごとに、シリンジを使用して、チューブの自由端から1ミリリットルのランニングバッファーを引き出します。ピペットチップをインレットから取り外し、インレットチューブの自由端をデバイスに挿入します。このプロセスを繰り返して、すべてのインレットチューブピースをデバイスに接続します。チャネルに流れるランニングバッファーは、破裂していない余分な小胞を除去し、二重層を実験条件に平衡化するのに役立ちます。次に、顕微鏡制御ソフトウェアを開きます。左側のパネルで、顕微鏡タブをクリックし、10倍対物レンズを選択します。ライブをクリックしてから、ツールバーのAlexa 568画像アイコンをクリックし、微調整ノブと粗調整ノブを使用して、マイクロチャネルに焦点を合わせます。デバイスをスキャンして、SLBとチャネルの品質を確認します。次に、ツールバーのFLシャッター閉じ画像アイコンをクリックし、取得タブをクリックして、基本調整の下で露光時間を選択します。露光時間を 200 ミリ秒に設定します。左側のパネルで、多次元集録をクリックします。フィルターメニューで、赤いチャンネルを選択します。次に、タイムラプスメニューをクリックし、時間間隔を5分、期間を30分、ラプスメニューを設定します。測定タブで円ツールを選択し、任意のチャネルに円を描きます。円を選択した状態で右クリックし、プロパティを選択します。プロファイルタブで、すべてのTをチェックして、蛍光強度を時間の関数として表示します。次のステップに進む前に、この曲線が平衡を示すプラトーに達していることを確認してから、バッファー溶液をデバイスと同じ地面に下げて流れを停止します。一度に1つずつ、各出口チューブを取り外し、ピペットを使用して各タンパク質希釈液の200マイクロリットルを出口チャネルに適用します。圧力をかけず、重力に任せてください。チップをピペットから取り外し、マイクロ流体デバイスに取り付けたままにします。チャネルごとにこのプロセスを繰り返し、このプロセス中に気泡がチャネルに導入されないようにします。次に、インレットチューブをマイクロ流体デバイスの下の地面まで下げて、マイクロチャネルを介してタンパク質の流れを開始します。チューブの自由端を廃棄物容器にテープで固定します。プレクストリンホモロジードメインの希釈液を30分間流します。ソフトウェアの左側のパネルにある[タイムラプス]タブで、[開始]をクリックして、イメージングを再開します。ここに示されているのは、マイクロチャネル内のSLBを含むホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェートの代表的な図です。プレクストリンホモロジードメインを指示された濃度で追加する前と後で。マイクロチャンネル全体でスキャンされたラインからの蛍光強度は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール4リン酸、およびホスファチジルイノシトール4、5-ビスリン酸結合実験の距離とピクセルの関数としてプロットされます。次いで、個々の実験からの結合データを正規化し、ホスホリパーゼCデルタ1プレクストリンホモロジードメイン濃度の関数としてプロットし、結合アイソタームに適合させ、見かけの関連定数を抽出する。見かけの関連定数の比較は、ホスホリパーゼCデルタ1プレクストリン相同性ドメインが、予想通り、ホスファチジルイノシトール4,5−ビスリン酸と特異的に相互作用することを示している。このビデオを見た後、このアッセイとPIP-on-a-chipアプローチを使用して、小さな単層小胞の作り方、マイクロ流体デバイスの作り方、これらのマイクロ流体デバイス内でのタンパク質膜結合相互作用としての支持脂質二重層の形成方法についてよく理解できるはずです。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で完了します。この手順に続いて、光退色後の蛍光回復などの他の方法を実行して、脂質の側方拡散に対するタンパク質膜結合の影響を評価することができます。この技術は、一度に1つずつではなく、細胞に見られる脂質の集合体とのタンパク質膜相互作用を研究する道を開くため、このアプローチは、タンパク質膜相互作用の生化学と細胞生物学に広く影響を与えるでしょう。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、マイクロ流体プラットフォームと呼ばれる担持脂質二重膜のホスファチジルエタノールアミン脂質にタグ付けされたpH感受性蛍光色素を使用して、pH調節アッセイを使用して、マイクロ流体パターンでのタンパク質-ホスホイノシチド相互作用を示しています。タンパク質がリン脂質に結合した後のpHの調節は、蛍光消光を引き起こします。...

タンパク質-ホスホイノシチド相互作用を検出するための担持脂質二重膜のpH調節アッセイ

ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。...

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。...

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

ここのプロトコルでは、小分子脂質リガンド ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) と精製 hEAG1 イオン チャネル蛋白質の相互作用について説明します。測定は、バリでした小分子イオン チャネル...

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。...

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸...

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

リンタンパク質ホスファターゼとそのインターアクターを同定するための質量分析ベースのアプローチ

外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。...

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

ラマン分光法は、生きた細胞、組織工学の構造とネイティブの組織の非接触、ラベルフリー解析に適した手法です。ソース固有のスペクトル指紋が生成され、多変量解析を用いて分析することができます。...

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

学ぶPIP-on-a-chipアッセイによるタンパク質-ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー定量解析。マイクロ流体デバイスを用いて生体的に関連性の高い膜結合を評価し、創薬標的研究に応用可能です。

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

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